一種利用啤酒廢液生產(chǎn)酵母發(fā)酵態(tài)銅飼料添加劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于飼料添加劑及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種利用啤酒廢液生產(chǎn)酵母發(fā)酵態(tài)銅飼料添加劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]銅是動物體必需的微量礦物元素之一，其在動物體內(nèi)的含量約2~3mg/kg。銅主要作為金屬酶組成部分直接參與體內(nèi)代謝。此外，銅還參與銅的吸收以及骨骼的形成與發(fā)育。缺銅會引起動物骨骼發(fā)育受阻、貧血、皮毛發(fā)育不良及神經(jīng)障礙等。動物缺銅可導致采食量下降、生長減慢、飼料利用率降低、骨骼異常、共濟失調(diào)及繁殖功能異常等。日糧添加一定量銅是滿足動物體銅需要的重要措施。目前，銅的主要添加形式為含結(jié)晶水的硫酸銅，該銅化合物吸收率低，毒性大，環(huán)境污染嚴重。研發(fā)毒性低、利用率高的有機態(tài)銅制劑對改善銅在動物飼料中的添加利用具有重要意義。
[0003]我國是啤酒生產(chǎn)消費大國，在其生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生20-30倍的廢水，其中糖化廢水和發(fā)酵廢水中有機養(yǎng)分含量豐富。研究表明，糖化和發(fā)酵后排放的廢水COD濃度在2000~4000mg/L，并且以可溶態(tài)的糖類、氨基酸、醇類、維生素等為主。因此，通過對其營養(yǎng)成分調(diào)控后，能夠作為微生物的營養(yǎng)基質(zhì)來生產(chǎn)一系列微生物發(fā)酵類產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用啤酒廢液生產(chǎn)酵母發(fā)酵態(tài)銅飼料添加劑的方法，將啤酒生產(chǎn)過程中的廢液(糖化廢液和發(fā)酵廢液)經(jīng)過適當理化性質(zhì)調(diào)控后作為發(fā)酵液，以酵母菌作為發(fā)酵菌種，對無機銅鹽進行發(fā)酵處理，研制酵母發(fā)酵態(tài)的銅飼料添加劑，從而達到提高銅的生物利用率、降低添加量、減少環(huán)境污染的目的。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種利用啤酒廢液生產(chǎn)酵母發(fā)酵態(tài)銅飼料添加劑的方法，所用的發(fā)酵菌種為啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母，所用的銅為可溶解在稀酸溶液中的無機銅化合物，具體制備步驟如下:
(1)培養(yǎng)基制備以及微生物培養(yǎng)
取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、瓊脂20g，用蒸饋水溶解、定容至lOOOmL，用高壓鍋在121°C滅菌20min-30min，調(diào)pH至5.0-5.5，制得培養(yǎng)基，然后將啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母從冰箱取出復蘇，培養(yǎng)于該培養(yǎng)基上24h，以獲得復活的啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母；
(2)基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基與銅梯度培養(yǎng)基制備
基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的制法為:依次向100ml蒸餾水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并攪拌混勻，調(diào)整pH至5.0~5.2，備用；
銅梯度培養(yǎng)基的制法為:在上述基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中加入可溶解在稀酸溶液中的無機銅化合物，得到銅含量分別為 50mg/L、100mg/L、150mg/L、300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L的培養(yǎng)基，并與銅含量為0mg/L的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基構(gòu)成銅梯度培養(yǎng)基，備用；
(3)微生物梯度培養(yǎng)將步驟(I)處理所獲得的啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母分別依次培養(yǎng)于步驟(2)所制得銅梯度培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時間為24h，培養(yǎng)溫度為30.5 0C ;
(4)種子培養(yǎng)基的制備
獲取啤酒生產(chǎn)過程中新鮮的糖化廢液，在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心5~10min，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食鹽、0.02%的硫化鈉，混勻后121°C滅菌15~20min,并調(diào)pH至5.0-5.5，即制成種子培養(yǎng)基，并將其平均分做兩份，備用；
(5)發(fā)酵種子的制備
將經(jīng)過步驟(3)處理的啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母按照10%的接種比例分別接種于步驟(4 )所制備的兩份種子培養(yǎng)基中，一份種子培養(yǎng)基接種一種酵母菌，將接種后的培養(yǎng)基放置于30.5°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，即獲得啤酒酵母發(fā)酵種子和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵種子；
(6)發(fā)酵液的制備
發(fā)酵液是利用啤酒生產(chǎn)過程中的糖化廢液或發(fā)酵廢液制成的，具體制備方法如下:
a、利用糖化廢液制作發(fā)酵液:取啤酒生產(chǎn)過程中新鮮的糖化廢液，在3500~4000r/min轉(zhuǎn)速下離心5~10min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、
0.25%的食鹽以及0.02%的硫化鈉，并于121°C滅菌15~20min，調(diào)整pH至5.0-5.5，即可制成發(fā)酵液；
b、利用發(fā)酵廢液制作發(fā)酵液:取啤酒生產(chǎn)過程中新鮮的發(fā)酵廢液，在3500~4000r/min轉(zhuǎn)速下離心5~10min，再在60~65°C水浴鍋內(nèi)水浴加熱30~40min，加熱期間不斷用滅菌的玻璃棒攪拌，使發(fā)酵廢液中殘留的乙醇揮發(fā)，同時達到滅菌效果，然后按照重量比，向滅菌后的發(fā)酵廢液中加入2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食鹽以及0.02%的硫化鈉，并調(diào)整PH至5.0-5.5，即可制成發(fā)酵液；
(7)微生物發(fā)酵
將待發(fā)酵的無機銅化合物按照重量取其中的20%混合在步驟(6)所制得發(fā)酵液中，置于發(fā)酵容器內(nèi)，并按照10%的接種比例向發(fā)酵容器內(nèi)的發(fā)酵液中接種步驟(5)所制得的啤酒酵母發(fā)酵種子和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵種子，然后調(diào)節(jié)溫度至30.5°C進行發(fā)酵，2h后，向發(fā)酵容器內(nèi)再次加入20%的待發(fā)酵的無機銅化合物，并攪拌均勻，再繼續(xù)發(fā)酵至6h后，再次加入20%的待發(fā)酵的無機銅化合物，攪拌均勻，使發(fā)酵液中銅含量達到1200mg/L，繼續(xù)發(fā)酵至12h后，加入剩余的40%的待發(fā)酵的無機銅化合物，攪拌均勻，繼續(xù)發(fā)酵24h后，完成發(fā)酵過程;
(8)酵母發(fā)酵態(tài)銅飼料添加劑的制作
將步驟(7)所得的發(fā)酵產(chǎn)物進行過濾，收取固體物，所得濾液在3500~4000r/min條件下離心lOmin，獲得固體沉淀物，然后將過濾所得的固體物和離心所得的固體沉淀物混合均勻，置于65°C電熱恒溫干燥箱內(nèi)進行干燥處理，干燥后用粉碎機將其粉碎并過60目篩，從而獲得酵母發(fā)酵態(tài)銅飼料添加劑；
(9)包裝
以100g為單位，將步驟(8)所獲得的酵母發(fā)酵態(tài)銅飼料添加劑用復合薄膜進行真空包裝，真空度為0.085-0.095Mpa。
[0006]本發(fā)明的有益效果是:
第一，本發(fā)明提供了一種利用啤酒生產(chǎn)過程中糖化廢水和發(fā)酵廢水生產(chǎn)酵母發(fā)酵態(tài)銅飼料添加劑的處理方法，方法簡單，容易操作，效果理想，既提高了資源利用效率，降低了生產(chǎn)成本，又可以對啤酒生產(chǎn)中的廢水進行生物處理，減少了環(huán)境污染；
第二，本發(fā)明提供的酵母發(fā)酵態(tài)銅的生物有效性高，采用Caco-2細胞模型分析表明，其生物有效性是五水硫酸銅的8.03倍；
第三，本發(fā)明采用啤酒酵母與產(chǎn)朊假絲酵母聯(lián)合發(fā)酵銅的方法，并提供了一種少量多次加入無機銅鹽的發(fā)酵方法，而非一次性加入待發(fā)酵的銅鹽，因而避免了大量無機銅鹽對微生物的毒性，提高了發(fā)酵效率。
【附圖說明】
[0007]圖1是試驗例中Caco-2細胞單層對銅的轉(zhuǎn)運量對比。
【具體實施方式】
[0008]下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的說明。
[0009]實施例1:一種利用啤酒廢液生產(chǎn)酵母發(fā)酵態(tài)銅飼料添加劑的方法，酵母菌選擇市售的啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母，銅源選擇五水硫酸銅，具體制備步驟如下:
(1)培養(yǎng)基制備以及微生物培養(yǎng)
取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、瓊脂20g，用蒸饋水溶解、定容至lOOOmL，用高壓鍋在121°C滅菌20min，調(diào)pH至5.0，制得培養(yǎng)基，然后將啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母從冰箱取出復蘇，培養(yǎng)于該培養(yǎng)基上24h，以獲得復活的啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母；
(2)基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基與銅梯度培養(yǎng)基制備
基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的制法為:依次向100ml蒸餾水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并攪拌混勻，調(diào)整pH至5.0，備用；
銅梯度培養(yǎng)基的制法為:在上述基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中加入五水硫酸銅，得到銅含量分別為 50mg/L、100mg/L、150mg/L、300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L 的培養(yǎng)基，并與銅含量為0mg/L的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基構(gòu)成銅梯度培養(yǎng)基，備用；
(3)微生物梯度培養(yǎng)
將步驟(I)處理所獲得的啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母分別依次培養(yǎng)于步驟(2)所制得銅梯度培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時間為24h，培養(yǎng)溫度為30.5°C，從而使啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母對銅有較強的適應能力；
(4)種子培養(yǎng)基的制備
獲取啤酒生產(chǎn)過程中新鮮的糖化廢液，在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，經(jīng)過測定其COD濃度在2800mg/L，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食鹽、0.02%的硫化鈉，混勻后121°C滅菌15min，并調(diào)pH至5.0，即制成種子培養(yǎng)基，并將其平均分做兩份，備用;
(5)發(fā)酵種子的制備
將經(jīng)過步驟(3)處理的啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母按照10%的接種比例分別接種