專利名稱：需氧微生物發(fā)酵過程控制菌體代謝節(jié)律的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種需氧微生物的培養(yǎng)方法，這個方法是把發(fā)酵罐內(nèi)的Fed-Batch過程看作一個時空混沌體系，在線控制其中的非線性變量，使生物活體的酶促生化反應(yīng)在節(jié)律狀態(tài)下完成。
在生化工業(yè)里典型的菌體培養(yǎng)程序是先在一個種子發(fā)酵罐中(體積大約2M3)進(jìn)行種子培育，種子培養(yǎng)基輸送到種子罐中煮沸消毒后，把經(jīng)過無菌培養(yǎng)過的微生物細(xì)胞(菌株)接進(jìn)罐讓它生長，經(jīng)過一定時間(大約16小時)當(dāng)細(xì)胞數(shù)目表明微生物是處于對數(shù)生長期時就被輸送到主發(fā)酵設(shè)備開始發(fā)酵培養(yǎng)和獲取產(chǎn)物，現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于監(jiān)測和控制都是針對主發(fā)酵設(shè)備里的發(fā)酵生化過程。
主發(fā)酵過程一般分為三個階段，發(fā)酵前期是長菌階段，發(fā)酵中期和后期是產(chǎn)物積累和排泄階段也就是菌體的代謝過程。在需氧微生物的培養(yǎng)過程中，及時準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)溫度、pH、通風(fēng)量和流加氮源，碳源，可以控制菌體繁殖、底物消耗速率，提高產(chǎn)物形成速率。迄今為止大多數(shù)發(fā)酵工業(yè)仍采用每幾個小時從發(fā)酵罐內(nèi)取出樣品，離線進(jìn)行生化分析，測定菌體濃度、碳源濃度和產(chǎn)物濃度，以便采取相應(yīng)操作進(jìn)行過程控制。
歐洲專利EP0661380A2“需氧微生物培養(yǎng)的方法和設(shè)備”所介紹的現(xiàn)有技術(shù)包括方法和設(shè)備，其方法是開發(fā)一種在線測量發(fā)酵液里的菌體濃度、碳源濃度和產(chǎn)物濃度以及氨離子濃度的方法，根據(jù)這些測量值去計算流加速率。定量控制發(fā)酵液的碳源濃度和氨離子濃度，使需氧微生物在Fed-Batch培養(yǎng)過程中保持微生物菌的適當(dāng)生長。實施這個方法的設(shè)備包括一臺近紅外分光光度計和與此儀器相接的計算機以及與計算機相接的控制部件包括溫度、pH、流加碳源、罐壓和通風(fēng)。計算機及其控制部件組成一個在線系統(tǒng)。每10分鐘自動取一次發(fā)酵液，由近紅外分光光度計進(jìn)行在線分析。在線分析的方法是根據(jù)校正曲線所提供的經(jīng)驗數(shù)據(jù)計算碳源濃度＝32.36+0.900×1295.2×(F-1019.0×F-165.7×F+848.3×F)谷氨酸濃度＝-4.064+1.079×(-383.2×F+1233.0×F+122.9×F-998.5×F)菌體濃度＝-1.570+0.321×(-100.1×F+71.18×F+53.83×F氨離子濃度＝-2.817+0.856×(-846.5×F+878.6×F-15.8×F)根據(jù)在線分析的結(jié)果確定流加碳源速率1.當(dāng)分析結(jié)果＞SV+0.2流加速率＝0.8×C源消耗速率2.SV+0.2≥分析結(jié)果＞SV+0.1 流加速率＝0.9×C3.分析結(jié)果＝SV 流加速率＝1×C4.SV-0.1＞分析結(jié)果≥SV-0.2 流加速率＝1.1×C5.SV-0.2＞分析結(jié)果 流加速率＝1.2×C近紅外分光光度計的分析結(jié)果輸入計算機，計算機按照上述方法計算流加速率，其中SV表示每10分鐘大致耗掉多少碳源(這是人為確定的設(shè)定值)，碳源消耗速率C是指十分鐘前與十分鐘時的碳濃度差與時間之比，五種流加速率由計算機確定一種，通過控制器進(jìn)行流加。
根據(jù)上述公式計算的菌體濃度用來確定菌體生長狀態(tài)，進(jìn)行溫度控制初始溫度 第一次升溫第二次升溫31.5℃當(dāng)菌體濃度≥5.6g/l當(dāng)菌體濃度≥8.0g/l36℃ 39℃現(xiàn)有技術(shù)對pH、罐壓和通氣量基本保持在一定值，不進(jìn)行調(diào)節(jié)。
現(xiàn)有技術(shù)有以下不足之處1.現(xiàn)有技術(shù)提出的培養(yǎng)方法僅僅是用計算機代替人工取樣和輸送到近紅外分光光度計進(jìn)行分析計算，在測量發(fā)酵液里的菌體濃度和其它濃度的方法方面并沒有先進(jìn)新技術(shù)。實際上國內(nèi)早已采用遠(yuǎn)紅外分光光度計721測定菌體濃度和碳源濃度而用酶膜傳感技術(shù)測定產(chǎn)物濃度，這些都是經(jīng)典的方法。
2.現(xiàn)有技術(shù)提出的在線檢測方法是一種靜態(tài)線性系統(tǒng)定量方法，把樣品在各種波長的光照下的吸收率按照經(jīng)驗公式和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算菌體濃度，碳源濃度和產(chǎn)物濃度。事實上，微生物的培養(yǎng)過程表現(xiàn)出隨機而非線性的行為，常常不是一堆經(jīng)驗數(shù)據(jù)能夠框住的，譬如用現(xiàn)有技術(shù)檢測的菌體濃度所反映的是包括死的菌體在內(nèi)的菌體個數(shù)，不能反映菌體的真實生長發(fā)育情況，所以這種經(jīng)典的估算方法只能作為參考。
3.現(xiàn)有技術(shù)忽略了需氧微生物培養(yǎng)的最重要條件之一是氧的供給，事實上菌體的需氧情況是隨著菌的繁殖和代謝的不同階段而不同的?，F(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為pH、罐壓和通風(fēng)量基本維持在一定值而沒有通過監(jiān)測的菌體濃度改變pH和通氣量，說明現(xiàn)有技術(shù)的方法不合理。
4.現(xiàn)有技術(shù)提出的培養(yǎng)方法的重點是根據(jù)在線檢測的碳源濃度，估算碳源消耗速率，去確定碳源的流加速率。這里存在二種誤差一是近紅外分光光度計對不同碳源原材料的透光率不同產(chǎn)生的測量誤差；二是碳源消耗速率計算的累計誤差，因為碳源的消耗速率是用當(dāng)前測定的碳濃度減去前次測定的碳濃度除以時間，所以一次計算的流加速率不準(zhǔn)確，將會造成后10分鐘流加速率不準(zhǔn)確，以后每10分鐘依次類推，積累誤差，直接影響流加碳源的正確性。
5.在現(xiàn)有專利中用近紅外分光光度計在線檢測氨離子的目的是為了流加氮源，而現(xiàn)有專利又用pH電極檢測pH值其目的也是為了流加氮源，這二者以何種檢測為流加氮源的依據(jù)，因二種測試沒有關(guān)聯(lián)，而且氨離子濃度與氨基之間也沒有關(guān)聯(lián)，所以控制氨離子濃度沒有新的實用意義。
本發(fā)明提出一套新的培養(yǎng)方法，是激勵微生物菌對碳、氮、氧的攝取，促進(jìn)菌體生長發(fā)育和代謝活力，最終提高產(chǎn)量的方法。本發(fā)明方法的重要特征是在通氣培養(yǎng)過程中，控制微生物在培養(yǎng)液里的pH和排氣中的二氧化碳，使它們呈現(xiàn)反相節(jié)律狀態(tài)。所謂節(jié)律狀態(tài)，就是具有一定周期和強弱幅度變化的脈動或振蕩行為。反相節(jié)律狀態(tài)是指CO2和pH的變化周期相同，但是當(dāng)CO2上升時，pH下降，而CO2下降時，pH上升。CO2達(dá)到高峰時，pH恰處在低谷，如圖1所示。產(chǎn)生代謝節(jié)律的方法是用計算機監(jiān)測CO2和pH，并由計算機運行控制算法以實現(xiàn)各項操作的協(xié)同作用。本發(fā)明方法的技術(shù)路線如下1.根據(jù)菌體在培養(yǎng)過程中的不同階段確定CO2和pH的振蕩幅度(設(shè)定值)，當(dāng)CO2達(dá)不到設(shè)定值時，改變溫度、降低風(fēng)量、補充生物素等，使CO2上升；當(dāng)CO2達(dá)到設(shè)定值時，提高風(fēng)量、流加氮源、流加碳源等，使CO2在設(shè)定值以下周期性變化。
2.根據(jù)培養(yǎng)過程中各階段的pH調(diào)節(jié)范圍，用流加氮源來控制振蕩周期。培養(yǎng)過程中的各種操作，包括改變溫度、pH、供氧量和流加氮源、碳源等，都是用階躍或開/關(guān)方式來完成。
在這樣一種培養(yǎng)方法中，每隔1分鐘檢測一次CO2和pH，并且用實時顯示的圖形表現(xiàn)它們的動態(tài)趨勢，經(jīng)過計算機判斷氮源和碳源的消耗狀況及時定量補給。與現(xiàn)有技術(shù)的根本不同是本發(fā)明方法對培養(yǎng)過程進(jìn)行了動態(tài)的優(yōu)化控制，因為隨時可以根據(jù)CO2和pH的圖形軌跡調(diào)整操作設(shè)定值，因此培養(yǎng)過程中各種操作均能夠被定量化，使復(fù)雜的工藝能夠被簡化，背景材料中現(xiàn)有技術(shù)的所有不足之處均可避免。
本發(fā)明提出的需氧微生物培養(yǎng)方法中涉及的控制代謝節(jié)律的具體做法是建立4組控制回路，如圖2所示，其中以pH和CO2的關(guān)系為核心，通過多變量控制器把它們與流加氮源、改變通風(fēng)量、流加生物素、流加碳源結(jié)合起來進(jìn)行協(xié)同控制。這四組回路，分別介紹如下控制回路(1)流加氮源作為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過多變量控制器給定pH設(shè)定值，控制氮源流加。
控制回路(2)改變通風(fēng)量作為過程的輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器給定CO2的設(shè)定值，控制風(fēng)量。
控制回路(3)流加生物素為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器控制生物素的流加量，或者改變CO2設(shè)定值。
控制回路(4)流加碳源為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器調(diào)節(jié)碳源的間歇流加量，并調(diào)節(jié)CO2的振蕩幅度設(shè)定值。
上述四組控制回路中，回路(1)的輸入必須采用開/關(guān)閥自動執(zhí)行，其余回路(2)～(4)可以自動也可以人工操作(通?？刂苹芈?2)用人工操作)。
多變量控制器是貯存在計算機微處理器里的程序模塊，用來順序執(zhí)行預(yù)定的控制算法。在本發(fā)明方法中多變量控制器的控制算法包括以下二方面內(nèi)容1.振蕩周期的設(shè)定振蕩周期的大小與pH的調(diào)節(jié)度成正比。調(diào)節(jié)度大，振蕩周期大；調(diào)節(jié)度小，振蕩周期小。
pH控制范圍＝pH設(shè)定值±pH調(diào)節(jié)度pH調(diào)節(jié)度＝pH調(diào)節(jié)率％×(pH上量程-pH下量程)振蕩周期＝n×pH調(diào)節(jié)度 式中n＝每單位pH值下降所需的時間2.振蕩幅度的調(diào)節(jié)振蕩幅度的調(diào)節(jié)采用人工智能邏輯判斷算法，例如發(fā)酵前期約0～6小時之間，提高通氣量使CO2達(dá)到最大值；發(fā)酵中期約6～24小時之間再次提高通氣量，同時流加氮源使CO2控制在中等大小量，發(fā)酵中期主要用提高通氣量和補充生物素來調(diào)節(jié)CO2幅度。在此期間大約從16小時開始參考離線分析的底物濃度確定流加碳源，保持CO2的振幅。在發(fā)酵后期約24小時～30小時以降低通氣量控制CO2在一定值。整個培養(yǎng)過程CO2的振幅控制在大、中、小三種值。為實現(xiàn)本發(fā)明提出的方法，所用的裝置和裝置里各組成部分如圖3所示，需氧發(fā)酵過程代謝節(jié)律控制裝置的結(jié)構(gòu)包括傳感器與儀表、控制箱、計算機系統(tǒng)、驅(qū)動和執(zhí)行機構(gòu)四部分。
1.傳感器與儀表用來在線檢測發(fā)酵培養(yǎng)液里的溫度，pH和排氣CO2。
2.控制箱由多種接口卡組成，用來聯(lián)接儀表與計算機，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和產(chǎn)生控制信號。
3.計算機系統(tǒng)用來進(jìn)行監(jiān)督控制，執(zhí)行多變量控制算法，對過程進(jìn)行智能化決策，其中包括圖形顯示和報警，數(shù)據(jù)貯存和圖形數(shù)據(jù)的輸入/輸出。
4.驅(qū)動和執(zhí)行機構(gòu)，用來完成最優(yōu)節(jié)律控制下的各項操作。上述裝置的四個組成部分主要完成檢測、過程監(jiān)督和決策、控制三種功能。各部件內(nèi)部的連接和詳細(xì)作用介紹如下1.檢測本發(fā)明主要的檢測量是溫度、pH和CO2，其中溫度和pH的傳感器分別安裝在發(fā)酵罐罐體上，插到罐內(nèi)培養(yǎng)基里，傳感器輸出信號經(jīng)過變送器輸送到控制箱內(nèi)的信號調(diào)理電路，CO2的檢測是從發(fā)酵罐通氣口引出的管道經(jīng)過干燥器和過濾器輸入CO2測示儀，測出的電信號輸入控制箱內(nèi)的信號調(diào)理電路。
2.過程監(jiān)督和決策這些功能由控制箱和計算機來完成。
(1)控制箱由電源卡、通信卡、信號調(diào)理卡和模數(shù)、數(shù)模轉(zhuǎn)換、數(shù)入/數(shù)出卡組成，各卡的作用如下電源卡用來提供±12、±15V直流穩(wěn)壓電源。通信卡是計算機母線在控制箱內(nèi)的擴展，使計算機與控制箱聯(lián)接，傳送控制信號和接收從控制箱來的信號。信號調(diào)理卡接收來自于檢測儀表的信號后，經(jīng)過隔離、放大、阻抗匹配，輸送給模/數(shù)轉(zhuǎn)換卡，由計算機完成數(shù)據(jù)采集。
(2)計算機包括微處理計算器、批報數(shù)據(jù)及圖形輸出打印機、顯示器、存儲器四個主要部件，各部件的作用如下微處理計算器一方面進(jìn)行過程監(jiān)測和報警，把控制箱輸送過來的數(shù)據(jù)采集信號用圖形顯示在顯示屏幕上，便于操作人員監(jiān)視培養(yǎng)過程，當(dāng)培養(yǎng)過程出現(xiàn)異常時自動用聲光提示，便于人工干預(yù)，消除異常；另一方面依靠微處理器自動執(zhí)行控制算法(如前面提到的人工智能邏輯判斷算法)，確定各控制回路的設(shè)定值，同時發(fā)出操作指令通過控制箱的數(shù)入/數(shù)出卡去驅(qū)動執(zhí)行機構(gòu)。批報及圖形輸出打印機用來輸出每批培養(yǎng)的中間或最終技術(shù)資料。顯示器用來顯示所有圖形和數(shù)據(jù)。存儲器用來貯存技術(shù)資料檔案。
3.控制發(fā)酵過程的控制是由計算機和控制箱通過驅(qū)動器和執(zhí)行機構(gòu)來完成的，主要的功能部件包括驅(qū)動電路和執(zhí)行機構(gòu)。其中驅(qū)動電路接受來自于控制箱的控制信號，用繼電器驅(qū)動執(zhí)行機構(gòu)。執(zhí)行機構(gòu)包括流加氮源和流加碳源的二組計量器和閥門，閥門直接安裝在發(fā)酵罐頂?shù)妮斔涂谏?，計量器安裝在管道里用來定量流加量。
本發(fā)明提出的控制菌體代謝節(jié)律的方法不受微生物菌種類不同的限制，適合于任何需氧微生物的培養(yǎng)過程。用于生產(chǎn)各種氨基酸，核酸和古龍酸例如用在生產(chǎn)L-谷氨酸的培養(yǎng)過程中，對T6-13菌或F9114菌同樣有效，同樣具有激勵菌體生長和代謝活力，促進(jìn)菌體排泄功能的作用。無論是分批發(fā)酵工藝(一次投料產(chǎn)出)或是補料—分批發(fā)酵工藝(Fed-Batch)過程，本方法同樣能夠獲得提高產(chǎn)率和縮短周期的效果。本方法籍助于計算機顯示微生物呼吸和消耗氮源的動態(tài)軌跡，直接進(jìn)行自動相關(guān)控制，對離線取樣分析的菌體濃度、碳源濃度、產(chǎn)物濃度的依賴性比任何其他培養(yǎng)方法小得多，另外本發(fā)明所使用的發(fā)酵罐可以是任意規(guī)格和任何形狀，例如各種噸位的攪拌式發(fā)酵罐或是氣升式發(fā)酵罐。還有，對于所用氮源的種類沒有任何限制，例如可以是尿素、氣氨或液氨。這些都說明本發(fā)明方法特別適合于工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵過程。


圖1.CO2與pH之間的非線性對應(yīng)關(guān)系圖2.以CO2與pH為主回路的節(jié)律控制方法粗框3.需氧發(fā)酵代謝節(jié)律控制裝置的結(jié)構(gòu)總框4.在谷氨酸生產(chǎn)150M3發(fā)酵罐上的應(yīng)用實例1.和實例2.圖5.應(yīng)用實例1.和實例2.的非線性控制實時圖形圖6.應(yīng)用實例1.和實例2.的發(fā)酵狀態(tài)離線分析結(jié)果圖7.未采用本實用新型和節(jié)律控制方法的150M3發(fā)酵罐的設(shè)備比較例圖8.比較例的在線控制圖形圖9.比較例的發(fā)酵狀態(tài)離線分析結(jié)果應(yīng)用實例用控制菌體代謝節(jié)律方法發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的工業(yè)現(xiàn)場裝備配套示意圖如圖4所示1.實例一工業(yè)谷氨酸發(fā)酵，150噸規(guī)模微生物菌SF119短桿菌發(fā)酵罐 150M3攪拌罐成分 濃度培養(yǎng)基配方 淀粉水解糖 16.07％

1.1～1.2％硫酸鎂0.06～0.07％玉米漿0.43％糖 蜜0.04％氯化鉀0.1％控制條件溫度 三級 35℃～37℃～39℃罐壓 0.7MPa風(fēng)量設(shè)定 三級提風(fēng) 700→1100→1500→1800三級降風(fēng) →1600→1500→1300pH設(shè)定7.4→7.3→7.2→7.1→7.0攪拌速度 150轉(zhuǎn)/分停止發(fā)酵條件 殘?zhí)牵?.6％發(fā)酵周期30小時流加糖量3.53％培養(yǎng)方法主發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)消毒(140℃)40分鐘，冷卻后從種子罐接入SF119菌液開始培養(yǎng)，圖4所示為150M3發(fā)酵罐上裝備的發(fā)酵代謝節(jié)律控制裝置，其中在線檢測量為溫度、pH、CO2，離線檢測信號為菌體濃度，殘?zhí)菨舛群凸劝彼釢舛?。?jié)律的設(shè)定發(fā)酵前期 發(fā)酵中期 發(fā)酵后期振蕩周期(分鐘) 7.5 7.5 7.5
振蕩幅度(CO2％) 8～13 6～80～6控制回路(1)CO2與pH的回路設(shè)定值pH CO2定時(小時)7.4 8％＜CO2＜13％0＜t＜127.2 8％＜CO2＜10％12＜t＜247.1 5％＜CO2＜8％ 24＜t＜287.0 0％＜CO2＜5％ 28＜t＜306.9 30＜t＜32控制回路(2)通風(fēng)量與CO2之間的關(guān)系(用人工調(diào)節(jié)閥門)通風(fēng)量(米3/小時)CO2含量定時(小時)700 CO2＝0 t＝01100 CO2＞4％ t＜81500 4％＜CO2＜12％ t＜81800 CO2≥12％t＜81600 9％≤CO2＜12％ t＞241500 5％＜CO2＜19％ t＞241300 2％CO2＜5％ t＞24控制回路(3)本批發(fā)酵未加生物素，因為離線分析的菌體濁度6小時已經(jīng)達(dá)到凈增＞0.6g/l。同時CO2限幅達(dá)到12％，說明菌體數(shù)和發(fā)育情況良好，不用再加生物素?？刂苹芈?4)流加糖控制 殘?zhí)呛?CO2含量24.4％糖液 5.5噸 S≤3.6％ 5％＜CO2＜8％(計量罐輸出量) 4噸S≤2.6％ 5％＜CO2＜8％3噸S≤1.6％ 5％＜CO2＜8％本批發(fā)酵產(chǎn)酸率10％，轉(zhuǎn)化率60.8％，發(fā)酵周期30小時控制節(jié)律如圖5(上)所示，谷氨酸發(fā)酵過程的三種離線狀態(tài)分析結(jié)果如圖6(上)所示。2.實例二工業(yè)谷氨酸發(fā)酵，150噸規(guī)模微生物菌SF119短桿菌發(fā)酵罐 150M3攪拌罐成分 濃度培養(yǎng)基配方 淀粉水解糖 16.2％

1.1～1.2％硫酸鎂 0.06～0.07％玉米漿 0.45％糖 蜜 0.042％氯化鉀 0.1％控制條件溫度 三級 35℃～37℃～39℃罐壓 0.7MPa風(fēng)量設(shè)定 三級提風(fēng) 700→1100→1500→1800三級降風(fēng) →1600→1500→1300pH設(shè)定 7.4→7.3→7.2→7.1→7.0攪拌速度 150轉(zhuǎn)/分停止發(fā)酵條件 殘?zhí)牵?.6％發(fā)酵周期 32小時流加糖量 3.1％培養(yǎng)方法主發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)消毒(140℃)40分鐘，冷卻后從種子罐接入SF119菌液開始培養(yǎng)，圖4所示為150M3發(fā)酵罐上裝備的發(fā)酵代謝節(jié)律控制裝置，其中在線檢測量為溫度、pH、CO2，離線檢測信號為菌體濃度，殘?zhí)菨舛群凸劝彼釢舛取９?jié)律設(shè)定值發(fā)酵前期 發(fā)酵中期 發(fā)酵后期振蕩周期(分鐘) 15 1510.5振蕩幅度(CO2％) 8～13 6～8 0～6控制回路(1)CO2與pH的回路設(shè)定值pH CO2定時(小時)7.4 8％＜CO2＜13％ 0＜t＜127.2 8％＜CO2＜10％ 12＜t＜247.1 5％＜CO2＜8％ 24＜t＜287.0 0％＜CO2＜5％ 28＜t＜306.9 30＜t＜32控制回路(2)通風(fēng)量與CO2之間的關(guān)系(用人工調(diào)節(jié)閥門)通風(fēng)量(米3/小時)CO2含量 定時(小時)700 CO2＝0 t＝01100 CO2＞4％ t＜81500 4％＜CO2＜12％ t＜81800 CO2≥12％ t＜81600 9％≤CO2＜12％ t＞241500 5％＜CO2＜19％ t＞241300 2％CO2＜5％t＞24控制回路(3)本批發(fā)酵未加生物素，因為離線分析的菌體濁度6小時已經(jīng)達(dá)到凈增＞0.6kg/l。同時CO2限幅達(dá)到12％，說明菌體數(shù)和發(fā)育情況良好，不用再加生物素?？刂苹芈?4)流加糖控制殘?zhí)呛緾O2含量
24.4％糖液 5.5噸 S≤3.6％ 5％＜CO2＜8％(計量罐輸出量) 4噸S≤2.6％ 5％＜CO2＜8％3噸S≤1.6％ 5％＜CO2＜8％發(fā)酵結(jié)果產(chǎn)酸率9.21％，轉(zhuǎn)化率58％，發(fā)酵周期32小時。控制節(jié)律如圖5(下)所示，狀態(tài)分析結(jié)果如圖6(下)所示。實例2比實例1的周期長了2個小時，產(chǎn)酸率和轉(zhuǎn)化率相應(yīng)點都低一些，說明該菌株的代謝控制周期小一些較合適。3.比較例工業(yè)谷氨酸，150噸(未采用節(jié)律控制方法的150噸攪拌罐)的裝備情況如圖7所示微生物菌SF119短桿菌發(fā)酵罐 150M3攪拌罐成分 濃度培養(yǎng)基配方 淀粉水解糖 16.07％

1.1～1.2％硫酸鎂 0.06～0.07％玉米漿 0.43％糖 蜜 0.04％氯化鉀 0.1％控制條件溫度 三級35℃～37℃～39℃罐壓 0.7MPa風(fēng)量設(shè)定 三級提風(fēng)700→1100→1500→1800三級降風(fēng)→1600→1500→1300
pH設(shè)定 7.4→7.3→7.2→7.1→7.0攪拌速度150轉(zhuǎn)/分停止發(fā)酵條件殘?zhí)牵?.6％發(fā)酵周期30小時流加糖量3.53％培養(yǎng)方法主發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)消毒(140℃)40分鐘，冷卻后從種子罐接入SF119菌液開始培養(yǎng)，圖4所示為150M3發(fā)酵罐上裝備的發(fā)酵代謝節(jié)律控制裝置，其中在線檢測量為溫度、pH、CO2，離線檢測信號為菌體濃度、殘?zhí)菨舛群凸劝彼釢舛取；芈?1)根據(jù)pH值，用人工調(diào)液氨+氣氨pH 定時(小時)7.3 0＜t＜67.2 6＜t＜167.1 16＜t＜247.0 24＜t＜286.9 28＜t＜32回路(2)通風(fēng)量與CO2之間的關(guān)系(用人工調(diào)節(jié)閥門)通風(fēng)量(米3/小時) CO2含量定時(小時)700CO2＝0t＝01100CO2＞4％ t＜815004％＜CO2＜12％t＜81800CO2≥12％ t＜816009％≤CO2＜12％t＞2415005％＜CO2＜19％t＞2413002％CO2＜5％ t＞24回路(3) 本批發(fā)酵未流加生物素。
回路(4)流加糖控制殘?zhí)呛緾O2含量24.4％糖液5.5噸 S≤3.6％5％＜CO2＜8％(計量罐輸出量)3.4噸 S≤2.6％5％＜CO2＜8％2～3噸 S≤1.6％5％＜CO2＜8％本例所有各種條件與例1.例2.相仿，所不同的是沒有進(jìn)行代謝振蕩節(jié)律控制，而是根據(jù)CO2的變化趨勢調(diào)節(jié)生物素、流加糖和流加液氨的速率控制pH在適當(dāng)值，其在線控制的圖形如8所示。發(fā)酵結(jié)果如圖9所示。
產(chǎn)酸率8.6％，轉(zhuǎn)化率57％，周期32小時。經(jīng)濟效益采用微生物代謝節(jié)律控制進(jìn)行發(fā)酵過程可以獲得以下效益1.提高單位體積發(fā)酵罐的發(fā)酵強度0.1～0.2；2.使產(chǎn)酸率相對提高5～10％，轉(zhuǎn)化率相對提高5％；3.可縮短發(fā)酵周期，節(jié)約原材料和節(jié)約電、水、能量折合為平均每批次降低成本8％以上。
權(quán)利要求
1.一種需氧微生物培養(yǎng)方法其特征在于在微生物發(fā)酵過程中在線控制微生物菌體的代謝規(guī)律，使其處于節(jié)律狀態(tài)。
2.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中微生物培養(yǎng)過程的所有人工或自動操作均采用階躍或開/關(guān)方式進(jìn)行以使菌體的代謝處于一定周期和幅值的振蕩狀態(tài)。
3.按照權(quán)利要求2所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中自動操作采用計算機控制。
4.按照權(quán)利要求2所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中自動操作系統(tǒng)是由計算機系統(tǒng)、傳感器和儀表、驅(qū)動和執(zhí)行機構(gòu)四部分組成的自動監(jiān)控系統(tǒng)。
5.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中菌體代謝節(jié)律的控制方法是將CO2和PH關(guān)聯(lián)，建立時變非線性相關(guān)回路。
6.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，以控制PH和CO2為核心建立如下四組控制回路控制回路(1)流加氮源作為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過多變量控制器給定pH設(shè)定值，控制氮源流加?？刂苹芈?2)改變通風(fēng)量作為過程的輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器給定CO3的設(shè)定值，控制風(fēng)量?？刂苹芈?3)流加生物素為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器控制生物素的流加量，或者改變CO2設(shè)定值?？刂苹芈?4)流加碳源為輸入變量，pH和CO2為輸出變量，通過多變量控制器把CO2的變化反饋給輸入，由多變量控制器調(diào)節(jié)碳源的間歇流加量，并調(diào)節(jié)CO2的振蕩幅度設(shè)定值。
7.按照權(quán)利要求6所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中多變量控制器的輸入包括調(diào)整通氣量、流加生物素、流加碳源和流加氮源；多變量控制器的輸出是CO2。
8.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法使用紅外分析儀檢測CO2濃度。
9.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法使用pH電極及變送器檢測發(fā)酵液的PH值。
10.按照權(quán)利要求4所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中代謝節(jié)律監(jiān)控規(guī)則是通過實時圖形顯示的代謝軌跡而決定的。
11.按照權(quán)利要求2所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中流加氮源的方式是由計算機控制電磁閥的通/斷。
12.按照權(quán)利要求2所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中菌體的代謝振蕩幅值是通過改變通氣量、流加生物素、流加碳源和流加氮源，調(diào)整CO2的濃度。
13.按照權(quán)利要求12所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中菌體的代謝振蕩周期如下確定pH控制范圍＝pH設(shè)定值±pH調(diào)節(jié)度pH調(diào)節(jié)度＝pH調(diào)節(jié)率％×(pH上量程-pH下量程)振蕩周期＝n×pH調(diào)節(jié)度 式中n為使單位pH值下降所需的單位時間。
14.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物為氨基酸。
15.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物為核酸。
16.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物為古龍酸。
17.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中發(fā)酵罐包括各種體積規(guī)模的氣升式發(fā)酵罐和攪拌式發(fā)酵罐。
18.按照權(quán)利要求1所述的需氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中的發(fā)酵可以是分批發(fā)酵或補料—分批發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明提出一種需氧微生物發(fā)酵過程控制菌體代謝節(jié)律的培養(yǎng)方法,這個方法是把發(fā)酵過程中反映菌體代謝狀態(tài)的2個非線性時變生化變量(CO
文檔編號C12P1/00GK1177007SQ9611982
公開日1998年3月25日 申請日期1996年9月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月19日
發(fā)明者錢梓文 申請人:中國科學(xué)院化工冶金研究所