專利名稱：一種改良的重組卡介苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物與新醫(yī)藥技術(shù)(醫(yī)藥生物技術(shù))領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
卡介苗(bacillus calmette querin，BCG)是預(yù)防結(jié)核病的唯一疫苗，但其免疫保 護(hù)效果不穩(wěn)定，對成人結(jié)核的預(yù)防作用為0-80%。各國學(xué)者正致力于更加高效、安全的結(jié) 核病疫苗的研究。將外源基因引入BCG，并使外源DNA在BCG中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)即重組BCG， 是目前研制新型結(jié)核病疫苗的熱點(diǎn)。重組BCG的效果理想與否取決于向其引入的外源基因 的性質(zhì)，以及外源DNA的表達(dá)效率。大量研究表明，結(jié)核桿菌免疫保護(hù)性抗原Ag85A及早期 分泌性耙抗原6(Early secretory antigen target 6， ESAT6)均為結(jié)核桿菌的主要分泌 抗原，可誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。采用單獨(dú)ESAT6或Ag85A重組BCG，免疫動(dòng)物后發(fā)現(xiàn)其免疫 保護(hù)作用不及BCG，其原因可能是其抗原剌激不足，另外一方面可能是其載體的表達(dá)效率較 低。穿梭表達(dá)質(zhì)粒PMV361具有卡那霉素抗性基因、大腸桿菌_分枝桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)及 MTB HSP60的啟動(dòng)子。另外，它還有黏附位點(diǎn)attP及整合基因int，借此，可以定向地整合 到BCG基因組的染色體attB上，從而有別于一般的穿梭載體，從而更加準(zhǔn)確、持久地表達(dá)插 入BCG的目的蛋白。本研究采用結(jié)核分枝桿菌Ag85A及ESAT6為引入基因，以準(zhǔn)確穩(wěn)定表 達(dá)的穿梭質(zhì)粒PMV361為載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將此質(zhì)粒導(dǎo)入BCG，構(gòu)建重組BCG。

發(fā)明內(nèi)容
1.重組質(zhì)粒pMV361-Ag85A-ESAT6的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)Genbank中報(bào)道的基因序列設(shè)計(jì)及合成2對引物，以結(jié)核桿菌H37RV基因 組DNA(結(jié)核桿菌H37RV基因組DNA由本室保存)為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase ChainReaction， PCR)擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌Ag85A及早期分泌靶抗原6 (ESAT6)基因。分別 向Ag85A下游及ESAT6上游引入45個(gè)堿基的linker、兩端引入Mun I及NspV酶切位點(diǎn)， 通過S0E法(重疊延伸，Gene splicing by overlap extension)，擴(kuò)增Ag85A-ESAT6融合 基因，膠回收試劑盒回收目的基因。質(zhì)粒提取試劑盒提取pMV361空質(zhì)粒(pMV361空質(zhì)粒 由四川大學(xué)徐恒教授惠贈(zèng)，本室常規(guī)保存)，瓊脂糖凝膠電泳顯示質(zhì)粒提取效果佳。限制性 核酸內(nèi)切酶Mun I及NspV分別雙酶切融合基因Ag85A-ESAT6及pMV361空質(zhì)粒，酶切后膠 回收試劑盒回收目的基因。按融合基因Ag85A-ESAT6與pMV361空質(zhì)粒的摩爾比8 : l的 比例進(jìn)行連接，連接試劑盒16t:條件下連接4h后，直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a 。挑取 陽性克隆提取質(zhì)粒，分別采用M皿I及NspV雙酶切、PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定，鑒定正確質(zhì)粒送 Invitrogen公司進(jìn)行測序鑒定。經(jīng)上述3種方法鑒定后證實(shí)此重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并命名 為pMV361-Ag85A-ESAT6。 2.重組卡介苗rBCG-Ag85A-ESAT6構(gòu)建及鑒定 卡介苗轉(zhuǎn)種培養(yǎng)制備感受態(tài)細(xì)胞，將上述構(gòu)建成功的pMV361-Ag85A-ESAT6質(zhì)粒 純化后經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化感受BCG細(xì)胞，命名為rBCG-Ag85A-ESAT6。電穿孔放電完畢后，取
3菌液涂布于含卡那霉素的平板上，37t:靜置3 4周，然后挑取平板上單菌接種于液體培養(yǎng) 基繼續(xù)抗生素篩選。待菌膜長出，細(xì)菌基因組提取試劑盒提取重組卡介苗基因組，以重組卡 介苗基因組為模板進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)PCR鑒定成功的基因組送Invitrogen公司測序以證 明導(dǎo)入卡介苗的目的基因未發(fā)生突變或缺失等。與此同時(shí)，相同方法將PMV361空質(zhì)粒導(dǎo)入 BCG作為對照，命名為rBCG-361。 3.目的基因在重組卡介苗中的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 經(jīng)抗生素篩選、PCR鑒定以及基因組測序證明構(gòu)建成功的重組卡介苗靜置培養(yǎng) 數(shù)周待菌膜長出后，熱誘導(dǎo)lh，收集培養(yǎng)液上清，裝入透析袋濃縮至原體積1/10。將誘 導(dǎo)表達(dá)后的菌體超聲破菌，收集破菌上清及沉淀。采用單克隆抗體對此3種收集物進(jìn)行 Western-blotting鑒定，以證明重組卡介苗是否表達(dá)目的基因及其表達(dá)量。以BCG及 rBCG-361作為對照。 本發(fā)明的優(yōu)勢在于結(jié)核分枝桿菌免疫保護(hù)性抗原Ag85A及早期分泌性靶抗原 6均為結(jié)核桿菌的主要分泌抗原，其中ESAT6是只存在于結(jié)核分枝桿菌有毒株而BCG中缺 失的基因蛋白，大量研究表明二者均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，而免疫毒性較弱。 pMV361具有MTB HSP60的啟動(dòng)子、黏附位點(diǎn)attP及整合基因int，借此，可以定向地整合到 BCG基因組的染色體attB上，從而有別于一般的穿梭載體，從而更加準(zhǔn)確、持久地表達(dá)插入 BCG的目的蛋白。將Ag85A和ESAT6融合基因通過pMV361為載體導(dǎo)入BCG，使得外源基因 在BCG持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，利用質(zhì)粒pMV361表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)的Ag85A可解決因BCG蛋白表 達(dá)量低，而對機(jī)體免疫系統(tǒng)免疫剌激不足的難題，而ESAT6的高效表達(dá)則解決了 BCG因缺失 此基因不能剌激免疫系統(tǒng)對抗結(jié)核桿菌的能力。通過上述2種蛋白的不斷剌激，可誘導(dǎo)機(jī) 體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而達(dá)到抗結(jié)核桿菌感染的目的。綜上所述，此基因重組BCG能產(chǎn) 生較BCG更強(qiáng)、更安全高效的免疫效果。


附圖1說明1 :Ag85A-linker PCR產(chǎn)物(1068bps);2 :Linker-ESAT-6PCR產(chǎn)物(338bps);3 :Ag85A-linker-ESAT-6融合基因(1362bps);4 :pMV361空質(zhì)粒(4445bps);5 :rpMV361-Ag85A-linker-ESAT-6重組質(zhì)粒(5791bps);6 :重組質(zhì)粒雙酶切鑒定；7 :pMV361空質(zhì)粒同條件雙酶切對照；8:重組質(zhì)粒PCR鑒定，可擴(kuò)增出目的基因；9 :pMV361空質(zhì)粒同條件下的PCR對照，未見擴(kuò)增條帶。附圖2 :rBCG-Ag85A-ESAT6基因組提取及PCR鑒定1 :rBCG-Ag85A-ESAT6基因組；2 :rBCG-Ag85A-ESAT6基因組PCR鑒定；3 :rBCG-361空質(zhì)?；蚪M；4 :rBCG-361空質(zhì)?；蚪M相同條件下PCR鑒定，未見擴(kuò)增條帶
4
5 :BCG基因組； 6 :BCG基因組相同條件下PCR鑒定，未見擴(kuò)增條帶； 附圖3 :rBCG-Ag85A-ESAT6蛋白的表達(dá)及Western-blotting鑒定
具體實(shí)施例方式1.引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)Genbank中報(bào)道的基因序列設(shè)計(jì)以下2對引物P1 :5，-GCC AAT TGT AAT GCA GCTTGT TGA CAG GGT T_3， ；P2 :5， -GCT TCC ACC TCC TCC GCT TCC ACC ACC TCC GCTTCC ACC GCC ACC GGC GCC CTG GGG CGC GGG-3， ；P3 :5， -GGT GGC GGT GGA AGCGGA GGT GGT GGA AGC GGA GGA GGT GGA AGC ACA GAG CAG CAG TGG AAT-3' ;P4 :5' -GCT TCG AAT CTA TGC GAA CAT CCC AGT GAC_3'。 PI及P4中下劃線部分分別為Mun I及NspV酶切位點(diǎn)，P2 及P3中下劃線部分為互補(bǔ)的45個(gè)堿基的linker。由上海Invitrogen公司合成純化。
2.目的基因的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性5min，94t:變性45s，62t:復(fù)性lmin，72t:延伸lmin， 共循環(huán)30次，最后72t:繼續(xù)延伸10min。以H37RV基因組DNA為模板，首先以Pl、 P2為引 物，擴(kuò)增Ag85A-linker產(chǎn)物，以P3、P4為引物，擴(kuò)增linker-ESAT6產(chǎn)物。然后以P1、P4為 引物，以上述2種PCR產(chǎn)物為模板，即擴(kuò)增得到Ag85A-linker-ESAT6融合基因。
3.質(zhì)粒DNA的提取 將含有pMV361質(zhì)粒的E. coliDH5 a菌液小量增菌后，采用Omega公司的質(zhì)粒提取 試劑盒提取質(zhì)粒，操作按說明書進(jìn)行，最后用適量緩沖液或雙蒸水溶解，取少量質(zhì)粒經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳檢測其純度及濃度。 4.重組質(zhì)粒pMV361-Ag85A-ESAT6的構(gòu)建及鑒定 質(zhì)粒提取試劑盒提取pMV361空質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳顯示質(zhì)粒提取效果佳。分別 對pMV361空質(zhì)粒及Ag85A-linker-ESAT6融合基因進(jìn)行Mun I和NspV雙酶切，37"C酶切 4h，膠回收試劑盒回收純化目的基因。按融合基因Ag85A-linker-ESAT6與pMV361空質(zhì)粒 的摩爾比8 : 1的比例進(jìn)行連接，連接試劑盒連接4h后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a ，挑 取陽性克隆37t:震蕩培養(yǎng)增量后提取質(zhì)粒，分別采用M皿I及NspV雙酶切、PCR擴(kuò)增進(jìn)行 鑒定，酶切及PCR擴(kuò)增均鑒定正確的質(zhì)粒送Invitrogen公司進(jìn)行測序鑒定，上述3種方法 鑒定均正確的重組質(zhì)粒命名為pMV36l-Ag85A-ESAT6。
5.重組卡介苗rBCG-Ag85A-ESAT6構(gòu)建及鑒定
5. 1BCG的轉(zhuǎn)種和培養(yǎng) 將本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)的BCG轉(zhuǎn)種于Sauton培養(yǎng)基中，37。C靜置培養(yǎng)4 5周待菌 膜長出，菌體呈白色或略顯黃色，有皺褶覆蓋整個(gè)培養(yǎng)液面時(shí)，即可用于BCG感受態(tài)細(xì)胞的 制備。 5. 2重組質(zhì)粒DNA的提取 挑取重組質(zhì)粒pMV361-Ag85A-ESAT6單菌于LB液體培養(yǎng)基(含20ug/ml卡那霉 素)中，37t:振搖過夜，提取質(zhì)粒備用。
5. 3感受態(tài)BCG細(xì)胞的制備 取在Sauton培養(yǎng)基上生 良好的3周左右培養(yǎng)物，向其中滴加終濃度為4%的甘氨酸，37°C繼續(xù)靜置培養(yǎng)24h，取出培養(yǎng)瓶，加入滅菌玻璃珠，放置振蕩培養(yǎng)箱中，180r/min 條件下劇烈振蕩培養(yǎng)4h，充分打碎菌膜使之成為均勻的菌懸液。取出后將菌懸液離心收集 菌體，細(xì)菌沉淀用滅菌10%甘油洗滌3次，最后再用10%甘油重懸菌體，即得到BCG感受態(tài) 細(xì)胞。 5. 4電穿孔杯的準(zhǔn)備 之前電穿孔杯一直浸泡在75%乙醇中，電穿孔當(dāng)日取出，滴干乙醇后，傾斜放入超 凈工作臺，打開紫外燈和鼓風(fēng)5h，讓殘存的乙醇徹底揮發(fā)。
5. 5重組質(zhì)粒的電穿孔轉(zhuǎn)化 分別將純化的pMV361-Ag85A-ESAT6質(zhì)粒經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的細(xì)胞，重組BCG 命名為rBCG-Ag85A-ESAT6。具體方法如下取感受態(tài)細(xì)胞400ul加入10ul質(zhì)粒，用加樣槍 反復(fù)吹吸混和均勻后轉(zhuǎn)入0. 2cm電穿孔杯中，在電壓6. 25kv/cm，電容2. 5C，電阻720歐條 件下放電2次，2次放電間隔為5min。放電完畢后立即冰浴10min，加入適量Sauton培養(yǎng) 基，37t:振搖過夜。取菌200ul涂布含20ug/ml卡那霉素的Sauton平板上，37。C靜置培養(yǎng) 4周。 5. 6重組BCG的PCR鑒定及基因組測序鑒定 挑取Sauton平板上的單菌落，接種于含20ug/ml卡那霉素的培養(yǎng)液中，37。C靜置 培養(yǎng)數(shù)周進(jìn)行抗生素抗性篩選，待菌膜長滿培養(yǎng)液表面，收集重組菌體，細(xì)菌基因組提取試 劑盒提取基因組PCR進(jìn)行鑒定，PCR鑒定成功的基因組送測序公司進(jìn)行測序鑒定。
6.目的基因在重組卡介苗種的誘導(dǎo)表達(dá)及Western-blotting鑒定
6. 1重組卡介苗的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的制備 含外源基因的重組卡介苗在Sauton培養(yǎng)液(含20ug/ml卡那霉素)中靜置培養(yǎng) 兩周，迅速置45t:水浴熱誘導(dǎo)lh，6000r/min離心10min集菌。收集培養(yǎng)液上清備用。菌體 用冰預(yù)冷的PBS液(Ph7. 2)洗滌2次，離心收集菌體，PBS重懸，冰浴下超聲破菌超聲頻率 20KHz，超聲10s間歇10s，共超聲30min，之后4°C 、 1200r/min離心10min，取破菌上清及沉 淀備用。將培養(yǎng)液用微孔濾器過濾除菌轉(zhuǎn)入透析袋(最小截留分子量為8.8kDa)，PEG6000 濃縮至原體積的1/10， _201:保存?zhèn)溆谩?
6.2目的蛋白的Western-blotting鑒定 分別取上述蛋白樣本，加入等體積2XSDS上樣緩沖液(lOOmMp朋.8Tris-CL， 100mM |3_巰基乙醇，4% SDS，O. 2溴酚藍(lán)，20X甘油)，充分混勻后沸水煮5min，離心上樣， 進(jìn)行SDS-PAGE電泳，先80v穩(wěn)壓電泳至與分離膠界面，將電壓加至120V至電泳結(jié)束后，切 取目的膠帶采用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將上述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為10V、70min。轉(zhuǎn) 膜結(jié)束后5%脫脂奶粉封閉lh，TBST緩沖液洗滌5min x 3次，加入小鼠抗ESAT6 (TBS液稀 釋1 : 600) IgG —抗，4t:過夜，次日復(fù)溫至室溫放置lh， TBST洗滌5minx3次，加入HRP標(biāo) 記的羊抗小鼠IgG 二抗(TBS稀釋1 : 1800)室溫lh， TBST洗滌5minx3次后DAB顯色試劑 盒顯色。數(shù)碼相機(jī)照相存底。
權(quán)利要求
一種基因重組卡介苗，其特征是采用大腸桿菌-分支桿菌穿梭質(zhì)粒pMV361為載體，應(yīng)用基因重組技術(shù)將結(jié)核分支桿菌Ag85A及ESAT6基因與載體pMV361構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV361-Ag85A-ESAT6，并將此重組質(zhì)粒以電穿孔方式導(dǎo)入卡介苗基因組，使目的基因在此基因重組卡介苗種持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，獲得新型結(jié)核桿菌疫苗rBCG-Ag85A-ESAT6。
2. 權(quán)利要求1所述的大腸桿菌_分支桿菌穿梭質(zhì)粒PMV361的用途，它是真核表達(dá)質(zhì)粒，是所有真核及原核基因的載體和表達(dá)系統(tǒng)，可將目的基因準(zhǔn)確整合到靶細(xì)胞基因組，。
3. 權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pMV361-Ag85A-ESAT6的用途，應(yīng)用于重組卡介苗的構(gòu)建，也是結(jié)核分枝桿菌Ag85A及ESAT6基因的載體。
4. 權(quán)利要求l所述重組質(zhì)粒pMV361-Ag85A-ESAT6以電穿孔方式導(dǎo)入卡介苗基因組，可構(gòu)建高效表達(dá)目的基因的重組卡介苗。
5. 權(quán)利要求1所述，基因重組卡介苗rBCG-Ag85A-ESAT6的用途，它以疫苗接種方式有效預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生，也可用于結(jié)核病的治療。
全文摘要
本發(fā)明屬新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種改良的重組卡介苗。由于唯一抗結(jié)核桿菌疫苗BCG對結(jié)核病的免疫保護(hù)效果不確切，近10年來結(jié)核病發(fā)病率逐年上升，研發(fā)更加有效的抗結(jié)核桿菌疫苗顯得尤為關(guān)鍵。本發(fā)明將結(jié)核分枝桿菌ESAT6和Ag85A基因序列插入大腸桿菌-結(jié)核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒形成重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化入BCG中形成重組結(jié)核疫苗。研究證實(shí)，該重組卡介苗可表達(dá)導(dǎo)入的外源基因。本發(fā)明的重組BCG疫苗將是一種新型的抗結(jié)核桿菌疫苗。
文檔編號A61P31/00GK101721693SQ20091021678
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者楊曉玲, 鄧儀昊, 鮑朗 申請人:四川大學(xué)