專利名稱：從板藍(lán)根中提取表告依春的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥有效成分的提取工藝領(lǐng)域，具體說(shuō)，是板藍(lán)根中表告依春的提取和制備。本發(fā)明還涉及表告依春的新藥物用途。
背景技術(shù)：
板藍(lán)根是一種常用中藥材，是菘藍(lán)(Isatis indigotica)的根。它在中國(guó)有廣泛栽培，具有清熱解毒的功效(中華本草，pp.2346，3·709)。已有報(bào)道表明，它具有抗病毒(板藍(lán)根化學(xué)成分研究(I)，中草藥，2001年第32卷第12期，pp1057)，抗細(xì)菌內(nèi)毒素(Herald of Medicine，卷21，No.2，pp.74，2002)，抗癌，抗抑郁(中草藥，2001年第32卷第7期，pp.670-671)的功效。也有文獻(xiàn)公布了板藍(lán)根的抗病毒作用來(lái)自板藍(lán)根多糖或者喹唑酮或靛紅玉(中草藥，2000年第31卷第6期，474-476頁(yè))。但是，這些方法是基于粗浸膏的注射液(中草藥，2001年第32卷第7期，pp.670-671)或氯仿提取物(中國(guó)中藥雜志，2002年6月，Vol.27，No.6，p.439-442)或其它成分。由于缺乏高度純化和檢測(cè)的手段，因此作為生物堿成分的表告依春難以獲得，對(duì)于其用途也缺乏研究和報(bào)道。
目前對(duì)板藍(lán)根的主要生產(chǎn)工藝是粗提取，以所得的浸膏量作為考察的依據(jù)。見(jiàn)例如中國(guó)藥典，2000，pp.490，其中主要是將板藍(lán)根煎煮，乙醇浸泡后取上清液，壓制得到常見(jiàn)的板藍(lán)根茶和顆粒，在該傳統(tǒng)工藝中并沒(méi)有對(duì)有效部位的分離。在1995年的中華人民共和國(guó)藥典中規(guī)定，以熱浸法測(cè)定，45％的乙醇浸出物不少于25％為合格產(chǎn)品。這樣獲得的產(chǎn)品有效部位含量低，質(zhì)量控制手段粗略。Huang Qiao Shu等，Planta Medica，1981，42(3)，308-310，描述了一種從中藥材板藍(lán)根提取純表告依春的方法，其方法主要是用己烷和二氯甲烷抽提，進(jìn)行硅膠層析并用TLC監(jiān)測(cè)。該方法僅適合實(shí)驗(yàn)室提取，其目的也是僅供研究使用，由于成本等原因不能用于大規(guī)模生產(chǎn)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要一種能夠從板藍(lán)根藥材中大量提取表告依春并對(duì)其進(jìn)行有效的檢測(cè)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明在此提供了一種從板藍(lán)根中提取表告依春的方法，該方法包括步驟(a)用6-12倍板藍(lán)根重量的30-95％重量的乙醇水溶液回流提取，合并乙醇提取液；(b)過(guò)濾，回收乙醇，得到藥液；(c)將所得藥液過(guò)大孔樹(shù)脂吸附柱；(d)用洗滌液洗滌柱，至流出液為無(wú)色；(e)用30％-95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；(f)干燥得到的洗脫液，獲得固態(tài)物；(g)研磨固態(tài)物，獲得平均粒徑為0.001-2mm粉末；(h)將步驟(g)得到的粉末加到氧化鋁柱上；(i)用氯仿甲醇混合溶劑梯度洗脫，梯度為每收集50流份后增加0.1-2ml甲醇，每200-1000ml為1流份；(j)收集含有表告依春的流份；(k)從步驟(j)的流份中除去溶劑，獲得表告依春提取物。
在該方法的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(h)中用干法填充柱；所述氧化鋁是中性氧化鋁。
在該方面的另一個(gè)實(shí)施例中，步驟(i)中梯度為每收集50流份后洗滌液增加1ml甲醇，每500m為1流份。
在該方法的另一個(gè)實(shí)施例中，步驟(j)中還包括用高效液相法在240納米波長(zhǎng)下檢測(cè)表告依春的含量，流動(dòng)相為甲醇與水和三乙胺的比例(按體積)分別為15-45、85-55、和0.2，優(yōu)選為甲醇∶水∶三乙胺的體積比為25∶75∶0.2，柱溫20度，流速1.0ml/分。
在該方法的另一個(gè)實(shí)施例中，還包括步驟(l)將步驟(k)中得到的表告依春提取物溶解于甲醇，拌按提取物重量計(jì)0.5-20％的硅膠；
(m)拌有樣品的硅膠加至硅膠柱上，用氯仿∶甲醇比為500∶1～100∶1的混合溶劑洗滌；(n)收集表告依春流份；(o)從步驟(n)的流份中回收溶劑，將殘留物溶于甲醇，形成表告依春的甲醇溶液；(p)冷凍步驟(o)的溶液，析出表告依春晶體。
在該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，硅膠柱是硅膠H或C18柱。
在本發(fā)明的還有一個(gè)方面，提供了表告依春在制備抗病毒的藥物中的用途。
在該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，該病毒選自流感病毒和仙臺(tái)病毒。
具體實(shí)施例方式
板藍(lán)根是常規(guī)的中藥材，可將其簡(jiǎn)單切成飲片使用。該藥材可從各板藍(lán)根產(chǎn)地購(gòu)得，例如安徽毫州藥材市場(chǎng)、蘇州天靈中藥飲片廠等。或可使用其其它形式，例如洗凈切成條或粉碎成粗顆粒形式。
本發(fā)明的板藍(lán)根提取方法采用乙醇作為提取試劑，并且采用干法中性氧化鋁柱，與常規(guī)的層析法不同，本法在提取率，提取物中表告依春成分的含量也有很大差異。
本發(fā)明中(a)到(f)的步驟在本申請(qǐng)人的2003年4月4日提交的專利申請(qǐng)03110306.5中有所描述。本發(fā)明在該方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)了從該方法得到的板藍(lán)根提取物中精提取表告依春的方法。
步驟(a)中的板藍(lán)根是常規(guī)的中藥材，可將其簡(jiǎn)單切成飲片使用。該藥材可從各板藍(lán)根產(chǎn)地購(gòu)得，例如安徽毫州藥材市場(chǎng)、蘇州天靈中藥飲片廠等?；蚩墒褂闷淦渌问剑缦磧羟谐蓷l或粉碎成粗顆粒形式。
步驟(b)中的回收乙醇步驟，使得獲得的藥液濃縮，從而能吸附在大孔樹(shù)脂上有效分離所需的組分?；厥帐峭ㄟ^(guò)常規(guī)方法進(jìn)行的，例如蒸餾等。
步驟(c)中的大孔樹(shù)脂吸附柱，可采用各種醫(yī)藥級(jí)大孔吸附樹(shù)脂，常用的樹(shù)脂選自D101，AB-8，LSA-10。優(yōu)選樹(shù)脂購(gòu)自西安藍(lán)深LSA-10。在使用前可先用水平衡。上樣，洗滌，洗脫速度不受限制，但優(yōu)選在30-300ml/分鐘之間，最優(yōu)選是60ml/min。
步驟(f)中所使用的過(guò)濾裝置可以是各種常規(guī)過(guò)濾裝置。例如濾紙真空吸濾，多孔樹(shù)脂，分子篩，填充柱等。
本發(fā)明步驟(h)中的中性氧化鋁可用干法上柱，即先填充氧化鋁后用洗滌液等洗滌，使填充的柱沒(méi)有空隙。這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員用常規(guī)的洗滌溶液，例如氯仿等進(jìn)行。
“中性氧化鋁”是指不含其堿或酸形式的水合物的氧化鋁，可從市售來(lái)源如上海陸都化學(xué)試劑廠獲得。其粒徑為0.1-0.2mm，優(yōu)選0.15mm。成分為Al2O3。優(yōu)選為層析專用氧化鋁。
本發(fā)明的洗脫速度不受限制，但優(yōu)選在3-30ml/分鐘之間，最優(yōu)選是6ml/min。
該方面的另一個(gè)實(shí)施例中包括了檢測(cè)步驟，該檢測(cè)步驟是在步驟(j)中使用HPLC對(duì)各流份中的表告依春成分進(jìn)行檢測(cè)，這對(duì)于確認(rèn)表告依春成分，并且獲得高純度的表告依春具有重要意義。HPLC的檢測(cè)受到多方面影響，例如流動(dòng)相、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等。本申請(qǐng)人提供的流動(dòng)相能夠很好的分辨表告依春和其它堿化合物，從而實(shí)現(xiàn)干擾小、精確度高的檢測(cè)。本發(fā)明中所用的檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm，流動(dòng)相為甲醇與水和三乙胺的比例(按體積)分別為15-45、85-55、和0.2，優(yōu)選流動(dòng)相為甲醇∶水∶三乙胺的體積比為25∶75∶0.2，柱溫20度，流速1.0ml/分。
本發(fā)明步驟(k)中除去溶劑的方法多種多樣，可使用常規(guī)的蒸餾法除去甲醇。
本發(fā)明粗提取物中粗提物中總生物堿的含量為50％-90％，表告依春的含量為10％-50％，提取效率達(dá)到60％以上。同時(shí)，由于操作步驟簡(jiǎn)單，可用于大批量工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明步驟(m)中可用各種硅膠柱，例如C18柱等。這些柱是市售的或自己填充的；例如Perkin Elmer Biosystems，F(xiàn)oster City，CA。
本發(fā)明步驟(p)中，冷凍可在0℃下進(jìn)行，用常規(guī)的低溫結(jié)晶技術(shù)，放置一段時(shí)間，使表告依春晶體從溶液中自然析出。
提取的純表告依春的純度達(dá)到95％以上，可用于各種研究和制備藥物。
本發(fā)明獲得的表告依春可以制成成藥，例如添加甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑，制備口服給藥的片劑、錠劑、水或油懸液、可分散性粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。片劑含有與適用于制造片劑的無(wú)毒的可接受的賦形劑混合的活性成分。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑及崩解劑，例如褐藻酸；粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可無(wú)糖衣或用已知技術(shù)包衣，來(lái)延遲在胃腸道內(nèi)的解體和吸收，從而在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)提供持續(xù)作用。例如，可施用延時(shí)物質(zhì)，如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯?？诜褂玫闹苿┻€可制成硬明膠膠囊，其中活性成分與惰性固態(tài)稀釋劑，如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或制成軟明膠膠囊，其中活性成分和水或油性介質(zhì)，例如花生油、液態(tài)石蠟或橄欖油混合。
給藥的劑量可以由醫(yī)師根據(jù)病人的病況、年齡、體重、飲食習(xí)慣和給藥途徑等常規(guī)確定，一般為0.2-0.5mg/kg/d，優(yōu)選為0.3mg/kg/d。
發(fā)明效果使用本發(fā)明的制備方法，可得到具有高濃度的表告依春的提取物或表告依春結(jié)晶。表告依春可用于抵抗或預(yù)防流感病毒和仙臺(tái)病毒等病毒的感染。
實(shí)施例實(shí)施例1主要部位的提取1.材料和儀器材料用中國(guó)申請(qǐng)03110306.5的方法由蘇州市思源醫(yī)藥科技有限公司制備的板藍(lán)根提取物100g。
中性氧化鋁購(gòu)自上海陸都化學(xué)試劑廠硅膠H青島海洋化工有限公司。
2.提取方法將板藍(lán)根提取物研磨到60目；將其加到中性氧化鋁柱上；用氯仿∶甲醇混合溶劑梯度洗脫，梯度為每收集50流份后每500ml洗脫液增加1ml甲醇，洗脫速度6ml/分；收集含有表告依春的流份，用HPLC檢測(cè)其中表告依春的濃度；合并含有表告依春的流份；60℃減壓蒸餾除去溶劑。
將得到的粉末用甲醇溶解，拌少量硅膠H加到硅膠H柱上，用氯仿∶甲醇500∶1混合溶劑洗滌；收集表告依春流份，60℃減壓回收盡溶劑，溶于甲醇；0℃冷凍，放置一天時(shí)間，析出晶體。
用表告依春標(biāo)準(zhǔn)品濃度-峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)最終樣品中的表告依春峰面積計(jì)算出其濃度(重量％)。三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)表1。
表1 三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從三次試驗(yàn)的結(jié)果可見(jiàn)，其中有效部位的純度均在60％以上，而在結(jié)晶后表告依春的純度都達(dá)到了95％以上。
所得的表告依春經(jīng)光譜檢視確認(rèn)，數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。光譜數(shù)據(jù)如下無(wú)色針晶，mp54-56℃，碘化鉍鉀顯色呈陽(yáng)性，有異味。
UνλmaxMeOHnm245.0IR(KBr)υmaxcm-13212(N-H)，3100(-CH＝CH-)，2891(-CH-CH-)，1518，1169El-MSm/z(％)M+1 1301H-NMR(300MHz，CDC13)δ 3.54(t，1H，J＝9.5；8.9Hz，4-H)，3.94(t，1H，J＝9.6，9.6Hz，4-H)，5.35(q，1H，J＝8.2；8.2；7.5Hz，5-H)，5.40(d，1H，J＝10.9Hz，2′-H)，5.49(d，1H，J＝17.1Hz，2′-H)5.97(m，1H，J＝6.8；3.4；6.8；4.4；7.5Hz，1′-H)，7.56(br，s，1H，NH)13C-NMR(100MHz，CDC13)δ190.15(C-2)，133.32(C-1′)，121.18(C-2′)，83.90(C-5)，49.54(C-4).
元素分析Eager 200總和結(jié)果N10.60％；C46.45％；H5.46％。
表告依春C5H7ON的結(jié)構(gòu)式

實(shí)施例2提取物抗流感病毒實(shí)驗(yàn)1.樣品a)靛玉紅、b)喹唑酮、c)實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)3制備的表告依春，濃度為0.01mg/ml，和d)本申請(qǐng)人按照中國(guó)申請(qǐng)03110306.5的方法制備的板藍(lán)根提取物，濃度為0.05mg/ml。
對(duì)照利巴韋林，濃度0.01mg/ml。
2.檢測(cè)方法(1)實(shí)驗(yàn)材料病毒株流感I型病毒A/shanghai/26/85(H，N)株，血凝效價(jià)為1∶1280(由南京醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫教研室保存)。
雞胚用孵化10齡雞胚共22只(南京醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫教研室)。
雞紅細(xì)胞取雄性成年經(jīng)生理鹽水洗三次后配成0.5％濃度。
(2)實(shí)驗(yàn)方法a)分組試驗(yàn)組取a、b、c和d四種水溶液2ml，對(duì)照組使用生理鹽水2ml。
b)實(shí)驗(yàn)方法將病毒1∶100稀釋后，取0.5ml分別用試驗(yàn)組4種水溶液4.5ml和對(duì)照組生理鹽水4.5ml，混合后在37℃下作用2小時(shí)，然后接種雞胚，每組4只，每只接種0.25ml混合液，于37℃繼續(xù)孵化3天后，再分別收取尿液，進(jìn)行血凝試驗(yàn)，測(cè)定各不同標(biāo)本的試驗(yàn)組和對(duì)照組，流感病毒的血凝效價(jià)。
3.檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 藥物水溶液對(duì)流感病毒的抗病毒作用

4.結(jié)果和分析上述結(jié)果標(biāo)明，靛玉紅和喹唑酮的抗流感病毒作用非常小，而表告依春和總堿提取物有明顯的抗流感作用。
實(shí)施例3細(xì)胞病變研究1.試驗(yàn)材料
樣品實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)3制備的表告依春病毒株流感病毒A/FM1/47/H1N1(來(lái)源南京醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫教研室)。
仙臺(tái)病毒(由南京醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫教研室贈(zèng)送)。
細(xì)胞MDCK細(xì)胞(南京醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫教研室贈(zèng)送)。
2.實(shí)驗(yàn)方法a)對(duì)細(xì)胞施用0.6μg/ml表告依春，24小時(shí)后加入100TCID50的流感病毒或仙臺(tái)病毒。
b)將樣品以0.6μg/ml與100TCID50的流感病毒或仙臺(tái)病毒混合，4℃放置過(guò)夜，第二天接種細(xì)胞。
c)將樣品直接以0.6μg/ml與100TCID50的流感病毒或仙臺(tái)病毒以及細(xì)胞混合。
24-48小時(shí)后觀察細(xì)胞病變和進(jìn)行血吸附試驗(yàn)(Hd)和血凝試驗(yàn)(HA)。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 樣品表告依春的體外抗病毒結(jié)果。

結(jié)論由表3可見(jiàn)，樣品表告依春對(duì)流感病毒和仙臺(tái)病毒都有明顯的體外抗病毒作用。
實(shí)施例4表告依春片劑的制備在實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)3制備的表告依春提取物(100g)加入100克乳糖、10克玉米淀粉、10克羥丙基纖維素和5克氫化油后，用壓片機(jī)擠壓混合物從而得到每片重250毫克的片劑。
權(quán)利要求
1.一種從板藍(lán)根中提取表告依春的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)用6-12倍板藍(lán)根重量的30-95％重量的乙醇水溶液回流提取，合并乙醇提取液；(b)過(guò)濾，回收乙醇，得到藥液；(c)將所得藥液過(guò)大孔樹(shù)脂吸附柱；(d)用洗滌液洗滌柱，至流出液為無(wú)色；(e)用30％-95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；(f)干燥得到的洗脫液，獲得固態(tài)物；(g)研磨固態(tài)物，獲得平均粒徑為0.001-2mm粉末；(h)將步驟(g)得到的粉末加到氧化鋁柱上；(i)用氯仿∶甲醇混合溶劑梯度洗脫，梯度為每收集50流份后增加0.1-2ml甲醇，每200-1000ml為1流份；(j)收集含有表告依春的流份；(k)從步驟(j)的流份中除去溶劑，獲得表告依春提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(h)中用干法填充柱；所述氧化鋁是中性氧化鋁。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)中梯度為每收集50流份后洗滌液增加1ml甲醇，每500m為1流份。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(j)中還包括用高效液相法在240納米波長(zhǎng)下檢測(cè)表告依春的含量，流動(dòng)相為甲醇與水和三乙胺的比例分別為15-45、85-55、和0.2，按體積計(jì)；柱溫20度，流速1.0ml/分。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(j)中還包括用高效液相法在240納米波長(zhǎng)下檢測(cè)表告依春的含量，流動(dòng)相為甲醇∶水∶三乙胺的體積比為25∶75∶0.2，柱溫20度，流速1.0ml/分。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(l)將步驟(k)中得到的表告依春提取物溶解于甲醇，拌按提取物重量計(jì)0.5-20％的硅膠；(m)拌有樣品的硅膠加至硅膠柱上，用氯仿∶甲醇比為500∶1～100∶1的混合溶劑洗滌；(n)收集表告依春流份；(o)從步驟(n)的流份中回收溶劑，將殘留物溶于甲醇，形成表告依春的甲醇溶液；(p)冷凍步驟(o)的溶液，析出表告依春晶體。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述硅膠柱是硅膠H或C18柱。
8.一種表告依春的用途，其特征在于，用于制備抗病毒的藥物。
9.如權(quán)利要求7的用途，其特征在于，所述病毒選自流感病毒和仙臺(tái)病毒。
全文摘要
公開(kāi)一種從板藍(lán)根中提取表告依春的方法，該方法包括步驟(a)用6－12倍板藍(lán)根重量的30－95％重量的乙醇水溶液回流提取，合并乙醇提取液；(b)過(guò)濾，回收乙醇，得到藥液；(c)將所得藥液過(guò)大孔樹(shù)脂吸附柱；(d)用洗滌液洗滌柱，至流出液為無(wú)色；(e)用30％－95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；(f)干燥得到的洗脫液，獲得固態(tài)物；(g)研磨固態(tài)物，獲得平均粒徑為0.001－2mm粉末；(h)將步驟(g)得到的粉末加到氧化鋁柱上；(i)用氯仿∶甲醇混合溶劑梯度洗脫，梯度為每收集50流份后增加0.1－2ml甲醇，每200－1000ml為1流份；(j)收集含有表告依春的流份；(k)從步驟(j)的流份中除去溶劑，獲得表告依春提取物。還提供了表告依春在制備抗病毒藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P31/16GK1666984SQ20041001690
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者徐麗華 申請(qǐng)人:徐麗華