專利名稱：抗蟲融合蛋白、其編碼基因以及用該基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗蟲蛋白，其編碼基因以及用該基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法。具體地說，本發(fā)明涉及一種抗蟲融合蛋白，其編碼基因，含有該編碼基因的表達載體，含有該表達載體轉(zhuǎn)化的植物細胞，用該基因轉(zhuǎn)化的植株，以及用該基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法。
植物基因工程是近二十年來迅速發(fā)展的一門新興生物技術(shù)。其目的是將特定的外源基因引人受體植物細胞的染色體中，使受體植物的遺傳特性發(fā)生定向的永久性的變化。通過基因工程手段，可以突破種屬的界限，按照人們的預想去創(chuàng)造更加優(yōu)良的植物新品種，具有常規(guī)遺傳育種所無法比擬的優(yōu)越性。目前，植物基因工程已在植物的抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆境方面取得了重要進展，在改良作物品質(zhì)，提高作物固氮能力以及雄性不育、延熟保鮮、改變花色或花型等方面也獲得較大突破。其中，抗蟲植物基因工程是目前研究的熱點之一。它在減少殺蟲劑引起的環(huán)境污染，降低蟲害對農(nóng)作物生產(chǎn)造成的損失等方面具有巨大的應(yīng)用前景。
近年來，抗蟲植物基因工程研究取得了許多重要進展，已獲得了大量有應(yīng)用價值的抗蟲基因及其轉(zhuǎn)基因植株。在植物基因工程中使用的抗蟲基因主要有兩大類。一類是從微生物中分離出來的抗蟲基因，如蘇云桿菌毒蛋白基因，另一類是從植物本身分離出的抗蟲基因，如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、馬鈴薯蛋白酶抑制劑-II基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。不同抗蟲基因的抗蟲能力、抗蟲譜上是不一樣的。如何提高抗蟲蛋白在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的表達量，拓寬轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲譜，降低害蟲的耐受力對培育高抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植物是至關(guān)重要的。
將兩個或兩個以上抗蟲基因同時導入植物中，可以拓寬轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲譜，使昆蟲對抗蟲蛋白產(chǎn)生耐受性的幾率大為降低。一般來說，昆蟲對一種抗蟲蛋白產(chǎn)生耐受性的幾率約為10-6左右，如將兩種不同抗蟲機制的基因同時導入植物，則昆蟲產(chǎn)生耐受性的幾率降低到10-12左右。不同抗蟲機制的基因的抗蟲譜往往有很大的互補性，象豇豆胰蛋白酶抑制劑(Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI)基因與豌豆外源凝集素(P-Iectin)基因、大豆胰蛋白酶抑制劑(SKTI)基因與水稻巰基蛋白酶抑制劑(OC)基因、Bt毒蛋白基因與CpTI基因，如能聯(lián)合使用都將能產(chǎn)生很強的互補作用。如果采用分子設(shè)計的方式，在充分了解抗蟲蛋白結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，構(gòu)建出融合蛋白基因，編碼功能互補的兩個抗蟲蛋白的活性肽部分。由于這種融合蛋白同時保留有較強的兩種抗蟲蛋白的生物活性，又便于在轉(zhuǎn)化植物中進行表達調(diào)控，在抗蟲植物基因工程中將會有較大應(yīng)用前景。
抗蟲基因轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的定位可以提高抗蟲蛋白的積累水平，增強轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力。Higgin(1991，Plant Sci.，7489-98).)等人的研究結(jié)果表明，外源基因產(chǎn)物在細胞內(nèi)的定位過程與基因高水平表達或高水平積累密切相關(guān)。多肽在植物細胞內(nèi)的定位是由其氨基酸序列中特殊的靶向信號(Targetting signal)決定的，不同類型的定位信號可引導新生多肽定位到不同的細胞器。通過體外對基因進行修飾，改變編碼定位信號的核酸序列，可以人為地改變目的蛋白在細胞內(nèi)的定位方式，使其運輸并定位到特定的細胞器內(nèi)。有目的地指導新生多肽向細胞核、葉綠體、線綠體、液泡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的研究已取得了重大進展，這些成果對于解決外源蛋白的定位問題提供了重要的基礎(chǔ)(朱禎，1994，生物工程進展，14(2)51-58)。
在植物細胞中，除了葉綠體和線粒體能編碼并合成少數(shù)蛋白外，細胞內(nèi)決大部分蛋白都是由核編碼并在胞漿(Cytoplasm)或粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough EndoplasmicReticulum，rER)上合成的，然后新合成的蛋白或多肽被運送到靶細胞器位點，形成有功能的成熟蛋白。近來的研究表明，除一小部分胞漿內(nèi)游離核糖體上合成的蛋白將直接輸入到相應(yīng)的靶細胞器或繼續(xù)留在胞漿內(nèi)外，很大一部分由粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成的蛋白，將跨過ER膜進入ER腔內(nèi)，通過細胞的分泌途徑最終定位到細胞內(nèi)的特定部位或分泌到細胞外。在這些分泌蛋白N-末端(少數(shù)在中部)含有一段由特殊氨基酸殘基構(gòu)成的信號肽。這段序列通常由13-30個氨基酸殘基構(gòu)成，可分為三個組成部分(1)N-末端堿性區(qū)，至少含有一個帶正電荷的氨基酸殘基；(2)中部疏水區(qū)，含有一個由7-8個疏水氨基酸殘基組成的疏水結(jié)構(gòu)；(3)C-末端，為內(nèi)肽酶加工裂解位點(Von Heijine，1986，Nucl.Acids.Res.，144683-4690)。這段氨基酸序列對于引導多肽進入ER腔內(nèi)是必要的，同時也是充分的。不同來源的信號肽可以將作為乘客蛋白的胞漿蛋白導入到ER腔中并在那里進行相應(yīng)的糖基化修飾(Chrispeels，1991，Plant.Mol.Biol.，4221-53)。使用馬鈴薯塊莖蛋白(Patatin)的信號肽序列與GUS編碼序列組成的嵌合基因(Iturriaga et al.，1989，The Plant Cell，1381-390)以及由煙草PR蛋白(Pathogenesis-related Protein，PR)信號肽序列與GUS、Pat和Npt-II編碼序列組成的嵌合基因(Denecke，1990，The Plant Cell，251-59)轉(zhuǎn)化植物后，表達的融合蛋白產(chǎn)物均可有效的進入分泌途徑。這些信號肽沒有明顯的種屬特異性，實際上所有真核生物的分泌信號都是相似的。
多肽的糖基化修飾和高級結(jié)構(gòu)的形成部分是在ER內(nèi)完成的，進入ER的多肽在修飾后除少數(shù)滯留在ER內(nèi)，絕大部分通過運載體運輸?shù)搅烁郀柣w和反式高爾基網(wǎng)，之后或通過正常的分泌途徑分泌到細胞外，或定位到細胞的其它亞細胞結(jié)構(gòu)中。一些滯留在ER內(nèi)的蛋白具有一個共同的特征，即在多肽的C-末端含有由四個氨基酸殘基KDEL或HDEL序列組成的ER滯留信號。有報道表明，ER滯留信號對于新生多肽滯留在ER內(nèi)是必要的條件之一(Palham，1988，EMBO J.，71757-1762)。Wandelt(1992，The Plant J.，2181)等人將定位于液泡的豌豆儲藏蛋白(Vicilin)的C末端外加KDEL序列，在轉(zhuǎn)基因植物的葉肉細胞內(nèi)，重組蛋白Vicilin-KDEL大量積累在ER腔內(nèi)及其衍生的蛋白體中。通過外加KDEL序列同樣成功地將另一個液泡蛋白PHA定位到ER腔內(nèi)(Herman et al.，1990，Planta，182305-312)。已有的數(shù)據(jù)表明，絕大多數(shù)ER定位蛋白在C末端附近20個氨基酸殘基中至少含有6個酸性氨基酸殘基。推測這個靠近C末端的帶負電荷的區(qū)域同KDEL序列一起，保證了這些蛋白有效地定位于ER腔中(Munro et al.，1987，Cell，48899-907)。
本發(fā)明首次把信號肽序列、抗蟲基因和KDEL序列聯(lián)合使用，生產(chǎn)了可以定位在植物細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的外源抗蟲蛋白，與以往的抗蟲蛋白比較，此新式抗蟲蛋白的穩(wěn)定性增強了，從而提高了抗蟲蛋白在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的積累量。
研究表明，抗蟲蛋白在轉(zhuǎn)基因植株中的表達量必須達到某一特定的閾值才能表現(xiàn)出明顯的抗蟲效果。例如CpTI在轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)的表達量占可溶總蛋白的0.4％以上時，才表現(xiàn)出一定的抗蟲性，高于0.8％以上才有顯著的抗蟲效果。因此，提高抗蟲基因的表達水平一直是抗蟲植物基因研究的一個重要方面。使用強啟動子、增強子和轉(zhuǎn)譯增強序列雖可有效提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平，但高效轉(zhuǎn)錄并不一定意味著轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的高水平積累。并且，近年來的研究表明，外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄，往往容易導致基因失活(李旭剛等人，1998，生物技術(shù)通報，31-8)。在轉(zhuǎn)基因煙草細胞內(nèi)，玉米醇溶蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄量高達1-2.5％，而相應(yīng)蛋白的含量僅占總蛋白的0.00001-0.003％(Ohtani etal.，1991，Plant Mol.Biol.，16117-128)。顯然，在進行植物遺傳操作時，僅僅考慮使用強啟動子并不總是有效，且通過類似方法提高外源基因表達水平的潛力已十分有限，因此有必要開辟一條新的途徑來解決上述問題。多肽在細胞內(nèi)定位的研究進展為提高轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的積累水平提供了一條新的思路。大多數(shù)抗蟲基因的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物是在細胞質(zhì)中含成的，而胞質(zhì)中存在大量的蛋白酶，直接影響到蛋白的穩(wěn)定性。如能通過體外對基因進行修飾的方式，人為地改變蛋白在細胞內(nèi)的定位方式，將其定位到具有惰性環(huán)境的細胞器中(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、蛋白體等)，將能顯著提高抗蟲蛋白在細胞內(nèi)的積累水平，進而可培育出具有高抗蟲能力的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的目的是提供一種抗蟲融合蛋白。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種編碼抗蟲融合蛋白的基因。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種含有該編碼基因的表達載體。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種含有該表達載體的轉(zhuǎn)化的植物細胞本發(fā)明的還一個目的是提供一種用該基因轉(zhuǎn)化的植株。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用該基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法。
本發(fā)明提供了一種新式的抗蟲融合蛋白，它從N-末端到C-末端依次含有信號肽、抗蟲蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號。其中信號肽是指所有使分泌蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氨基酸序列，包括但不限于上文提到的馬鈴薯塊莖蛋白(Patatin)的信號肽序列，PR蛋白信號肽序列及大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(SKTI)的信號肽；抗蟲蛋白包括但不限于Bt毒蛋白、CpTI等抗蟲蛋白，還可以包括由兩個或多個抗蟲基因融合的多價抗蟲蛋白；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號可以使抗蟲蛋白定位在植物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，它包括但不限于KDEL、HDEL等使分泌蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一種編碼抗蟲融合蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明涉及的核苷酸序列是在抗蟲基因編碼區(qū)的5’端帶有信號肽的編碼序列，3’端帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號的編碼序列。其中信號肽的編碼序列是指所有使分泌蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多肽的編碼序列，包括但不限于上文提到的馬鈴薯決莖蛋白(Patatin)的信號肽，PR蛋白信號肽及大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(SKTI)的信號肽的編碼序列；抗蟲基因包括但不限于Bt毒蛋白、CpTI等抗蟲基因，還可以包括由兩個或多個抗蟲基因構(gòu)成的融合抗蟲基因；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號的編碼序列包括但不限于KDEL、HDEL等使分泌蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的多肽的編碼序列。
本發(fā)明還提供了一種包含抗蟲融合蛋白基因序列的表達載體。本發(fā)明涉及的載體指包含此融合抗蟲基因的載體。載體可以是細菌質(zhì)粒載體，植物轉(zhuǎn)化載體及其它不同形式的載體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該知道，外源基因在植物體內(nèi)的表達可以由不同的啟動子來驅(qū)動，且單子葉、雙子葉中表達外源基因一般采用不同的啟動子。本發(fā)明涉及的植物轉(zhuǎn)化載體可用花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、棉化曲葉病毒(CLCuV)復制酶基因啟動子(PRP)、水稻actin啟動子，T-DNA mas啟動子、玉米ubiquitin啟動子及不同啟動子之間或啟動子和調(diào)控序列構(gòu)成的復合啟動子(包括但不限于)來控制外源基因的表達。
多價基因在轉(zhuǎn)基因植物中可以表達出多個外源蛋白產(chǎn)物。為提高轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力，拓寬抗蟲譜，減緩昆蟲產(chǎn)生耐受性的目的，本發(fā)明用此抗蟲融合基因可以與其它抗蟲基因，包括但不限于Bt毒蛋白、CpTI、GNA及P-lectin(包括但不限于)等基因構(gòu)建一系列多價抗蟲基因載體。
本發(fā)明還提供了一種含有該表達載體的轉(zhuǎn)化的植物細胞以及一種用所述的抗蟲融合蛋白基因轉(zhuǎn)化的植株。
本發(fā)明涉及的細胞包括但不限于細菌，根癌農(nóng)桿菌，植物細胞。植物細胞可以是雙子葉植物細胞或單子葉植物細胞，包括但不限于煙草、棉花、楊樹、馬鈴薯、甘薯、水稻、玉米、小麥、白菜、青椒、甘藍等植物細胞及含有此類細胞的完整的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株可由許多對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說非常熟知的轉(zhuǎn)化技術(shù)，包括但不限于基因槍轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化等獲得。
本發(fā)明還提供了一種用抗蟲融合蛋白基因生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法。該方法包括a.將抗蟲基因編碼區(qū)的5’端與信號肽的編碼序列相連，3’端與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號的編碼序列相連，構(gòu)建成融合基因；b.將得到的融合基因轉(zhuǎn)化到植物細胞中；c.將得到的轉(zhuǎn)化的植物細胞培養(yǎng)成植株。
本發(fā)明可以通過提高外源抗蟲蛋白在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的積累水平來增強轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力。ELISA檢測結(jié)果表明含有修飾融合基因的轉(zhuǎn)基因煙草CpTI含量較對照有明顯提高，并表現(xiàn)出良好的抗蟲效果。修飾后I型Bt毒蛋白基因CryIA(c)基因的表達量與未修飾的CryIA(c)基因相比有顯著提高，其轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物占可溶性總蛋白的百分含量平均是末修飾CryIA(c)基因的2.4倍，最高可達0.3％。
附圖簡要說明附

圖1三引物PCR(TP-PCR)原理圖。根據(jù)兩個基因的序列，設(shè)計三條引物，利用中間引物的橋梁作用，把兩個基因的編碼序列融合在一起，形成融合基因。
附圖2TP-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜其中AλDNA/HindlllMarker；BPCR擴增產(chǎn)物(三引物)；CPCR擴增產(chǎn)物(未加P1引物)；DPCR擴增產(chǎn)物(未加P3引物)EPCR擴增產(chǎn)物(未加P2引物)FPCR擴增產(chǎn)物(未加模板質(zhì)粒)。
附圖3質(zhì)粒pSBK構(gòu)建過程?？寺≥d體質(zhì)粒是pUC19，DNA片段為TP-PCR產(chǎn)物。Signal指信號肽編碼序列，KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號編碼序列。
附圖4修飾后CryIA(c)基因的序列及其氨基酸序列。劃線部分分別是5’端引物，中間引物和3’端引物。
附圖5質(zhì)粒pΩSBK構(gòu)建過程圖。修飾的抗蟲基因CryIA(C)帶上了CaMV35S啟動子和nos終止子。
附圖6pBinΩSBK構(gòu)建過程圖。pBinΩSBK可以用來轉(zhuǎn)化植物。啟動子是CaMV35S，終止子是nos。植物選擇標記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)譯酶基因。細菌選擇標記是卡那霉素。
附圖7ELISA法檢測Bt毒蛋白標準曲線附圖8Bradford法檢測樣品總蛋白的標準曲線。
附圖9轉(zhuǎn)基因煙草的Bt毒蛋白含量比較。
附圖10轉(zhuǎn)基因煙草的Bt毒蛋白平均含量此較。
附圖11修飾的CpTI基因擴增電泳圖譜。AΦ×17R/Haelll Marker引物)；BPCR擴增產(chǎn)物(未加3端’引物)；DPCR擴增產(chǎn)物(三引物)，最亮的帶(箭頭所指)為目的帶SCK片段。
附圖12質(zhì)粒pBSCK構(gòu)建過程圖?？寺≥d體質(zhì)粒是pBluescriptKS(+)，DNA片段為SCK。
附圖13修飾的CpTI基因SCK序列及對應(yīng)的氨基酸序列。劃線部分是引物序列。
附圖14質(zhì)粒pBinΩSCK圖譜。抗蟲基因是修飾的CpTI，啟動子是CaMV35S啟動子，終止子是nos。植物選擇標記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，細菌選擇標記是卡那霉素。
附圖15ELISA檢測轉(zhuǎn)基因煙草植株CpTI含量柱型圖。
附圖16修飾的CpTI基因轉(zhuǎn)化植株的抗蟲情況(接蟲8天后)。
附圖17棉鈴蟲取食轉(zhuǎn)化煙草后受抑制狀況，放在轉(zhuǎn)化煙草(左)及非轉(zhuǎn)化煙草(右)上8天后的棉鈴蟲。
附圖18ELISA方法測定轉(zhuǎn)基因煙草中Bt毒蛋白、CpTI含量。前面一排是Bt毒蛋白含量柱型圖，后面一排是CpTI含量柱型圖。
附圖19質(zhì)粒pUSCK-Hyg圖譜?？瓜x基因是修飾的CpTI，啟動子是玉米ubiquitin基因啟動子，終止子是nos。植物選擇標記基因是湖霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。細菌選擇標記是卡那霉素。
附圖20轉(zhuǎn)SCK基因水稻CpTI活性柱型圖。
附圖21轉(zhuǎn)基因水稻T0在自然狀態(tài)下經(jīng)受大螟(Sesamia inferens)和水稻二化螟(Chilo suppressalis)的攻擊(未防治)，表現(xiàn)了顯著的抗性(左)，而對照(右)受到嚴重損害。
附圖22轉(zhuǎn)基因水稻后代對大螟(Sesamia inferens)的抗性。生長初期，轉(zhuǎn)基因水稻對自然發(fā)生的大螟有顯著抗性(上圖)，而對照非轉(zhuǎn)基因水稻受到嚴重損害(下圖)。
附圖23轉(zhuǎn)基因棉花PCR-Southern結(jié)果。ApBinΩSCK質(zhì)粒DNA作為陽性對照；B未轉(zhuǎn)化植株作為陰性對照；C～G轉(zhuǎn)化植株樣品。
附圖24在1/2MS(Km 50mg/l)對照(左)四周后變黃變白直至死亡；轉(zhuǎn)化芽(右)生根形成完整植株。
附圖25轉(zhuǎn)SCK基因的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測。ApGEM-Tzf/Haelll Marker；B陽性對照質(zhì)粒；C陰性對照植株；D-F轉(zhuǎn)植株。
實施例1首先利用本實驗室發(fā)明的TP-PCR技術(shù)，其原理是設(shè)計三條引物，使兩個基因形成一個融合基因，編碼序列在同一個讀碼框下，原理大致見附圖1。利用此方法，對CryIA(c)基因進行了改造，使其編碼產(chǎn)物具有SKTI信號肽-CryIA(c)-KDEL(SBK)的結(jié)構(gòu)。
通過體外DNA重組，獲得了含有CaMV35S啟動子-SBK-Nos終止子表達盒的中間質(zhì)粒。將此表達偪插入mini-Ti質(zhì)粒pBin19中，由此得到了植物表達載體pBinΩSBK，并以含有未經(jīng)修飾的CryIA(c)基因的植物表達載體pBinΩBC作為對照，通過根農(nóng)桿菌介導法分別轉(zhuǎn)化煙草。ELISA檢測表明在轉(zhuǎn)基因煙草中，修飾CryIA(c)基因的表達量顯著高于未修飾的CryIA(c)基因的表達量，其轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物占可溶性總蛋白的百分含量平均是未修飾CryIA(c)基因的2.4倍，最高可達0.28％。下文將說明基因修飾，載體構(gòu)建，植物轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的檢測過程。
CryIA(c)基因的修飾與克隆參照CryIA(c)基因編碼序列、SKTI基因編碼序列以及KDEL信號序列設(shè)計了三條引物，利用TP-PCR方法進行擴增，擴增出的片段具有編碼SKTI信號肽-CryI(c)-KDEL序列的結(jié)構(gòu)。設(shè)計引物P1GCGAATTCATGAAGAGCACCATCTTCTT；P2GTTGATGTTTGGGTTGTTGTCCATGAAATCAGCGATGGCTGAAGGTAGGT；P3GTTACAGTTCATCCTTCCATGGTTCATCTTCAGCCTCGAGTGTTGCAGT，5’端引物P1長28mer，其中20個堿基與SKTI信號肽序列互補；中間引物P2長50mer，其中26個堿基與SKTI信號肽序列互補，另24個堿基與CryIA(c)5’端編碼序列互補；3’端引物P3長49mer，其中21個堿基與CryIA(c)3’端編碼序列互補，另有兩個酸性氨基酸編碼序列、一個NcoI酶切位點及KDEL編碼序列。鑒于待擴增基因片段較長(1962bp)，故采用Boehringer Mannheim公司的ExpandTMHigh Fidelity PCR System擴增基因。該系統(tǒng)的特點是其酶系由Tap和Pwo DNA聚合酶混合而成，無論游離型或是以基因組DNA為模板，這種有效的酶系都能保證擴增產(chǎn)物的高產(chǎn)量，高保真度和高特異性，而且特別適合于擴增長片段。與單獨的Tap酶系相比較，Expand系統(tǒng)的錯配低30倍(見附圖2)。
修飾后的CryIA(c)基因的克隆PCR反應(yīng)結(jié)束后，加入Klenow酶，37℃保溫30分鐘，用WizardTMPCR回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，平端插入克隆載體pUC19的SmaI位點。電激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，在涂有X-gal和IPTG的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑選白色菌落在LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，質(zhì)粒的提取采用煮沸法(Berghammer，1993，Biotechniques，52711-16)和堿裂解法(Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning)。限制性內(nèi)切酶分析(Sambrook et al.，1989，MolecularCloning)鑒定出方向，得到反向插入的pSBK(見附圖3)。
修飾后CryIA(c)基因的部分序列分析含質(zhì)粒pSBK的E.coli DH5α單菌落接種于25mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，用WizardTM質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，交由上海皓嘉公司進行測序。測序結(jié)果顯示，基因5’端的500bp和基因3’端的400bp完全與預期序列相一致，編碼27個氨基酸的SKTI信號肽序列成功地融合在CryIA(c)基因的5’端，兩個酸性氨基酸及KDEL的編碼序列成功地添加在CryIA(c)基因的3’端。
修飾后CryIA(c)基因的片段替換為了保證修飾后CryIA(c)基因編碼序列的正確性，避免在PCR過程中可能產(chǎn)生的突變，我們選擇了用原CryIA(c)基因編碼序列的中間區(qū)段酶切替換PCR產(chǎn)物的相同區(qū)段的方法。這一中間區(qū)段長達1675bp，其兩端均已在測序范圍之內(nèi)，從而保證了修飾后基因的編碼序列與預期序列完全一致。修飾和替換后的CryIA(c)基因被命名為SBTK，核苷酸序列見附圖4。
植物表達載體的構(gòu)建選擇pBPFΩ7作為修飾后CryIA(c)基因的植物表達中間載體，其上帶有CaMV35S啟動子和nos終止子；選擇pBin19(David et al.，1995，PlantMolecular Biology，27405-409)作為修飾后CryIA(c)基因的植物表達載體，其上帶有來源于Ti質(zhì)粒的T-DNA邊界序列RB和LB，在邊界序列之間帶有植物選擇標記NptII及MCS序列。pΩSBK為植物表達中間質(zhì)粒，pBinΩSBK為植物表達質(zhì)粒(見附圖5、6)。
根農(nóng)桿菌LBA4404的轉(zhuǎn)化使用BIO-RAD公司的電激儀，感受態(tài)的制備和電激方法參照產(chǎn)品說明書進行，在YEB(Rif25，Km50)平板上28℃暗培養(yǎng)2天后即有轉(zhuǎn)化菌落長出，進一步從轉(zhuǎn)化菌中提取質(zhì)粒予以鑒定。
煙草轉(zhuǎn)化苗的獲得將含植物表達載體的根農(nóng)桿菌LBA4404接種20ml YEB培養(yǎng)基(Km50，Ref50)28℃培養(yǎng)過夜，按2％轉(zhuǎn)接至無抗生素YEB培養(yǎng)基(乙酰丁香酮0.2％)中繼續(xù)培養(yǎng)3小時，菌液用MS培養(yǎng)基適當稀釋用于植物轉(zhuǎn)化。
采用葉盤法(Horsch，1985，Methods in Enzymology，118627-641)轉(zhuǎn)化煙草，將含有質(zhì)粒pBinΩSBK和pBinΩBC的根農(nóng)桿菌LBA4404分別轉(zhuǎn)化煙草，其中pBinΩBC為未修飾的CryIA(c)基因的植物表達載體，以作為對照。轉(zhuǎn)化兩周后，未轉(zhuǎn)化對照逐漸變黃、變白，而轉(zhuǎn)化的葉片周緣則長出了小芽。再過一個月，未轉(zhuǎn)化對照變白，轉(zhuǎn)化的葉片上的小芽長大。切下小芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，待小苗根系發(fā)達，植株較壯后，便可進行ELISA檢測。本實驗得到轉(zhuǎn)pBinΩSBK植株22株、轉(zhuǎn)pBinΩBC植株20株和未轉(zhuǎn)化對照5株。
轉(zhuǎn)基因植株的ELISA檢測樣品制備取煙草葉片0.2-0.4g，于1.5ml Eppendorf管中用小玻棒充分研磨并加入400μl包被液，14,000rpm離心2min，取上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml Eppendorf管中，即為待測樣品。2.溶液配制(1)包被液(CBS)Na2CO31.59gNaHCO32.93gNaN30.2g(加蒸餾水至1000ml)(2)磷酸鈉緩沖液(PB)Na2HPO4·12H20.44gONaH2PO4·2H2O 1.345g(加蒸餾水至100ml)(3)磷酸洗滌液(PBST)KCl 0.2gNaCl 8gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H22.9gO(加蒸餾水至1000ml后，加入1ml Tween 20)(4)封閉液 0.3g BSA溶于30ml CBS溶液(5)一抗溶液用PBST按1∶2000稀釋一抗，37℃保溫1小時(6)二抗溶液將所購二抗稀釋10倍后，再用PBST按1∶500稀釋，然后37℃保溫1小時(7)底物溶液按TMB原液PB30％H2O2為20∶1000∶3的比例配制，TMB原液為60mgTMB溶于10ml
DMSO后所得3.檢測步驟(1)包被(2)標準曲線選取一排檢測孔用于做標準曲線，第一個孔和最后一個檢測孔加10uldH2O，中間的檢測孔加10ul不同濃度的標準蛋白，加樣量依次為5ng，10ng，20ng，40ng，60ng，80ng，100ng，然后每個檢測孔補加190μl包被液(見附圖7)。樣品在樣品檢測孔中加入20μl樣品，補加180μl包被液。將包被好的酶標板置于4℃冰箱過夜。(3)洗滌將檢測孔中液體迅速用力甩下。在濾紙上控干，每孔加入320μl PBST溶液，放置3min后，甩干，重復3次。(4)封閉每孔加封閉液250μl，置入37℃溫箱，保溫1小時。(5)洗條將檢測孔中液體迅速用力甩下。在濾紙上控干，每孔加入320μl PBST溶液，放置3min后，甩干，重復3次。(6)加一抗每孔加入一抗溶液150μl，置于37℃溫箱，保溫1小時。(7)洗滌將檢測孔中液體迅速用力甩下。在濾紙上控干，每孔加320μl PBST溶液，放置3min后，甩干，重復3次。(8)加二抗每孔加入二抗溶液150μl，置于37℃溫箱，保溫1小時。(9)洗滌將檢測孔中液體迅速用力甩下。在濾紙上控干，每孔加320μl PBST溶液，放置3min后，甩干，重復5次；然后換用蒸餾水，再洗滌2次。(10)顯色第個檢測孔入100μl底物溶液，暗反應(yīng)25min。(11)終止每個檢測孔加入50μl 2M H2SO4以終止反應(yīng)。(12)比色將酶標板放置5min，于450nm比色。(13)根據(jù)標準曲線計算出待測樣品的Bt毒蛋白含量Bradford法檢測總蛋白含量(1)標準曲線在1.5ml Eppendorf管中加入0.5mg/ml BSA，加入量依次為0，5，10，15，20，25μl，再分別補加0.15M NaCl溶液使總體積為100μl，加1ml考馬斯亮藍溶液，混合均勻，室溫下反應(yīng)2min。使用1ml的比色皿，在595nm下測光吸收，做光吸收值對濃度的標準曲線(見附圖8)。(2)樣品檢測取10μl樣品溶液在1.5ml Eppendorf管中，加入90ul 0.15MNaCl溶液，使總體積為100ul，其余操作同上，得到的吸光值在標準曲線上讀出樣品溶液中可溶性蛋白的含量。(3)計算結(jié)果根據(jù)測得的可溶性總蛋白的含量計算出每個樣品中Bt毒蛋白的相對含量，其計算公式為相對含量＝(Bt毒蛋白含量(ng)×20/總蛋白含量(μg)×1000)×1％。(4)根據(jù)所得結(jié)果作成柱型圖(見附圖9，10)。實施例2同實施1操作步驟基本相似，修飾的抗蟲基因為CpTI。
參照CpTI編碼序列、SKTI信號肽編碼序列及KDEL信號周邊序列設(shè)計了三條引物5’端引物(SKTI-PA)5′AAAATGAAGAGCACCATCTTC 3′3’端引物(CpTI-PC)5′TCTAGAGTTCATCTTTCTCATCATCTTCATCCCT 3′中間引物(SCK-Pin)5′CCTACCTTCAGCCATCGCTGATTCGTTTTAAAGGTGTGTGTGCTGGTACTTTTC 3′利用TP-PCR方法進行擴增，擴增出的片斷為SKTI信號肽-CpTI-KDEL的結(jié)構(gòu)。選用Biolabs公司的Vent DNA聚合酶。擴增36個循環(huán)后，得到SCK片段(見附圖11)所示，經(jīng)Klenow酶補平，用WizardTMPCR回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，平端插入克隆載體pBluescript KS(+)的EcoRV位點，得到反向插入的pBSCK(見附圖12)，從pBSCK克隆的SCK片斷兩端進行序列分析，克隆片斷完全符合預期的序列(見附圖13)。
載體的構(gòu)建與實施例1相同，以pBPFΩ-7為中間載體，以pBin19為植物表達載體mimi-Ti質(zhì)粒(見附圖14)煙草的轉(zhuǎn)化與實施例1相同，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為pBinΩSCK，對照是pBinΩCpTI。
CpTI的檢測取煙草轉(zhuǎn)化植株新葉0.5g，裝入1.5ml Eppendoff管，冰浴條件下用小玻棒迅速研磨，將葉片磨成勻漿狀，加入提取液(50mM Tris-HCl，0.2g/L NaN3，pH9.5)1ml，混勻后4℃14000rpm離心8分鐘，取上清。檢測步驟及所用試劑參照本實驗室手冊進行，一抗稀釋到4∶1，二抗稀釋到1∶1，終止反應(yīng)后在492nm波長下，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定光吸收值。所得結(jié)果見附圖15。
生物檢測移栽到溫室的轉(zhuǎn)化苗長至株高20-25cm，7-8片葉齡時，從每株煙草上各選取生長位置一致、生長健康的煙草葉片，置于平皿中，每皿接二齡棉齡蟲10頭，在室溫28℃、濕度85％條件下進行抗蟲測試(見附圖16，17)實施例3利用實施例1，實施例2的部分結(jié)果，本發(fā)明構(gòu)建了Bt-CpTI的融合基因，具體操作步驟如下中間載體pSBCK的構(gòu)建利用設(shè)計于SBTK基因末端KDEL序列之前的NcoI位點，將帶有信號肽的CryIA(c)序列插在3’末端帶有KDEL序列的CpTI編碼序列之前，構(gòu)成編碼SKTI信號肽-CryIA(c)-CpTI-KDEL序列的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生出中間質(zhì)粒pSBCK。
融合蛋白讀碼框的修正在融合蛋白的編碼序列中，后面的CpTI基因序列應(yīng)與CryIA(c)基因序列處于同一個讀碼框之下，但上述融合基因的CpTI編碼序列部分并未處于正確的讀碼框下。為了能正確地表達融合蛋白，我們選擇了用PCR突變加小片段替換的方法修正基因序列。參照Bt與CpTI接合處的序列及載體上多克隆位點的序列，設(shè)計了兩條引物。
5’-ACA CTC GAG GCT GAA ACC ATG GAT CTG AAC C-3’…ACA CTC GAG GCT GAAGAT GAA CCA TGG ATC TGA ACC…5’端引物長31mer，與原序列相比缺失了5個堿基，恰好使CpTI基因的起始密碼子ATG處于正確的讀碼框下，3’端引物為載體上的T3引物。PCR產(chǎn)物包括CryIA(c)末端部分序列及完整的CpTI序列，通過DNA體外重組，用PCR產(chǎn)物替換原序列，以保證讀碼框的正確。DNA測序證明，原序列成功缺失了5個堿基，CpTI編碼序列已置于正確的讀碼框下。修正后的質(zhì)粒為pSBC KM。1)5’-ACA CTC GAG GCT GAA ACC ATG GAT CTG AAC C-3’2)…ACA CTC GAG GCT GAAGAT GAA CCATGG ATC TGA ACC…注1)為5’引物序列，2)為原編碼序列，加黑部分為CpTI起始密碼子，下劃線部分為須缺失的5個堿基。
植物表達載體的構(gòu)建構(gòu)建過程與實施例1、實施例2相同。pΩSBCKM為植物表達中間質(zhì)粒，pBinΩSBCKM為植物表達質(zhì)粒。
煙草轉(zhuǎn)化同實施例1、2相同。
對轉(zhuǎn)化植株檢測，表明轉(zhuǎn)基因植株同時具有Bt和CpTI活性。說明本發(fā)明可以同時把多個抗蟲蛋白定位到植物細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(見附圖18)實施例4轉(zhuǎn)修飾CpTI基因(SCK)的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得。
轉(zhuǎn)化受體的制備取開花后12-15天的幼胚(滅菌處理)或幼胚來源的胚性愈傷組織(1mm)作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體。待幼胚在誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3天后，仔細挑選將其轉(zhuǎn)移到盛有高滲培養(yǎng)基(NMBi+0.5M甘露醇)的平皿(直徑9cm)上，并擺放在平皿中央2-3cm的槍擊范圍內(nèi)(盾片端朝上)，高滲預培養(yǎng)4小時后進行槍擊，胚性愈傷組織進行同上處理后再進行槍擊。
微彈DNA的制備稱取60mg的金粉(直徑1.0μm)置于1.5ml的Eppendorf管中，加入1ml無水乙醇，在漩渦振蕩器上振蕩1-2分鐘后靜置，重復振蕩三次，10,000rpm離心1分鐘，去上清液；再加入1ml的無菌水，重懸，可儲存于4℃冰箱或室溫保存。
充分振蕩起金粉懸液，取50μl，置滅菌的Eppendorf管中，依次加入5μl供體質(zhì)粒DNA pUSCK-Hyg(見附圖19)(1.0μg/μl)溶液，50μl 2.5M氯化鈣溶液，以及20μl 0.1M亞精胺溶液(抽濾滅菌)，充分振蕩約3分鐘，靜置10分鐘后，10,000rpm離心10秒鐘，盡可能去除上清液。加250μl 無水乙醇，短暫振蕩后，10,000rpm離心10秒鐘，去上清后加60μl無水乙醇，并重新重懸，可供5槍之用(5-10μl一槍)。
基因槍的轟擊使用Dupond公司生產(chǎn)的PDS-1000/He型氣動式基因槍進行轉(zhuǎn)化，按產(chǎn)品說明書提供的方法操作。真空度為26-30英寸汞柱，氣壓為1,500或1,750psi，每皿轟擊二槍。
水稻抗性愈傷組織的篩選槍擊后的材料于高滲培養(yǎng)基上過夜后，轉(zhuǎn)移到不含hpt B的非選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)(即NMBi)5-7天后。將材料轉(zhuǎn)入含有hpt B的NMBs上選擇培養(yǎng)三次，暗培養(yǎng)，每次3-4周，hygB濃度依次為30mg/l、40mg/l和50mg/l。
抗性植株的再生將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含hpt B 50mg/l的NMBr上，光照條件同前。待分化出的抗性小芽長至2-3cm時，將其轉(zhuǎn)至含hpt B 20mg/l的MMBg再生苗繼代培養(yǎng)基上，當長至完整的植株后，將其從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至營養(yǎng)液中開放式培養(yǎng)。待生成新根后，將苗轉(zhuǎn)入溫室。
上述過程中所使用的培養(yǎng)基見下表。
轉(zhuǎn)基因水稻植株的檢測水稻葉片胰蛋白抑制劑活性測定，結(jié)果見附圖20。
樣品制備采取0.3g水稻新鮮葉片，液氮研磨后加入600ul提取液充分勻，以11,000rpm，4℃離心10min，將上清液作為待測樣品，及時測定。
樣品測定樣品測定依下表進行空白管 標準管 樣品管緩沖液(ul) 200200 200蒸餾水(ul) 800750 720牛胰蛋白酶(0.1ug/ul，ul)0 50 50樣品(ul)/ /30充分混勻后，置于27℃溫箱保溫60min。保溫后上述反應(yīng)管各取100ul分別與1mlBAEE底物反應(yīng)液混勻，置于27℃保溫15min。保溫完成后，立即于λ＝254nm處測定各反應(yīng)管吸光值(OD254)。同時做標準曲線以大豆來源的胰蛋白酶抑制劑為標準品(TRYPSIN INHIBITOR fromSOYBEAN TYPE 1-S)。以下簡稱標準品。
標準0 標準5 標準10 標準20 標準30 標準40緩沖液(ul)200 200200 200 200 200蒸餾水(ul)720 715710 700 690 680牛胰蛋白酶(0.1ug/ul)(ul) 50 50 50 50 50 50非轉(zhuǎn)化植株提取液(ul) 30 30 30 30 30 30標準品(0.1ug/ul)(ul) 0 5 10 20 30 40試劑配制蛋白提取液50mmol/L Tris-Cl緩沖液(含DTT 1mmol/L)pH9.5。緩沖液50mM Tris-Cl緩沖液(含10mmol/L Ca2+)PH8.0。牛胰蛋白酶溶液牛胰蛋白酶結(jié)晶以0.001M HCl溶解(1mg/ml)，分裝-20℃保存使用時用0.001M HCl稀釋為0.1mg/ml。BAEE底物溶液(0.2mg/ml以緩沖液溶解)轉(zhuǎn)化水稻所用培養(yǎng)基一覽表成分 NMBiNMBS-1NMBS-2NMBr-1NMBr-2MMBg-1MMBg-2大量元素 N6 N6 N6 N6 N6 1/2MS 1/2MS微量元素 MS MS MS MS MS 1/2MS 1/2MS有機成分 B5 B5 B5 B5 B5 1/2B5 1/2B5谷氨酰胺 250 250250250250250250脯氨酸-500500500500- -水解酪蛋白300 300300300300300300PVP 3,0003,000 3,000 - - - -2，4-D22 1 - - - -NAA -- 1 - - - 0.2KT-- 0.52.5- - -6-BA -- - 0.5- - 1TDZ -- - - 0.5- -MET -- - - - - 1.25蔗糖 60,000 60,000 60,000 30,000 30,000 20,000 20,000Gelrite 2,2002,200 2,200 2,400 2,400 - -瓊脂粉-- - - - 6,500 6,500MgCl2500 500500500500- -注N6N6培養(yǎng)基，MSMS培養(yǎng)基，B5B5培養(yǎng)基。i愈傷誘導培養(yǎng)基，s愈傷繼代培養(yǎng)基，r水稻植株再生培養(yǎng)基，g水稻植株繼代培養(yǎng)基。蔗糖、氨基酸、抗生素、激素及磷酸鹽抽濾滅菌，其它成分為高壓滅菌。轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR、Southern檢測。
水稻基因組DNA的提取參照Zolan(Zolan ME.et al.，Molecular AndCellular Biology，1986，6195-200.)等的方法進行。植物DNA的酶切、電泳及向硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移均按常規(guī)方法進行。Southen檢測證實了外源DNA的存在(Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning)。PCR分子檢測5′-端引物為5′AAAATGAAGAGCACCATCTTC 3′，3′-端引物為5′TCTAGAGTTCATCTTTCTCATCATCTTCATCCCT 3′。
生物學檢測自然條件下，轉(zhuǎn)基因水稻植株在害蟲大螟，二化螟攻擊下，表現(xiàn)出明顯的抗蟲性(見附圖21、22)實施例5本發(fā)明使用根農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化棉花，其操作程序如下轉(zhuǎn)化受體材料的制備棉籽經(jīng)硫酸脫絨后用自來水沖洗，經(jīng)10％H2O2浸泡2-4小時后置于無菌水中12-14小時，剝?nèi)シN皮，放置于1/2 MS的發(fā)芽培養(yǎng)基上。在28℃暗培養(yǎng)下發(fā)芽3-5天后，將無菌苗下胚軸切成0.5-1cm切段。
根農(nóng)桿菌的制備取20ml經(jīng)高壓滅菌的液體YEB培養(yǎng)基加入相應(yīng)的抗生素(卡那霉素50mg/L、利福霉素25mg/L)，挑取在平板上的單菌落(含有質(zhì)粒pBinΩSCK)，接種于20ml含有上述抗菌素的液體YEB培養(yǎng)基中，28℃的恒溫搖床上過夜(150-180rpm)。取400μl此菌液轉(zhuǎn)接于不含抗生素的液體YEB培養(yǎng)基中(20ml)，并添加2.5ml 100mmol/L的乙酰丁香酮，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3-5小時。
轉(zhuǎn)化程序?qū)⑾屡咻S用稀釋至5×108個/ml的根農(nóng)桿菌菌液浸泡10分鐘左右，于覆蓋有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS無機鹽、B5有機成分，30g/L葡萄糖和2，4-D及KT各0.1mg/L，pH5.8)上培養(yǎng)。
篩選轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化后的下胚軸經(jīng)三天暗培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入添加了80mg/L卡那霉素、500mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上，經(jīng)2-3個月培養(yǎng)(20-30天繼代一次)誘導出轉(zhuǎn)化愈傷，在MS培養(yǎng)基(MS無機鹽、B5有機成分，30g/L葡萄糖，pH5.8)上繼代4-5次以誘導胚狀體的形成。5-6個月后將發(fā)育好的胚狀體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(MS無機鹽、B5有機成分，去除激素及NH4NO3、KNO3加倍并添加谷氨酰胺1g/L、天門冬酰胺0.5g/L，pH5.8)進行胚狀體的分化。每月繼代一次，當小植株長出完整和健壯的根系并具有3-4片真葉之后，將其移栽或嫁接。
經(jīng)分子水平檢測表明外源基因SCK已整合進棉花基因組中(見附圖23)。對轉(zhuǎn)基因棉花進行抗蟲實驗，轉(zhuǎn)基因棉花表現(xiàn)出明顯的抗蟲性(見17頁表)。實施例6農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因毛白楊的獲得菌液制備從甘油管中挑取少量菌液(pBinΩSCK)，劃于含相應(yīng)抗生素的YEB平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天。從平板上挑取單菌落，重新于同樣平板上劃線。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。從平板上挑取單菌落，加入含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，28℃180-200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日早晨取0.8-1ml菌液加至20ml新鮮YEB培養(yǎng)基中，不加抗生素，加入20ul乙酰丁香酮，使其終濃度為500μM/L繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3-5hr。調(diào)節(jié)菌液OD600約0.3-0.6左右，可用于轉(zhuǎn)化。
葉盤法轉(zhuǎn)化楊樹取生長健壯的無菌苗葉片，切成0.5-1cm大小，放在預培養(yǎng)培養(yǎng)基上預培養(yǎng)1-2天。然后在稀釋的菌液中浸染10-20分鐘左右。取出葉塊，用無菌濾紙吸干后，轉(zhuǎn)入覆有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中于25℃暗培養(yǎng)2-3天后，將葉片轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中。
轉(zhuǎn)化植株的獲得感染葉片在暗處篩選培養(yǎng)10天左右，然后移至光下，一個月以后陸續(xù)有抗性小芽長出，將抗性小芽連同外植體轉(zhuǎn)至新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，抗性芽長到2-3cm時，切下，轉(zhuǎn)入含有km50mg/L的生根培養(yǎng)基上生根，獲得kmr植株。
轉(zhuǎn)化植株的移栽。
移栽前先在自然光下鍛煉幾天，移植容器為15cm的花盆，基質(zhì)為蛭石和營養(yǎng)土各一份。移栽時，先在三角瓶或GA7盒子中放少許水，使培養(yǎng)基和培養(yǎng)容器分離。然后，用鑷子輕輕夾出小植株，用清水洗去培養(yǎng)基，在1/10 MS營養(yǎng)液中培養(yǎng)一周，栽在花盆內(nèi)，在其上罩一燒杯防止植株萎蔫，一周后去除罩子。
本發(fā)明所用的植物組織培養(yǎng)基見下表。
對轉(zhuǎn)基因植株進行分子水平檢測表明SCK整合進寄主植物基因組(見附圖24，25)。轉(zhuǎn)化楊樹所用培養(yǎng)基一覽表成分 繼代培養(yǎng)基 共培養(yǎng)培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基大量元素 MS MS MS 1/2MS微量元素 MS MS MS 1/2MS有機成分 B5 B5 B5 B5蔗糖(g/L)30 30 30 306-BA(mg/L) 0.50.25 0.25 /IAA(mg/L)/ 0.25 0.25 /ZT(mg/L) / 0.25 0.25 /IBA(mg/L)0.1/ /0.2Km(mg/L) / / 30-5050Cef(mg/L)/ / 200-500 50-100瓊脂5.8 5.85.8 6.0pH 5.8 4.8-5.05.8 5.8注MSMS培養(yǎng)基B5B5培養(yǎng)基。抗菌素抽濾滅菌，其它成分高壓滅菌。棉花抗蟲實驗結(jié)果編號 死亡率 蛻皮平均 生物 食葉％指數(shù) 重量mg總量mg級別CK-1 502.6160.2 801 4CK-2 403.2169.0 1014 4CK-3 403.1150.6 904 4CK-4 502.7176.4 882 4平均 452.9163.9 900.34XLZ1-8 502.642.2211 2XLZ1-9 901.528.028 1XLZ1-11503.6121.4 607 3XLZ1-12901.324.024 1XLZ1-13802.395.019 3XLZ1-15502.762.031 3XLZ1-16100 1.90 00XLZ1-17802.040.581 2XLZ1-19702.110.732 2XLZ1-20701.944.3133 3平均 7321 46.8161.62.0J7-3 802.124.549 3J7-4 901.94.0 42J7-6 902.027 27 1J7-7 100 1.90 00J7-8 902.142.042 1J7-10 100 1.90 00J7-11 100 1.40 00J7-12 602.822.389 1J7-18 602.774.8299 4J7-21 503.6133.8 669 4平均 822.232.8117.91.6注使用棉花鮮葉進行試驗，使用二齡初棉鈴蟲作為攻擊蟲。每試驗接蟲5條，六天后統(tǒng)計結(jié)果。食葉級別劃定方式如下0級為不食或輕微咬食，1級咬食面積小于5％，2級咬食面積介于5-10％之間，3級為15-40％之間。
權(quán)利要求
1.一種抗蟲融合蛋白，它從N-末端到C-末端依次含有信號肽、抗蟲蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號。
2.按照權(quán)利要求1所述的抗蟲融合蛋白，其特征在于，所述的信號肽是馬鈴薯塊莖蛋白的信號肽，PR蛋白信號肽序列或大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(SKTI)的信號肽。
3.按照權(quán)利要求1所述的抗蟲融合蛋白，其特征在于，所述的抗蟲蛋白是蘇云桿菌毒蛋白(Bt毒蛋白)、豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)抗蟲蛋白或水稻巰基蛋白酶抑制劑(OC)。
4.按照權(quán)利要求1所述的抗蟲融合蛋白，其特征在于，所述的抗蟲蛋白是由兩個抗蟲蛋白融合的二價抗蟲蛋白。
5.按照權(quán)利要求1所述的抗蟲融合蛋白，其特征在于，所述的二價抗蟲蛋白是由Bt毒蛋白、CpTI、水稻巰基蛋白酶抑制劑(OC)組成。
6.按照權(quán)利要求1所述的抗蟲融合蛋白，還應(yīng)包括自身帶有信號肽，外加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號而使其定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其衍生的蛋白體內(nèi)的抗蟲蛋白。
7.按照權(quán)利要求1所述的抗蟲融合蛋白，其特征在于，所述的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號是KDEL或HDEL。
8.一種編碼權(quán)利要求1至7中任何一項所述的抗蟲融合蛋白的核苷酸序列。
9.一種包含權(quán)利要求8所述的抗蟲融合蛋白基因序列的表達載體。
10.按照權(quán)利要求9所述的表達載體，其特征在于，它是一種植物轉(zhuǎn)化載體。
11.按照權(quán)利要求10所述的表達載體，其特征在于，它包含單個和/或多個抗蟲基因表達盒，和/或其它類型表達盒。
12.按照權(quán)利要求10所述的表達載體，其特征在于，表達盒中的外源基因是在植物表達啟動子控制下。
13.按照權(quán)利要求12所述的啟動子，其特征在于，該啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、棉化曲葉病毒(CLCuV)復制酶基因啟動子(PRP)、水稻actin啟動子，T-DNA mas啟動子、玉米ubiquitin啟動子及不同啟動子之間或啟動子和調(diào)控序列構(gòu)成的復合啟動子。
14.一種含有該表達載體的轉(zhuǎn)化的植物細胞。
15.一種用權(quán)利要求8所述的抗蟲融合蛋白基因轉(zhuǎn)化的植株。
16.按照權(quán)利要求14所述的植物細胞，其特征在于，該植物細胞是水稻、玉米、小麥、煙草、棉花、楊樹、大豆、甘薯、馬鈴薯、白菜、甘藍、或青椒細胞。
17.按照權(quán)利要求15所述的植株，其特征在于，該植株是水稻、玉米、小麥、煙草、棉花、楊樹、大豆、甘薯、馬鈴薯、白菜、甘藍、或青椒植株。
18.一種用權(quán)利要求8所述的編碼抗蟲融合蛋白的核苷酸序列生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括a.將抗蟲基因編碼區(qū)的5’端與信號肽的編碼序列相連，3’端與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號的編碼序列相連，構(gòu)建成融合基因；b.將得到的融合基因轉(zhuǎn)化到植物細胞中；c.將得到的轉(zhuǎn)化的植物細胞培養(yǎng)成植株。
全文摘要
本發(fā)明通過對抗蟲基因進行修飾,使其編碼產(chǎn)物N端帶有大豆SKTI的信號肽序列,C端加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KDEL序列,使抗蟲基因轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物最終特異性地定位到寄主植物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,增加外源抗蟲蛋白的穩(wěn)定性,以提高外源抗蟲物質(zhì)在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的積累量,從而增強轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲能力。
文檔編號C12N15/62GK1229087SQ99103430
公開日1999年9月22日 申請日期1999年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月30日
發(fā)明者朱禎, 鄧朝陽, 曲強 申請人:中國科學院遺傳研究所