專利名稱：胚泡著床相關因子及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)學領域，具體地說，本發(fā)明涉及胚泡著床相關因子EMO-2在促進胚泡著床等方面的用途。
背景技術：
胚胎著床是哺乳動物生殖過程中所特有的一個重要步驟。因著床過程完成后才算真正懷孕，所以針對胚胎著床過程進行生育調控，不存在倫理問題，是一個理想的生育調控藥具作用環(huán)節(jié)。此外，隨著卵母細胞的體外培養(yǎng)和成熟、體外受精、受精卵的體外培養(yǎng)和發(fā)育等技術不斷提高，移植后胚胎能否順利著床，目前已成為影響人工輔助生育技術(ART/IVF)成功率的關鍵。
胚胎相對于母體來說，是一個半異體組織，易受母體排斥，只能在一個特定的時間段內(即″著床窗″)才能被母體子宮內膜組織接納。胚胎著床過程的完成有賴于母體子宮與胚胎的同步發(fā)育、母體子宮內膜容受性和″著床窗″的形成、以及母體子宮組織局部免疫耐受性的形成，涉及細胞的增殖和分化、局部免疫功能的調節(jié)。雌、孕激素在著床中的作用已很明確，現(xiàn)有的笛體類避孕藥就是基于它們在生殖過程中的作用發(fā)展起來的。但是，由于雌、孕激素是內分泌激素，其作用是全身性的，因此還不是最理想的生育調控因子。近年來，在胚胎著床期間子宮組織局部發(fā)揮作用的非激素類因子越來越得到人們的重視，已成為生殖生物學研究領域的一個熱點。
由于種種原因，人們對與胚泡著床有關的因子還知之甚少，因此本領域迫切需要開發(fā)新的胚泡著床相關因子。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新的胚泡著床相關EMO-2因子及其用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了EMO-2基因(及其編碼蛋白)的用途，它被用作促進胚泡著床的促進劑。
本發(fā)明還提供了EMO-2基因(及其編碼蛋白)的另一用途，它被用于制備促進胚泡著床的藥物。
在本發(fā)明的第二方面，提供了EMO-2拮抗劑的用途，它被用作體外抑制胚泡著床的抑制劑。
本發(fā)明還提供了EMO-2拮抗劑的另一用途，它被用于制備抑制胚泡著床的藥物。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥物為避孕藥。
在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑是EMO-2的反義核酸或抗EMO-2多肽的抗體。
在本發(fā)明的第三方面，提供了EMO-2激動劑的用途，它被用作體外促進胚泡著床的促進劑。
本發(fā)明還提供了一種EMO-2激動劑的另一用途，它被用于制備促進胚泡著床的藥物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種確定測試化合物是否是EMO-2的拮抗劑或激動劑的方法，它包括步驟(a)將測試化合物和EMO-2多肽加入體外培養(yǎng)的胚泡作為測試組，并將EMO-2多肽加入體外培養(yǎng)的胚泡作為對照組；(b)觀察測試組和對照組胚泡著床情況，如果測試組的胚泡著床數(shù)量大于對照組，則表示測試化合物是EMO-2的激動劑；如果測試組的胚泡著床數(shù)量小于對照組，則表示測試化合物是EMO-2的拮抗劑。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量(如0.001-99.9wt％)的EMO-2多肽、其激動劑或其拮抗劑以及藥學上可接受的載體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示了小鼠EMO-2多肽的全長氨基酸序列。
圖2A和2B顯示了EMO-2的反義核酸在體外可有效抑制胚泡發(fā)育。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過深入研究發(fā)現(xiàn)，EMO-2基因在著床后小鼠胚胎中的表達水平明顯高于著床前。研究表明，反義核酸可通過阻斷EMO-2 mRNA的翻譯過程，在體外可以有效地抑制胚泡從透明帶中孵化出來，在體內則能明顯地降低正常著床的胚胎數(shù)。這說明EMO-2基因在胚胎著床過程中起著重要的促進作用。
在本發(fā)明中，術語“EMO-2蛋白”、“EMO-2多肽”、“EMO-2因子”或“胚泡著床相關蛋白EMO-2”等可互換使用，都指具有胚泡著床相關因子EMO-2氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們可含有或不含起始的甲硫氨酸。此外，這些術語還包括在其他哺乳動物(如人、狗、牛、羊、猴)中的具有促進胚泡著床功能的同系物或同源蛋白。
小鼠的Emo-2的cDNA基因登錄號是556728，AY372183，全長5700bp(SEQ IDNO1)，ORF位于78-1439位，編碼一個全長為454個氨基酸的蛋白(SEQ ID NO2和圖1)。
應理解，由于鼠等哺乳動物的EMO-2蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本領域常規(guī)的DNA重組技術而獲得其蛋白。
一類特別優(yōu)選的蛋白是EMO-2類似物，即在其他哺乳動物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中EMO-2的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)EMO-2的序列，通過雜交或擴增的方法而獲得，進而通過常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。
如本文所用，“分離的EMO-2蛋白或多肽”是指EMO-2多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化EMO-2多肽?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括EMO-2多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然EMO-2因子相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“EMO-2多肽”指具有促進胚泡著床等EMO-2因子活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術語還包括具有與EMO-2因子相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括EMO-2因子的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與EMO-2DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗EMO-2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含EMO-2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了EMO-2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有EMO-2多肽序列的至少約50個連續(xù)氨基酸，通常至少約100個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約150個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約200個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約300個連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還涉及EMO-2多肽的類似物。這些類似物與天然EMO-2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明的EMO-2核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
EMO-2多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療EMO-2因子功能低下或喪失所致的疾病(如因胚泡著床能力低下而導致的不孕)，和用于篩選促進或對抗EMO-2因子功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組EMO-2因子篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激EMO-2因子功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對EMO-2DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于EMO-2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與EMO-2基因產(chǎn)物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制EMO-2因子的分子，也包括那些并不影響EMO-2因子功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的EMO-2基因產(chǎn)物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的EMO-2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達EMO-2因子或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷EMO-2功能的抗體以及不影響EMO-2功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用EMO-2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與EMO-2基因產(chǎn)物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗EMO-2的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的EMO-2。
本發(fā)明中的抗體作為EMO-2的拮抗劑，還可用于抑制胚泡著床，從而用于避孕。給予適當劑量的抗體可以阻斷EMO-2的產(chǎn)生或活性。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與EMO-2發(fā)生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。例如，能與EMO-2結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)口服、透皮、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、陰道內或局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明EMO-2多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的EMO-2蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。
EMO-2的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g可用于治療由于EMO-2的無表達或異常/無活性的EMO-2的表達所致的胚泡著床水平低下。反義核苷酸可以抑制胚泡著床，從而用于避孕。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測EMO-2水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，包括放射免疫測定等方法。試驗中所檢測的EMO-2水平，可以用作解釋EMO-2因子在不孕等疾病中的重要性和用于診斷。
一種檢測檢測樣品中是否存在EMO-2因子的方法是利用EMO-2因子的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與EMO-2因子特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在EMO-2因子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于，胚泡著床對EMO-2對有明顯的依賴性，如果缺少EMO-2則著床不能成功。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1EMO-2cDNA的克隆1.實驗動物ICR小白鼠，雌性小鼠28±2g，7-8周，成熟期。雄性小鼠30±2g，二雄一雌合籠，第二天早晨，查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓日為妊娠第一天。
2.胚泡收集小鼠腹部用75％酒精消毒，打開腹腔，取出子宮，用PBS從子宮一端沖出胚泡，置于凹玻片上，在解剖鏡下迅速收集胚泡于一小管，置于液氮，保存待用。
3.總RNA提取應用Quickprep Micro mRNA Puriflcation Kit(AmershamPharmacia Biotech)試劑提取總RNA。
4.反轉錄(RT)使用兩種酶AMV和MMLV，經(jīng)過反轉錄從mRNA得到cDNA(單鏈)。
5.DD-PCR(反轉錄擴增)單鏈cDNA經(jīng)過DD-PCR得到雙鏈cDNA。擴增中使用兩種引物，隨機引物和錨引物。
6.差異顯示差異顯示使用蛋白測序分析電泳儀(1)電泳儀的裝量，灌膠(6％變性測序膠)(2)上樣各種DD-PCR產(chǎn)物的樣品(3)預電泳及電泳(4)干膠和曝光(5)刻取差異片段，在沖片后分析差異片段，并進行編號，然后參照膠與X光上的標記，刻取差異片段。冷凍保存待用。
7.DD-PCR差異片段的回收與擴增及PCR產(chǎn)物的純化。
8.目的片段與載體Pucm-T(購自上海博彩生物科技公司公司)的連接，成為Pucm-T-Tar載體，轉化到大腸桿菌，進行克隆(按制造商的產(chǎn)品說明書進行)。
9.重組克隆篩選藍/自斑篩選，重組克隆為白色。
10.插入片段的序列分析，將插入到上述載體Pucm-T中的插入片段用ABI377全自動序列分析儀進行分析，獲得各插入片段的全長序列。
結果發(fā)現(xiàn)有一個差異表達蛋白的cDNA如SEQ ID NO1所示，被命名為EMO-2基因。
EMO-2cDNA為5700bp(SEQ ID NO1)，第78-1439位為完整的開放讀框，編碼含454個氨基酸殘基的多肽(圖1和SEQ ID NO2)。
實施例2EMO-2的原位雜交用SEQ ID NO1中第207-398位的核苷酸片段為探針，用以下方法進行原位雜交取懷孕第4天，第5天小鼠子宮內膜，以4％多聚甲醛室溫固定2.5小時，固定后樣品經(jīng)梯度脫水，石蠟包埋，切片。切片經(jīng)脫蠟與制備好的線性DNA模板探針，進行預雜交和雜交。
結果表明，EMO-2基因具有較高的胚泡特異性，其他組織無雜交。
實施例3EMO-2反義核酸對胚泡著床的體外抑制作用本實施例使用的反義核酸或對照核酸如下反義核酸是序列如下的寡核苷酸5’-GTCTTCTGTGGGCTGCTCCTCA-3’(SEQ ID NO3)對照核酸為隨機序列的寡核苷酸5’-TGAGGAGCAGCCCACAGAAGA C-3’(SEQ ID NO4)將轉染劑LipofectAminTM2000Reagent(Invitrogen公司)和上述反義核酸或對照核酸的混合液(濃度為1μg/μl)，加入小鼠的胚泡培養(yǎng)液中(每孔加入100μl培養(yǎng)液和6μl混合液，終濃度為0.056μg/μl)，觀察對胚泡生長的影響。
結果發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)妊娠第4天的小鼠囊胚，用EMO-2的反義RNA進行功能封閉時，可顯著抑制胚泡的生長，抑制胚泡從透明帶逸出(圖2A和2B)。
實施例4EMO-2反義核酸對胚泡著床的體內抑制作用本實施例使用的反義核酸或對照核酸如下反義核酸是序列如下的寡核苷酸5’-GTCTTCTGTGGGCTGCTCCTCA-3’(SEQ ID NO3)對照核酸為隨機序列的寡核苷酸5’-TGAGGAGCAGCCCACAGAAGA C-3’(SEQ ID NO4)將轉染劑Mirus TransITPolymer Solution(Madison公司，WI，USA)和上述反義核酸或對照核酸的混合物(濃度為1μg/μl)，按表1所示劑量于妊娠第4天下午將反義核酸直接注射入每側子宮，然后在第9天統(tǒng)計正常著床的胚胎數(shù)。
結果表明，EMO-2反義核酸能夠明顯降低正常著床的胚胎數(shù)(見表1)。
表1 EMO-2核酸對小鼠著床的影響(重復3次試驗)

實施例5EMO-2的重組表達在該實施例中，以抽提的小鼠胚泡mRNA為模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增RT-PCR，獲得EMO-2DNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-aaaCATATGatgagcttcatagattgagc-3’(SEQ ID NO5)該引物含有NdeI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-tatGGATCCcaggaaacacaggctctagcct-3’(SEQ ID NO6)，該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和EMO-2的部分編碼序列。
EMO-2 cDNA PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)NdeI/BamHI酶切再與質粒pUC18按常規(guī)方法重組并轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的EMO-2蛋白cDNA NdeI/BamHI酶切片段克隆至表達載體pGEX-2T(Pharmacia，Piscataway，NJ)，形成載體pGEX-2T-EMO-2，然后轉化人DH5α。陽性克隆用NdeI/BamHI酶切鑒定插入方向，酶切產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測序證實，已插入了完整的EMO-2編碼序列。
挑表達EMO-2的陽性DH5α克隆接種于100ml 2×YTA培養(yǎng)基中，37℃300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶10稀釋于預熱的2×YTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30℃誘導2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復洗脫2-3次，得到EMO-2蛋白，分子量大小與預計值相符。
實施例6抗EMO-2抗體的產(chǎn)生1.多肽的合成以合成多抗原肽(MAP)的方式進行多肽的合成，MAP的核心是一種沒有免疫原性的Lys(賴氨酸)核心，目的抗原多肽的C端偶聯(lián)在Lys的兩個氨基酸上?？梢孕纬?個重復序列的多抗原肽。得到的兩種合成多肽的抗原片段如下抗原多肽EMO-2NAla-Glu-Ser-Ser-Arg-Thr-Phe-Pro-Glu-His-Cys-Ala-Pro-Ser-Arg-Leu-Ala(SEQ ID NO7)抗原多肽EMO-2CThr-Val-Pro-Arg-Lys-Arg-Arg-Ala-Arg-Gly-Lys-Val-Lys-Leu-Ala-Gly(SEQ ID NO8)2.產(chǎn)生抗體用如上合成的2種多肽分別作為免疫原，每次以0.4mg/Kg多點注射兔的皮下，抗原溶于生理鹽水并和等體積的Freund’s完全佐劑乳化，每隔二周進行一次加強免疫，用固相酶免疫測定方法，進行抗血清效價的鑒測。待抗血清的效價達到要求時，即可從兔的頸動脈取全血，并分離出血清，得到二種抗EMO-2的抗血清(抗EMO-2N抗血清和抗EMO-2C抗血清)。-20℃冷凍待用。
按實施例4的方法進行胚泡著床的體內抑制試驗，不同點在于用抗血清(不用轉染劑)替換反義核酸。結果如表2所示。
表2 EMO-2抗血清對小鼠著床的影響

*給藥時間為妊娠第4天下午6:00到下午6:30實施例7篩選EMO-2的拮抗劑按實施例4所述方法，將以下兩組物質(替換反義核酸和轉染劑)施用于懷孕小鼠，然后觀察對胚泡著床的體內抑制作用(a)候選物質+EMO-2因子；(b)EMO-2因子。
如果組(a)的胚泡著床率在統(tǒng)計學上顯著低于組(b)的胚泡著床率，則表明該候選物質是EMO-2的拮抗劑。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市計劃生育科學研究所<120>胚泡著床相關蛋白及其用途<130>044190<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5700<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(78)..(1439)<223>
<400>1catatttggc agctactggg tggaatagag ggtctaacag taggcccttg gcactttatt 60ctcttgaagc tgttaaa atg agc ttc ata gat ttg agc aac aag atg cca 110Met Ser Phe Ile Asp Leu Ser Asn Lys Met Pro1 510tca ctg ctg ttt ggt acg gaa aac gtc cca ttt tcc ttt cat gtg aaa158Ser Leu Leu Phe Gly Thr Glu Asn Val Pro Phe Ser Phe His Val Lys15 20 25tca gtg tcc agc tgc atg gct gag tcc tcc agg act ttt cct gag cac206Ser Val Ser Ser Cys Met Ala Glu Ser Ser Arg Thr Phe Pro Glu His30 35 40tgc gct cca tcg agg ctt gcc tta aca gag gcc tcc cag tgc tca gct254Cys Ala Pro Ser Arg Leu Ala Leu Thr Glu Ala Ser Gln Cys Ser Ala45 50 55cca gct ccc aag tgg acc ttc tct ttt ttc ttg tcc cat ggt tgc cct302Pro Ala Pro Lys Trp Thr Phe Ser Phe Phe Leu Ser His Gly Cys Pro60 65 70 75ggg atg gcc aca ttc agg gaa gac act ggc ctc agt agt cag aca cac350Gly Met Ala Thr Phe Arg Glu Asp Thr Gly Leu Ser Ser Gln Thr His80 85 90act cag gct cct ctc caa gaa tat gga ggc act gcc ata gtt cag acc398Thr Gln Ala Pro Leu Gln Glu Tyr Gly Gly Thr Ala Ile Val Gln Thr95 100 105agg gca gac cgc tct ggc ctt ggc ctt cac aca ctt cta gca ctt tgt446Arg Ala Asp Arg Ser Gly Leu Gly Leu His Thr Leu Leu Ala Leu Cys110 115 120tca ccc gga tgt tac cga atc tgg aca aaa aga cgg aac ttc tcc agt494Ser Pro Gly Cys Tyr Arg Ile Trp Thr Lys Arg Arg Asn Phe Ser Ser
125 130 135aat atg cct atc atg cag agg ctc ttc ctg acc cag ttt aca cag ggc 542Asn Met Pro Ile Met Gln Arg Leu Phe Leu Thr Gln Phe Thr Gln Gly140 145 150 155cta aaa ggg tta agg tct cca gcc tct ata gca gat aag gtc ttc tgt 590Leu Lys Gly Leu Arg Ser Pro Ala Ser Ile Ala Asp Lys Val Phe Cys160 165 170tct ctg ccc tac tcg gtg ggc cgg gtg ttg tcc ctt tgg agc cag cac 638Ser Leu Pro Tyr Ser Val Gly Arg Val Leu Ser Leu Trp Ser Gln His175 180 185ggg ccc tct tgt acc ttc aaa ttg cca gct ctt cat tcc acc cct agc 686Gly Pro Ser Cys Thr Phe Lys Leu Pro Ala Leu His Ser Thr Pro Ser190 195 200aag cag cag ggg agc ctg aac gcc ctg agc agc cac acc acc ata cca 734Lys Gln Gln Gly Ser Leu Asn Ala Leu Ser Ser His Thr Thr Ile Pro205 210 215aat gtg cct ctt cca ggc atg gga gct gcc cac acc acc aac agc agt 782Asn Val Pro Leu Pro Gly Met Gly Ala Ala His Thr Thr Asn Ser Ser220 225 230 235cac ctg agg cta gag cct gtg ttt cct gcc ttg gtg cca aag tct tgc 830His Leu Arg Leu Glu Pro Val Phe Pro Ala Leu Val Pro Lys Ser Cys240 245 250ttg gta aca gaa gcc gct gtc agc aca ctg ctg ctc tct gcc tct gag 878Leu Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Thr Leu Leu Leu Ser Ala Ser Glu255 260 265ctc gca gtt cct ggc tgt gat gag ctg gat ggt gtg tca gca gcc tgc 926Leu Ala Val Pro Gly Cys Asp Glu Leu Asp Gly Val Ser Ala Ala Cys270 275280ccc cga cca cag agc agc cct gca cag cag aaa gag gct gag cca gag 974Pro Arg Pro Gln Ser Ser Pro Ala Gln Gln Lys Glu Ala Glu Pro Glu285 290 295aag aga cca aag aaa gtc tca cag atc cgc atc cgg aaa acc att cct1022Lys Arg Pro Lys Lys Val Ser Gln Ile Arg Ile Arg Lys Thr Ile Pro300 305 310 315aaa cca gat ccc aac ctt acc cca atg ggc ctg cct cgg ccc aaa agg1070Lys Pro Asp Pro Asn Leu Thr Pro Met Gly Leu Pro Arg Pro Lys Arg320 325 330tta aag aag aag gag ttt agt tta gag gaa atc tat aca aac aag aat1118Leu Lys Lys Lys Glu Phe Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Lys Asn335 340 345tac aag tct cct cct gcg agc agg tgt tta gag acc atc ttt gag gaa1166Tyr Lys Ser Pro Pro Ala Ser Arg Cys Leu Glu Thr Ile Phe Glu Glu350 355 360ccc aaa gaa cga aat ggt acc ctg atc tct atc agc cag cag aaa agg1214Pro Lys Glu Arg Asn Gly Thr Leu Ile Ser Ile Ser Gln Gln Lys Arg365 370 375aag cgt gtt ctg gaa ttc cag gat ttt acc gtc cct cga aag aga cga1262Lys Arg Val Leu Glu Phe Gln Asp Phe Thr Val Pro Arg Lys Arg Arg380 385 390 395gct cga ggt aag gtg aag ctg gcc ggc agc ttc acc agg gcc cag aag1310Ala Arg Gly Lys Val Lys Leu Ala Gly Ser Phe Thr Arg Ala Gln Lys
400 405 410gcg gct ctg cag act cag gag ctg gac gct ctt ctg att cag aag ctg 1358Ala Ala Leu Gln Thr Gln Glu Leu Asp Ala Leu Leu Ile Gln Lys Leu415 420 425atg gaa ctg gag acg ttc ttt gcc aag gag ggg gag cag gag cat cag 1406Met Glu Leu Glu Thr Phe Phe Ala Lys Glu Gly Glu Gln Glu His Gln430 435 440cca gct gct gag aac agt tcg ggg tct cca ctt tgaacttttg cagacctccc1459Pro Ala Ala Glu Asn Ser Ser Gly Ser Pro Leu445 450tggatgaggt tccttgattt tagccctgtg cccaaaccac tcacaatgcc cagcccatga1519atttttactt atttcaaggt gcagcctttt tagaagctgg tgaagaaggg ccctctaatt1579ctactgctga gtctagagcc tcaggaatgc tccctttctc ctggggatgg tcctgagtga1639ccaggccacc tccttcccgt ctcccatcac tggtggaaaa gccacacatc ttaagcaaca1699ctaggaatct aaggcctcgt tgtctgtgtg tccacacgaa agctcctctc cattcatggt1759gctgctcgcc caagatgact tagaaacctg gcctggggag gacctggctg cctggtctgt1819gtgttctcac cagcttgtta tggtgactga gaaagatgaa ctggtgtgtt tcttgactct1879gattctgtct gcccaggacc tttattctga gagaatgtgt gtttgtgtgt gtttgtggct1939tttccccatc ttttctccca tctgtgactg cgggtcacta gtgccagagg agccgtccag1999gccccagcgt aagttgcact ttttaatgtt atggtgttga ttattttcat ttttcttctt2059cttttgtttt tgtattattg ctgcatgttt ggggtctcta aatgtgattt taaaccattt2119tgtaagacat taaggagaaa gacaatttac gtcttaggag aatatgtgac aggcattgat2179cagcacatgg aggggcagtg ttcccaacca tgtgtttcag gcagccctcc cccaccccca2239gcttttcatg tagttcacta gaggaagcac ttttcacctc cttctcagtc ctgcccactg2299aatacacata ttcatttagt gacgtgcata aaagcagatt tctctcgtaa ccacttaaaa2359actgttaagg tggagtgtgg gtttctctga aatgttggta tatgatgaag ttagcagtgg2419tgtcagaggc tgaccaagag tgttttcagc tgctagagtg cctggttctg tcaagggcca2479gagccagtgc tctctgagag tgcctcgtgg actctgctcc ctcgtcaaac ctactggaaa2539ggtttgcatg ctacaagtag cacagttcct aggtttgcgc ccagaggagt ctgcaggcgg2599taggctgccg tctgtcgtct gagcagcagg ccctcagagc tcaccctccc cagtgtcctt2659actgtgctcc ttcctctcct gtgtgttctc atcccaccct ctctcccatt cattcttcac2719acctaccgct cagaggtcag aagttcaaac tgcttggctg atggctaaga tgctcaagct2779agctgctgaa caatgctcat ttcttcccat tctcctggct tggtccaggg acatttctct2839gttcgtctgt agagaagagt gagcagtgct gtcctggaat gttggccaac gcttctacga2899ttctttcatt ccccatttgt cagtggctaa ggagaagggg caccaccagt tcagggtctt2959tatgtgcctt tcctttgcgg gttggtggtc tgggccaccc tgaaacagtt aaactggaca3019taagtatggg gaaacgtatc atgtccttca cctcctcagc tgtttaaata agttaacaca3079cacctgctgg tgtatggaga cttgaaggtc acagctctat cacagaagag aacaagctag3139tttgcacgat ggtcttcagc agtgtatgca gatcctggtt tacacatgat gcccagacca3199tacacacgtg acctgtgttc acctgaatct ctctctccct cgttggggca ggagttttag3259ttactcagtg cttctgaact ctgtgttgtt acttcaggga ctgaaatgag ttacacattt3319tgcccttcta caagtacatc taagacactg tacattagac agcttgcaag ctagtgggca3379gcaaacagcc tttcatcagt ttaaccacca tggttactgg ggcatcagat taccccaaaa3439aggtgaggtg tccacagctg gggtaccacc agtatacaga cctttagaat ttgtccatga3499ctagtgtggc atgtaagagg ctggaaacac tggtctggac tcttagcatc tcggagcaca3559ggacttgtcc tgggaatgga agaggaaatc tgccatcttg gtctgccctc cagctcagaa3619ctaagagact cagccacacc tgtcttacca tcatgtttca cagtggtcag ccagcctcag3679agacacctta gtgtcctcag aaccttggtc tttgacaatg actggaggtg gtggctgctg3739gcatgtcacc tgccaaacct ataggagtgg ttctgtaaag gtagaatttc tgaggatggg3799gacttgccac tcaagtgatg agaagctgac attaagcaca acatacctag ctgtagctca3859cctccagaag tttagtgttt tcatgattat ggggaaagaa gacaaatttc aggttcagcc3919
agatttcagt cgtttccttg gccacctttc agtctctcgc cagagcagcc tcttccctca3979ctagtgcctg tcttcttttc ctcccctgct gtcccatccc gcctctccac ccatctagtt4039gtacctcatc acctgttaaa gcagattgtg tctgtcttcc tgctgccctt actataagag4099ctgactgaga gaggtgcagt gggaagagat gaagcttttt tgccttactg gagcctgaag4159agctcagaaa ctcatgctgt gaatcctaaa ctctgtgctc ctccaagagc tgtgaaaatc4219atgacttttt tttttttttt ttccacaatt ttgcctgaaa gggtcttctg tgagggctcc4279agagccagcc tgaggtcagt tctagatccc accctctggg catccttccc ctgggtgtgt4339cctctgccca ccaggctaag agcagcagca agtctgcagg gctgtggcag caggtccgag4399gctgcagtgc agccaagtgg acccagccct ccatctcccc aggctggggc tcagtctctt4459ctgtaccatg tgcattaaga tctgtgcaag accaactttt aggttgtgat actttcctcc4519tggtacctgg ggggagggga gtatgcagtt ggtgctttct ttaatatcct tggtttgttt4579ctatagcttt tcccctggta tcatgaaaag ggccttttta atgaccacat tgtgggtggc4639tgtatccaaa gcataaataa ttggccagtg gtatggaatg tcctcacctg cattcctgtc4699aggagagggc tactttcctg gactgaacta tatagaactg gctaggaaga tgagttaaat4759tttgttcaaa tcacaattaa tattccaatt tagccacact ttgaccagca aaagccatct4819tggttgtgaa gctggggccc tcatttagcc gccatccagc ccagcatgct aaaatctgag4879gctcattctg tctttataag actgtctggt gttggttgga ttttaattct caacaagagg4939cccccttgaa ctaggatctg ggccagtaag ttgctgtccc tagtgttcct gtattatcat4999ggctaatagt tcagtgaaat gtgtccatct ttggtaatgc tagtatacat gataccctac5059agttcctttt ctgtttgata gtttgtgact ctaaatgccc actgttacat taattaattt5119atggaaataa atttttcttg aaaaccattc agataattgt caaggctatt ttgttcttta5179gggcttggta gtaggtttga attttcccgg taatattcca attagacatg ctccctccca5239ccttaatagg tgtgcttgcc tctcctgtgc cagaacctcc ctcacattcc tgcatggtca5299cttccatcac gtcatccaga tctttacatt cccagatcgc tggtcttgaa cgtggtcccc5359tcccattcca tatctgctgc ccgcacaccc caaggcattt tgttatggct cctcccccct5419gtctgtgcta ataactataa caaaagctct acaaggtcag gacctttcat tttcttagct5479ctagaccctt ctggtctctt tggtacctag aacaatgttt tatatttaca gctgtttacc5539gcctaaatat cgttttggtc agtgaactgc atattaccat aagatggtaa tggagctgaa5599aaattcctgg gacctagcga ggtcacagct gtgatgatgt gttttactca ggtcttggtg5659caaacaagcc agtgcattgc cagtcttgta aaaatgtagc a5700<210>2<211>454<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>2Met Ser Phe Ile Asp Leu Ser Asn Lys Met Pro Ser Leu Leu Phe Gly1 5 10 15Thr Glu Asn Val Pro Phe Ser Phe His Val Lys Ser Val Ser Ser Cys20 25 30Met Ala Glu Ser Ser Arg Thr Phe Pro Glu His Cys Ala Pro Ser Arg35 40 45Leu Ala Leu Thr Glu Ala Ser Gln Cys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Trp50 55 60Thr Phe Ser Phe Phe Leu Ser His Gly Cys Pro Gly Met Ala Thr Phe65 70 75 80Arg Glu Asp Thr Gly Leu Ser Ser Gln Thr His Thr Gln Ala Pro Leu85 90 95Gln Glu Tyr Gly Gly Thr Ala Ile Val Gln Thr Arg Ala Asp Arg Ser
100 105 110Gly Leu Gly Leu His Thr Leu Leu Ala Leu Cys Ser Pro Gly Cys Tyr115 120 125Arg Ile Trp Thr Lys Arg Arg Asn Phe Ser Ser Asn Met Pro Ile Met130 135 140Gln Arg Leu Phe Leu Thr Gln Phe Thr Gln Gly Leu Lys Gly Leu Arg145 150 155 160Ser Pro Ala Ser Ile Ala Asp Lys Val Phe Cys Ser Leu Pro Tyr Ser165 170 175Val Gly Arg Val Leu Ser Leu Trp Ser Gln His Gly Pro Ser Cys Thr180 185 190Phe Lys Leu Pro Ala Leu His Ser Thr Pro Ser Lys Gln Gln Gly Ser195 200 205Leu Asn Ala Leu Ser Ser His Thr Thr Ile Pro Asn Val Pro Leu Pro210 215 220Gly Met Gly Ala Ala His Thr Thr Asn Ser Ser His Leu Arg Leu Glu225 230 235 240Pro Val Phe Pro Ala Leu Val Pro Lys Ser Cys Leu Val Thr Glu Ala245 250 255Ala Val Ser Thr Leu Leu Leu Ser Ala Ser Glu Leu Ala Val Pro Gly260 265 270Cys Asp Glu Leu Asp Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Arg Pro Gln Ser275 280 285Ser Pro Ala Gln Gln Lys Glu Ala Glu Pro Glu Lys Arg Pro Lys Lys290 295 300Val Ser Gln Ile Arg Ile Arg Lys Thr Ile Pro Lys Pro Asp Pro Asn305 310 315 320Leu Thr Pro Met Gly Leu Pro Arg Pro Lys Arg Leu Lys Lys Lys Glu325 330 335Phe Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Pro Pro340 345 350Ala Ser Arg Cys Leu Glu Thr Ile Phe Glu Glu Pro Lys Glu Arg Asn355 360 365Gly Thr Leu Ile Ser Ile Ser Gln Gln Lys Arg Lys Arg Val Leu Glu370 375 380Phe Gln Asp Phe Thr Val Pro Arg Lys Arg Arg Ala Arg Gly Lys Val385 390 395 400Lys Leu Ala Gly Ser Phe Thr Arg Ala Gln Lys Ala Ala Leu Gln Thr405 410 415Gln Glu Leu Asp Ala Leu Leu Ile Gln Lys Leu Met Glu Leu Glu Thr420 425 430Phe Phe Ala Lys Glu Gly Glu Gln Glu His Gln Pro Ala Ala Glu Asn435 440 445Ser Ser Gly Ser Pro Leu450<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>3gtcttctgtg ggctgctcct ca 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>4tgaggagcag cccacagaag ac 22<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>5aaacatatga tgagcttcat agattgagc29<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>6tatggatccc aggaaacaca ggctctagcc t31<210>7<211>17<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>7Ala Glu Ser Ser Arg Thr Phe Pro Glu His Cys Ala Pro Ser Arg Leu
1 5 10 15Ala<210>8<211>16<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>8Thr Val Pro Arg Lys Arg Arg Ala Arg Gly Lys Val Lys Leu Ala Gly1 5 10 1權利要求
1.一種EMO-2基因的用途，其特征在于，它被用作促進胚泡著床的促進劑。
2.一種EMO-2基因的用途，其特征在于，它被用于制備促進胚泡著床的藥物。
3.一種EMO-2拮抗劑的用途，其特征在于，它被用作體外抑制胚泡著床的抑制劑。
4.一種EMO-2拮抗劑的用途，其特征在于，它被用于制備抑制胚泡著床的藥物。
5.如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述的藥物為避孕藥。
6.如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑是EMO-2的反義核酸或抗EMO-2多肽的抗體。
7.一種EMO-2激動劑的用途，其特征在于，它被用作體外促進胚泡著床的促進劑。
8.一種EMO-2激動劑的用途，其特征在于，它被用于制備促進胚泡著床的藥物。
9.一種確定測試化合物是否是EMO-2的拮抗劑或激動劑的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將測試化合物和EMO-2多肽加入體外培養(yǎng)的胚泡作為測試組，并將EMO-2多肽加入體外培養(yǎng)的胚泡作為對照組；(b)觀察測試組和對照組胚泡著床情況，如果測試組的胚泡著床數(shù)量大于對照組，則表示測試化合物是EMO-2的激動劑；如果測試組的胚泡著床數(shù)量小于對照組，則表示測試化合物是EMO-2的拮抗劑。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的EMO-2多肽、其激動劑或其拮抗劑以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種胚泡著床相關因子EMO－2。EMO－2因子具有促進胚泡著床的功能，而EMO－2的反義核酸及其多肽抗體可抑制胚泡著床。本發(fā)明還公開了利用這種EMO－2因子篩選促進或抑制胚泡著床的化合物的方法。
文檔編號A61P15/00GK1795928SQ20041009337
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月22日 優(yōu)先權日2004年12月22日
發(fā)明者劉承權, 袁瑤, 王健, 王忠興 申請人:上海市計劃生育科學研究所