專(zhuān)利名稱(chēng)：溶菌酶脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種溶菌酶脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶或N一乙酸胞壁質(zhì)聚糖水解酶，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床，具有多種藥理作用。由于它能水解細(xì)菌胞壁，在細(xì)胞內(nèi)對(duì)吞噬后的病原菌起破壞作用，可用于抗感染、消炎、消腫、增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)等；它能分解稠厚的粘蛋白，排出膿性創(chuàng)滲出物，可用于清除壞死組織，加速創(chuàng)口的修復(fù)再生；與抗菌素合用對(duì)五官科多種粘膜疾病的治療有增效作用。此外，還有凝血、止血作用。
國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于溶菌酶的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的專(zhuān)利申請(qǐng)。專(zhuān)利CN01107864.2公開(kāi)了一種以溶菌酶為主要成分的外用凝膠劑及制備方法，用于消炎殺菌、清潔陰道、消除瘙癢、清除異味，有效率達(dá)81.58％；專(zhuān)利CN200410020814.8公開(kāi)了溶菌酶泡騰片制法及其應(yīng)用；專(zhuān)利CN200410020817.1公開(kāi)了溶菌酶膜劑的制法及其應(yīng)用，制備工藝簡(jiǎn)單，安全無(wú)毒副作用，有很好的藥用前景；專(zhuān)利CN200410020816.7涉及溶菌酶在制藥領(lǐng)域的新用途，涉及在制備治療由細(xì)菌、真菌、病毒、變態(tài)反應(yīng)、職業(yè)性、物理性、神經(jīng)功能障礙性、免疫性引起的皮膚病變、感染、潰爛疾病的藥物中的應(yīng)用。專(zhuān)利WO 0204011公開(kāi)了一種合成一種含有多個(gè)氨基酸鏈的溶菌酶多聚體來(lái)治療腫瘤、艾滋病等；專(zhuān)利WO 0200247公開(kāi)了一種利用溶菌酶二聚體來(lái)破壞微生物對(duì)抗生素的抗藥性，恢復(fù)抗菌素的殺菌性能。
脂質(zhì)體作為新型藥物載體，具有靶向性和長(zhǎng)效緩釋作用，在醫(yī)藥學(xué)上有著極大的發(fā)展前景，但目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)溶菌酶脂質(zhì)體的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種溶菌酶脂質(zhì)體及其制備方法，以提高溶菌酶的藥物利用性，同時(shí)賦予新劑型緩釋性能和一定的靶向作用。
本發(fā)明由溶菌酶，磷脂和親脂性穩(wěn)定劑制備成溶菌酶脂質(zhì)體。本發(fā)明的制備方法是，先將磷脂和親脂型穩(wěn)定劑溶于一定密度的有機(jī)溶劑中，完全溶解后加入一定濃度的溶菌酶溶液，超聲分散成穩(wěn)定的乳液后減壓蒸干有機(jī)溶劑，并加入緩沖溶液水合2～3小時(shí)，制得溶菌酶脂質(zhì)體。
本發(fā)明所述的磷脂是卵磷脂。
本發(fā)明選用親脂性穩(wěn)定劑穩(wěn)定脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，減少藥物的泄漏、變質(zhì)。所述穩(wěn)定劑包括，膽固醇，硬脂胺，磷脂酸，生育酚，維生素E。
本發(fā)明的磷脂和親脂性穩(wěn)定劑的質(zhì)量比為1∶1～7∶1；溶菌酶和磷脂與親脂性穩(wěn)定劑總質(zhì)量的質(zhì)量比為0.013∶1～0.0044∶1。
本發(fā)明所用的水相介質(zhì)是根據(jù)中國(guó)藥典2000版標(biāo)準(zhǔn)制備的磷酸鹽緩沖溶液，pH值6.5～7.4。
本發(fā)明中水相介質(zhì)和有機(jī)溶劑的體積比為0.5∶1～3∶1。
采用本發(fā)明方法獲得的溶菌酶脂質(zhì)體包封率可達(dá)84％以上，制備工藝重現(xiàn)性好。脂質(zhì)體的粒徑不大于500nm，在體外具有良好的緩釋性，殺菌效果顯著。


圖1為溶菌酶脂質(zhì)體電鏡照片，放大12000倍。
圖2為溶菌酶脂質(zhì)體電鏡照片，放大50000倍。
圖3為溶菌酶脂質(zhì)體粒徑分布照片。
圖4溶菌酶溶液及溶菌酶脂質(zhì)體累積釋放曲線。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)下面實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍，不局限于此。
實(shí)施例1將卵磷脂0.60g和膽固醇0.30g充分溶于12ml用乙醚和氯仿混合調(diào)成的密度為1g/ml的混合溶劑，完全溶解后加入2mg/ml的溶菌酶溶液4ml，以超聲5秒停5秒的強(qiáng)度冷水浴超聲180s，減壓蒸干有機(jī)溶劑使原料成均勻膜。加入30mlpH為6.8的PBS溶解膜狀物，所得懸液水浴條件下繼續(xù)水合3小時(shí)，制得溶菌酶脂質(zhì)體，其包封率如表1所示。
表1溶菌酶脂質(zhì)體的包封率

(1)包封率測(cè)定稱(chēng)取一定量的產(chǎn)物，按其占總產(chǎn)物的比例計(jì)算其中所含溶菌酶的量作為M總。取適量的溶菌酶脂質(zhì)體樣品裝入預(yù)先用PBS浸泡24h的透析袋中，并將其浸入30ml PBS中透析24h后于294nm處測(cè)定透析液的吸光度，按溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(實(shí)驗(yàn)測(cè)得為A＝7.6857c-0.0152(R＝0.9999，n＝5))計(jì)算其所對(duì)應(yīng)的溶菌酶的量作為M游。按包封率EN％＝(M總-M游)×100％/M總，算得產(chǎn)物的包封率為84.9％。
(2)形態(tài)學(xué)觀察形態(tài)觀察適量產(chǎn)物以PBS稀釋20倍后，滴于銅網(wǎng)上放置至成膜均勻，多余液體揮干，透射電鏡下觀察，所得為大單室脂質(zhì)體，呈球形，外觀圓整，外圈為包含溶菌酶的脂層，厚而均一連續(xù)，脂質(zhì)體顆粒間彼此分散，獨(dú)立。見(jiàn)圖1、圖2。
粒徑分布測(cè)定取2g產(chǎn)物以PBS稀釋50倍測(cè)定體積粒徑分布，如圖3所示，所得產(chǎn)物的粒徑范圍為150～350nm，分布較為均勻。
實(shí)施例2體外釋放測(cè)定取0.95mg溶菌酶、含0.95mg溶菌酶的脂質(zhì)體及空白脂質(zhì)體，置于Franz擴(kuò)散池供應(yīng)室中，接受室中裝PBS接受液，(37±1)℃恒溫水浴恒速攪拌(120r/min)，不同時(shí)間取樣，同時(shí)補(bǔ)加同溫同體積新鮮釋放介質(zhì)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)溶菌酶的UV值以接收液的UV值作校正，溶菌酶脂質(zhì)體的UV值用相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的空白脂質(zhì)體的UV值作校正，同一樣品取3次，計(jì)算實(shí)驗(yàn)平均值。按公式Qn＝Cn+∑Cn-1計(jì)算累積釋藥量Qn(C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的藥物濃度，n為取樣次數(shù))。以累積釋藥百分率對(duì)時(shí)間作圖得圖4。
結(jié)果表明，溶菌酶溶液釋放速度較快，6h時(shí)累積釋放率就達(dá)到95.6％，6h后趨于平衡。而6h時(shí)脂質(zhì)體中溶菌酶的釋放率僅為33.1％，18h時(shí)才趨于平衡，說(shuō)明溶菌酶脂質(zhì)體在體外具有明顯的緩釋效果。
實(shí)施例3殺菌實(shí)驗(yàn)采用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋法。
取2ml溶菌酶脂質(zhì)體，以營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋至10ml，依次取適量，以營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋?zhuān)谷芫傅幕钚詽舛确謩e為0.5個(gè)活性單位、1個(gè)活性單位/ml、2個(gè)活性單位/ml、3個(gè)活性單位/ml，4個(gè)活性單位/ml。實(shí)驗(yàn)菌種為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。
結(jié)果，上述活性單位濃度的溶菌酶脂質(zhì)體下均未見(jiàn)菌種生長(zhǎng)。溶菌酶脂質(zhì)體殺菌效果顯著。
權(quán)利要求
1.一種溶菌酶的脂質(zhì)體及其制備方法，其特征在于將磷脂和親脂型穩(wěn)定劑溶于一定密度的有機(jī)溶劑中，完全溶解后加入一定濃度的溶菌酶溶液，超聲分散成穩(wěn)定的乳液后減壓蒸干有機(jī)溶劑，并加入緩沖溶液水合2～3小時(shí)，制得溶菌酶脂質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂是卵磷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的親脂性穩(wěn)定劑包括，膽固醇，硬脂胺，磷脂酸，生育酚，維生素E。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，磷脂和親脂性穩(wěn)定劑的質(zhì)量比為1∶1～7∶1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，溶菌酶的質(zhì)量與磷脂和親脂性穩(wěn)定劑二者總質(zhì)量的質(zhì)量比，即藥脂質(zhì)量比，為0.013∶1～0.0044∶1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑為不同體積比的乙醚和氯仿的混合液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，水相介質(zhì)是pH為6.5～7.4的磷酸鹽緩沖溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，水相介質(zhì)和有機(jī)溶劑的體積比為0.5∶1～3∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含溶菌酶的脂質(zhì)體及其制備方法。本發(fā)明由溶菌酶，磷脂和親脂性穩(wěn)定劑制備成溶菌酶脂質(zhì)體。其方法是先將磷脂和親脂型穩(wěn)定劑溶于一定密度的有機(jī)溶劑中，完全溶解后加入一定濃度的溶菌酶溶液，超聲分散成穩(wěn)定的乳液后減壓蒸干有機(jī)溶劑，并加入緩沖溶液水合而成。本發(fā)明制備工藝重現(xiàn)性好，溶菌酶脂質(zhì)體包封率可達(dá)84％以上；產(chǎn)物形態(tài)圓整，粒徑均一，緩釋性能優(yōu)，殺菌效果顯著。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1840184SQ20061002355
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2006年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月23日
發(fā)明者徐云龍, 錢(qián)秀珍, 徐盛, 儲(chǔ)小衛(wèi) 申請(qǐng)人:上海微納科技有限公司