蔬菜生物發(fā)酵生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于蔬菜深加工領(lǐng)域，特別設(shè)及蔬菜發(fā)酵的方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 國內(nèi)企業(yè)和民間泡菜生產(chǎn)多采用自然發(fā)酵工藝，該工藝的弊端有：（1)發(fā)酵周期相 對(duì)較長(zhǎng)(630天），生產(chǎn)力低下；（2)受衛(wèi)生條件、生產(chǎn)季節(jié)和用鹽量影響，發(fā)酵易失?。唬?)發(fā) 酵質(zhì)量不穩(wěn)定，不利于工廠化、規(guī)?；皹?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；（4)沿用老泡潰鹽水的傳統(tǒng)工藝，難W 實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)；（5)異地生產(chǎn)，難W保證產(chǎn)品的一致性；（6)亞硝酸鹽、食鹽含量 高，食用安全性差。為了解決上述問題，國內(nèi)開展了乳酸菌純菌種發(fā)酵和直投式乳酸菌菌種 發(fā)酵的研究，但上述技術(shù)尚未進(jìn)入應(yīng)用階段；國外已開始采用純?nèi)樗峋臃N的方法生產(chǎn)泡 菜，運(yùn)種方法在一定程度上促進(jìn)了泡菜傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的革新和發(fā)展。但由于采用的菌種多 為乳酸菌、菌群?jiǎn)我?，且在泡菜制作基質(zhì)的特定環(huán)境中無法生產(chǎn)出風(fēng)味獨(dú)特、品質(zhì)高的泡菜 產(chǎn)品。
[0003] 泡菜由于有益菌的發(fā)酵作用，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物又賦予泡菜一定的功能性。為此，泡 菜成為民間幾千年來經(jīng)久不衰的產(chǎn)品。
[0004] 由此可見，泡菜產(chǎn)品生產(chǎn)用發(fā)酵劑及相應(yīng)的泡菜生產(chǎn)工藝是影響泡菜工業(yè)進(jìn)一步 發(fā)展的關(guān)鍵問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種蔬菜生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。
[0006] 本發(fā)明中蔬菜發(fā)酵生產(chǎn)的主要步驟包括:蔬菜清洗，切分，放入泡菜生產(chǎn)容器，按 照蔬菜原料質(zhì)量比0.2-2%加入混合菌發(fā)酵劑，加入薦糖、食鹽及香辛料的混合料包，密封 容器;控制溫度在23-36°C進(jìn)行10-15小時(shí)的前期發(fā)酵；后期控制溫度在18-22°C進(jìn)行15-25 小時(shí)后發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵期間容器密封;發(fā)酵完畢調(diào)味:取出泡菜，加入混合調(diào)味料，然后經(jīng)真 空包裝冷藏銷售或包裝滅菌均可。所述混合菌發(fā)酵劑含有植物乳桿菌。
[0007] 香辛料的混合料包主要包括花椒、八角、山奈、排草或其他香辛料；
[000引混合調(diào)味料包括大蒜、辣椒粉、鮮姜、味素或其他調(diào)味料；
[0009] 所述植物乳桿菌為CGMCCl 1763。
[0010]本發(fā)明混合菌發(fā)酵劑的制備
[0011] 1)植物乳桿菌和干酪乳桿菌的制備工藝為：
[001^ 斜面培養(yǎng)基（g/L):20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白腺，10牛肉膏，SNaCl，10乙酸 鋼，2巧樣酸錠，0.2MgS04 ? 7也0,0.05MnS04 ? 7也0，15瓊脂，pH 6.5。
[OOK]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白腺，無機(jī)鹽(0.01化Cl ,0.5乙 酸鋼，0.2巧樣酸錠，O.a(也P〇4,0.2MgS〇4 ? 7也0,0.05MnS〇4 ? 7也0)，pH 6.5。
[0014] 發(fā)酵方法:在斜面上取1環(huán)接種到500mL搖瓶中，裝液量為150血，在37°C下，150rpm 培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)期，收集菌液。
[0015] 2)酵母的制備工藝：
[0016] 斜面培養(yǎng)基：10-12°Brix麥芽汁，15瓊脂，抑自然。
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)基：10-12?；痠x麥芽汁，pH自然。
[0018]發(fā)酵方法:在斜面上取1環(huán)接種到SOOmL搖瓶中，裝液量為150mL，在個(gè)不同菌的最 適溫度下，ISOrpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，收集菌液。
[0019] 3)混合菌發(fā)酵劑的制備
[0020] 將培養(yǎng)得到的植物乳桿菌、干酪乳桿菌和釀酒酵母W發(fā)酵液體積比為1-2:0.1-0.3:0.05-0.2 混合。
[0021] 本發(fā)明中植物乳桿菌為CGMCC11763。干酪乳桿菌可W選擇cicc23185，cicc23183， 釀酒酵母菌選擇^(3(：1525，(3^(31415，^(3(31558，上述菌種均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏 中屯、(北京市朝陽區(qū)霄云路32號(hào)，郵政編碼100027)。
[0022] 本發(fā)明中蔬菜原料為市場(chǎng)上常見各種蔬菜，如大白菜、胡蘿h黃瓜、甘藍(lán)菜等或是 它們的混合。
[0023] 有益效果:本發(fā)明中在泡菜的前發(fā)酵階段，添加在泡菜容器中的食鹽使蔬菜中的 水分迅速滲出，在23-36°C的生長(zhǎng)環(huán)境下，復(fù)合菌粉中的植物乳桿菌、干酪乳桿菌、酵母菌迅 速生長(zhǎng)繁殖，密閉發(fā)酵容器中的植物乳桿菌、干酪乳桿菌和酵母菌分別進(jìn)行繁殖代謝產(chǎn)生 各自特有的代謝產(chǎn)物;而酵母菌為兼性厭氧菌，前發(fā)酵階段主要進(jìn)行繁殖子代和發(fā)酵產(chǎn)生 乙醇和C〇2;植物乳桿菌和干酪乳桿菌在前發(fā)酵階段通常代謝產(chǎn)生W乳酸為主的代謝產(chǎn)物。 由于在復(fù)合菌粉中酵母菌數(shù)量比例最低，故其代謝產(chǎn)生的乙醇數(shù)量較少;經(jīng)過短暫的前發(fā) 酵后，由于乳酸的迅速形成，泡菜的酸度急劇增加、pH值迅速下降;經(jīng)過泡菜的前發(fā)酵階段， 隨后進(jìn)入較低溫度的后發(fā)酵階段。在后發(fā)酵階段，由于采用了特殊菌種植物乳桿菌的作用， 發(fā)酵控制技術(shù)使得代謝產(chǎn)物緩慢產(chǎn)生，但代謝產(chǎn)物之間發(fā)生反應(yīng)形成泡菜產(chǎn)品特有的香味 物質(zhì)，泡菜中形成了乳酸乙醋等泡菜產(chǎn)品的主體香味成分。
[0024] 本發(fā)明借助調(diào)溫發(fā)酵，使泡菜產(chǎn)品具有良好的風(fēng)味，產(chǎn)品中富含益生菌和多種營 養(yǎng)成分。
[0025] 采用本發(fā)明方法生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量好，風(fēng)味佳，安全性高，既可適合工業(yè)化大規(guī)模生 產(chǎn)，又可用于手工作坊式生產(chǎn)，產(chǎn)品有較大的應(yīng)用市場(chǎng)。
【具體實(shí)施方式】：
[0026] 下面的實(shí)施例可W使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不W任何方式限制 本發(fā)明。
[0027] 所述植物乳桿菌CGMCC NO. 11763于2015年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為，保藏地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。
[0028] 植物乳桿菌益生特性如下：
[0029] 本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC NO. 11763經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能夠在抑為1.50的條件 下存活，在1 %膽鹽培養(yǎng)4小時(shí)后仍處于存活狀態(tài);植物乳桿菌CGMCC NO. 11763降解亞硝酸 鹽速度快，分解能力達(dá)到10.9mg/h/kg，該菌種在生產(chǎn)泡菜時(shí)，整個(gè)發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃 度在4.8mg/kgW下；CGMCC NO. 11763在發(fā)酵60h小時(shí)后，對(duì)膽固醇降解率可達(dá)到64.76%。 CGMCC NO. 11763黏附能力測(cè)定的自凝集率為95.71 %。
[0030] CGMCC NO. 11763對(duì)膽固醇降解能力研究和測(cè)定：
[0031] 取Iml CGMCC NO. 11763母液接種于IOmL的MRS膽固醇液體培養(yǎng)基（膽固醇含量 O.lmg/ml，抑6.2)中，37°C的恒溫靜置分別培養(yǎng)20h、40h、60h備用，W接入1血無菌水的MRS 膽固醇培養(yǎng)基為對(duì)照，取W上培養(yǎng)不同時(shí)間的菌液樣品及對(duì)照液各lml，9000r/min，4°C下 離屯、lOmin，得到發(fā)酵上清液，鄰苯二甲醒法測(cè)定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 0 . Iml于相應(yīng)的試管中，加冰醋酸0.3ml，Img/ml的鄰苯二甲醒0.15ml，緩緩加入濃硫酸 1.Oml，混合均勻。室溫靜置IOmin，于550nm下測(cè)吸光值）。每一處理3個(gè)重復(fù)，W同樣方法制 作膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中膽固醇含量及降解率，結(jié)果見表1。可知，CGMCCN0.11763 對(duì)膽固醇有很好的降解作用，在發(fā)酵60h小時(shí)后，降解率可達(dá)到64.76%。
[0032] 表1對(duì)膽固醇的降解情況。
[0034] 菌CGMCC NO. 11763菌株的耐膽鹽試驗(yàn)：
[0035] 取CGMCCN0.11763菌液ImL接種菌種于含有不同膽鹽（含量梯度為0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、l%)的10血MRS液體培養(yǎng)基(PH=6.4)，置于37°C下分別培養(yǎng)0、2、4h， 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。各取Iml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋度溶液，取0.1 ml稀釋 液于MRS中涂布，于37°C生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(shí)(每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行)記錄計(jì)算平 板上的菌數(shù)個(gè)數(shù)。結(jié)果見表2?？芍摼谀扄}濃度為1 %處理4h后菌的生長(zhǎng)量依然達(dá)到 0.59±0.92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐膽鹽能力。表2耐膽鹽能力檢測(cè)[(± S) X IO7C化/ml]
[0037] 菌CGMCC NO. 11763菌株的耐酸試驗(yàn)
[0038] 取HLX37母液按Iml接種菌種于不同pH值(pH梯度為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的 IOmLMRS液體培養(yǎng)基，置于37°C下分別培養(yǎng)0、2、地，每一處理3個(gè)重復(fù)。各取Iml樣品菌液于 9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋溶液，取0 . Iml稀釋液于MRS中涂布，于37 °C生化培養(yǎng)箱中倒 置培養(yǎng)48小時(shí)(每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行)記錄平板上的菌落個(gè)數(shù)。結(jié)果見表3。說明該菌具有 很強(qiáng)的耐酸能力。
[0039] 表3耐酸能力檢測(cè)[(±s) X IO7 cfu/ml]
[0040]
[0041 ] 菌CGMCC NO. 11763的黏附能力測(cè)定
[0042] 培養(yǎng)CGMCC NO. 11763(MRS液體培養(yǎng)基）、大腸桿菌D冊(cè)a(LB液體培養(yǎng)基)24h得發(fā)酵 液，分別置于3000r/min、4°C下離屯、IOmin，收集菌泥，分別用抑=7.0的無菌憐酸鹽緩沖液 (PBS)洗涂菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3000r/min、4°C下離屯、 IOmin，收集菌體）。自凝集率（％ ):用無菌的PBS將菌泥CGMCCNO. 11763制成在波長(zhǎng)60化m處 的吸光值為〇.4±0. UA 0)的懸浮菌液及菌懸液，靜置24h后測(cè)定吸光值A(chǔ) 24,自凝集率 (%)公式為(4 0-4 24)心0。；他凝集率（％):將〔610：^).11763和大腸桿菌0冊(cè)〇的懸菌 液調(diào)節(jié)成在波長(zhǎng)600皿處的吸光值為0.6±0.1 (A 0)的混合懸浮菌液。靜置24H后測(cè)定吸光 值A(chǔ) 24,他凝集率（％ )公