專利名稱：卟啉納米囊泡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米囊泡的領(lǐng)域，更具體地，涉及卟啉囊泡，涉及卟啉囊泡，其是由卟啉結(jié)合于磷脂側(cè)鏈而形成的具有卟啉雙分子層的納米囊泡。
背景技術(shù)：
受益于大量吸收光的成分的治療和診斷技術(shù)包括熒光和比色檢測1’2、光熱和光動力學(xué)治療3_5，光聲層析成像(也稱為光聲斷層成像(optoacoustic tomography))6—9、光頻域成像 ^optical frequency domain imaging)10、以及多模技術(shù) ^multimodal technique)1。 由于無機(jī)納米顆粒與光發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，因此它們可用作這些技術(shù)的試劑。例如，量子點(diǎn)(quantum dot)是貴重的熒光探針，其消光系數(shù)范圍為IO5至lOlknT1’12。由于金納米顆粒具有約為IO9至IO11M-1CnT1數(shù)量級的非常高的消光系數(shù)，因此其可用于比色檢測、 光熱和光聲技術(shù)13。盡管最近的研究取得了進(jìn)展14，但光學(xué)活性的無機(jī)納米顆粒仍未實(shí)現(xiàn)廣泛的臨床實(shí)踐，這可能是由于所負(fù)載的藥物通常限于納米粒表面以及出于長期安全性的考慮15_18。相比之下，人們發(fā)現(xiàn)有機(jī)納米顆粒(包括脂質(zhì)體、膠束、納米球和聚合物囊泡 (polymersome))由于穩(wěn)定的安全性、生物利用度和藥物遞送能力而能夠被廣泛應(yīng)用于人類治療18。然而，由于有機(jī)納米顆粒在近紅外處通常不吸收光，因此將它們用作生物光子 (biophotonic)也受到限制。雖然超分子組裝體可由卟啉(強(qiáng)烈吸光的有機(jī)小分子)組成， 但由于穩(wěn)定性、溶解度、或生物光子效用不足，還未將這些構(gòu)建體作為生物工具進(jìn)行全面研究。光動力學(xué)治療將光敏劑與光結(jié)合以消滅不想要的細(xì)胞。與其他疾病治療相比，PDT 提供了僅當(dāng)光和光敏劑相交時才能殺死細(xì)胞，以使得體內(nèi)的其他組織和器官免受損害的優(yōu)勢。在過去幾十年中，PDT已被認(rèn)可為眼部疾病22、皮膚病23，尤其是腫瘤疾病M的多種疾病的可行治療選擇。PDT已成為ー種有用的癌癥治療，其能夠通過單線態(tài)氧產(chǎn)生的細(xì)胞損傷誘導(dǎo)的壞死或凋亡來破壞不想要的細(xì)胞M。由于具有較高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)量及具有較大的消光系數(shù)，卟啉衍生物是使用最廣泛的光敏劑26。然而，由于傳統(tǒng)的卟啉為疏水性分子， 因此通常必須對其進(jìn)行化學(xué)修飾以使其更加親水或必須使用遞送載體。因此，光敏劑的遞送是PDT的重要要素。光敏劑的脂質(zhì)體制劑已被廣泛應(yīng)用27，并且也展現(xiàn)出商業(yè)上的成功 (Novartis 的 Visudyne ；Biotec 的 FoscaruFoslip 禾ロ Fospeg)。雖然PDT與許多其他治療相比副作用較小，但對于更為有效的治療而言，對靶點(diǎn)周圍組織的損傷是一個限制因素。因此，靶向于特定的不想要的細(xì)胞的PDT是ー個有吸引 カ的構(gòu)思。然而，由于在干擾抗體功能之前能夠結(jié)合于抗體的光敏劑數(shù)量較低，因此使用抗體使光敏劑改變方向的嘗試受到阻礙28。通過抗體將負(fù)載有光敏劑的脂質(zhì)體引導(dǎo)至靶點(diǎn)是不切實(shí)際的，這是因?yàn)楣饷魟┰隗w內(nèi)從脂質(zhì)體中迅速重新分布至血清蛋白中。光熱治療是 ー種有希望的疾病治療方法，其中在靶部位將光轉(zhuǎn)化為熱。所產(chǎn)生的熱隨后破壞局部組織。 光聲成像是ー種新興的成像技木，其依賴于納秒脈沖激光和光熱膨脹來產(chǎn)生聲波，該聲波能夠提供任何光學(xué)技術(shù)的最深深度的結(jié)構(gòu)性分辨率。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)ー個方面，提供了包括至少15摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層的納米囊泡，其中該卟啉-磷脂結(jié)合物包含共價連接于脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、嚇啉衍生物或卟啉類似物，優(yōu)選連接于ー個磷脂的sn-Ι位和sn-2位。根據(jù)另ー個方面，提供了一種制備納米囊泡的方法，包括a.將卟啉-磷脂結(jié)合物與緩沖液混合，其中該卟啉-磷脂結(jié)合物包含共價連接于脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、嚇啉衍生物或卟啉類似物，優(yōu)選連接于ー個磷脂的sn-Ι和/或sn-2 位；b.擠出步驟(a)的混合物以產(chǎn)生包含至少15摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層的卟啉-磷脂雙分子層納米囊泡。根據(jù)另ー個方面，提供了一種制備納米囊泡的方法，包括a.將卟啉-磷脂結(jié)合物與緩沖液混合，其中該卟啉-磷脂結(jié)合物包含共價連接于脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、嚇啉衍生物或卟啉類似物，優(yōu)選連接于ー個磷脂的sn-Ι和/或sn-2 位；b.對步驟(a)的混合物進(jìn)行聲處理以產(chǎn)生包含至少15摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層的卟啉-磷脂雙分子層納米囊泡。根據(jù)另ー個方面，提供了ー種在受試者的靶區(qū)域進(jìn)行光動力學(xué)治療的方法，包括a.提供如本文所述的納米囊泡；b.將該納米囊泡給予受試者；和c.使用一定波長的光輻照靶區(qū)域處的納米囊泡，其中該波長的光活化卟啉-磷脂結(jié)合物以產(chǎn)生單線態(tài)氧。根據(jù)另ー個方面，提供了ー種在受試者的靶區(qū)域進(jìn)行光熱治療的方法，包括a.提供如本文所述的納米囊泡；b.將該納米囊泡給予受試者；和c.使用一定波長的光輻照靶區(qū)域處的納米囊泡，其中該波長的光使納米囊泡的溫
度升高。根據(jù)另ー個方面，提供了ー種對受試者的靶區(qū)域進(jìn)行成像的方法，包括a.提供如本文所述的納米囊泡；b.將該納米囊泡給予受試者；和c.使用一定波長的光輻照靶區(qū)域處的納米囊泡，其中該納米囊泡響應(yīng)該波長的光而發(fā)出光聲信號；和d.測量和/或檢測靶區(qū)域處的光聲信號。根據(jù)另ー個方面，提供了ー種對受試者的靶區(qū)域進(jìn)行成像的方法，包括a.提供如本文所述的納米囊泡；b.將該納米囊泡給予受試者；和c.測量和/或檢測靶區(qū)域處的熒光。根據(jù)另ー個方面，提供了本文所述的納米囊泡用于進(jìn)行光動力學(xué)治療的應(yīng)用。
根據(jù)另ー個方面，提供了本文所述的納米囊泡用于進(jìn)行光熱治療的應(yīng)用。根據(jù)另ー個方面，提供了本文所述的納米囊泡用于進(jìn)行光聲成像的應(yīng)用。根據(jù)另ー個方面，提供了本文所述的納米囊泡用于進(jìn)行熒光成像的應(yīng)用。根據(jù)另ー個方面，提供了本文所述的納米囊泡用干與裝載于該納米囊泡內(nèi)的化療藥物(如多柔比星)的遞送相結(jié)合來進(jìn)行光熱治療的應(yīng)用。


通過參照以下描述和附圖能夠更好地理解本發(fā)明的實(shí)施方式。其中圖1示出了焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)合物(表示為Pyro-脂質(zhì))的合成。圖2示出了 Pyro-脂質(zhì)的純度和確認(rèn)。左側(cè)Pyro_脂質(zhì)RP-HPLC色譜，顯示具有較良的純度。右側(cè)Pyro-脂質(zhì)的預(yù)期質(zhì)譜。圖3示出了氧基-細(xì)菌葉綠素-脂質(zhì)的合成。圖4示出了金屬Pyro-脂質(zhì)的生成。圖5出示了鋅和鈀卟啉-脂質(zhì)結(jié)合物的純度和質(zhì)量。左側(cè)畫面示出了 HPLC洗脫， 右側(cè)畫面示出了預(yù)期質(zhì)譜。圖6示出了不同卟啉囊泡的生成。在PBS中，通過使用IOOnm聚碳酸酯膜在濃度為0. 5mg/mL下擠出95%的各種卟啉-脂質(zhì)和5%的聚乙ニ醇-2000結(jié)合的脂質(zhì)(PEG-脂質(zhì))而形成卟啉囊泡。A)各種卟啉囊泡的歸ー化吸收譜。B)各種卟啉囊泡的動態(tài)光散射， 示出了單分散尺寸約為lOOnm。圖7示出了通過聲處理產(chǎn)生的30nm卟啉囊泡。DLS測量顯示，與通過IOOnm聚碳酸酯膜擠出而產(chǎn)生的卟啉囊泡(藍(lán)色)相比，再水化和超聲處理的Pyro-脂質(zhì)產(chǎn)生更小的卟啉囊泡(紅色)。圖8示出了由TEM顯示的卟啉囊泡的結(jié)構(gòu)。乙酸鈾酰染色的卟啉囊泡的透射電子顯微圖。注意到，雙分子層特征在更高放大倍率下較明顯。圖9示出了卟啉囊泡亞單元和結(jié)構(gòu)的示意圖。左側(cè)畫面示出了 Pyro-脂質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以圓形突出顯示磷酰膽堿首基，以六邊形突出顯示卟啉。右側(cè)畫面示出了卟啉囊泡的示意圖。圖10示出了表現(xiàn)出顯著活化電位的卟啉囊泡。A)在PC Chol (3 2)的脂質(zhì)體中Pyro-脂質(zhì)的滴定。FDET代表使用0.5%洗滌劑(Triton X-100)裂解卟啉囊泡后的熒光，代表卟啉的初始熒光。B)卟啉囊泡的活化比具有游歷Pyro-脂質(zhì)或NBD-脂質(zhì)的脂質(zhì)體要高得多。結(jié)合少量PEG-脂質(zhì)產(chǎn)生最高的活化電位。圖11示出了通過卟啉囊泡進(jìn)行的有效光熱轉(zhuǎn)換。使用150mW，670nm的激光輻照 5uL液滴，并使用紅外相機(jī)成像。脂質(zhì)體由標(biāo)準(zhǔn)PC Chol (3 幻組合物形成。右側(cè)的光譜圖例示出了 20C處為紫色，穿過靛青色、藍(lán)色、緑色、黃色、橙色到達(dá)55C處的紅色和粉色。 在上面的兩個畫面中，PBS和脂質(zhì)體示出了藍(lán)色中心。在下面的兩個畫面中，金納米棒和卟啉囊泡示出了紅色中心，穿過橙色和黃色到達(dá)綠色的外緣。圖12示出了卟啉囊泡的較強(qiáng)光聲特性。A)在760nm處氧基細(xì)菌葉綠體卟啉囊泡的靈敏度降至低皮摩范圍。B)卟啉囊泡自組裝體產(chǎn)生光聲信號。當(dāng)使用洗滌劑破壞卟啉囊泡時光聲信號發(fā)生衰減，但在溶液中吸收量相同。C)中等濃度的卟啉囊泡的信號比牛全血高11倍。假定這些卟啉囊泡的濃度為每個卟啉囊泡具有100，000個卟啉-脂分子。誤差條示出了來自10次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖13示出了使用卟啉囊泡作為造影剤對大鼠體內(nèi)前哨淋巴結(jié)進(jìn)行顯影。A)成像的時程。BV標(biāo)記血管，其在動物的爪子中進(jìn)行皮內(nèi)注射卟啉囊泡之前可見。前哨淋巴結(jié) (SLN)和淋巴管(LV)在皮內(nèi)注射15分鐘后即可見。B)2小時后處死大鼠，摘取動物的每側(cè)兩個前哨淋巴結(jié)并進(jìn)行光聲斷層成像。僅可檢測到注射了卟啉囊泡的左側(cè)淋巴結(jié)。來自3 個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。圖14示出了顯示Pyro-脂質(zhì)不具有轉(zhuǎn)變溫度的差示掃描熱量法。在PBS中5mg/ mL的脂質(zhì)濃度下進(jìn)行DSC。圖15示出了通過葉酸配體靶向進(jìn)行的卟啉囊泡的靶向活化的活細(xì)胞成像。在共聚焦顯微術(shù)前使用指定卟啉囊泡孵化KB細(xì)胞2小吋。圖16示出了在表達(dá)葉酸受體的細(xì)胞中卟啉囊泡攝取的經(jīng)固定細(xì)胞成像。在共聚焦顯微術(shù)前使用指定卟啉囊泡孵化KB細(xì)胞2小吋。使用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色。圖17示出了使用靶向卟啉囊泡進(jìn)行PDT處理。使用結(jié)合葉酸的卟啉囊泡或常規(guī)卟啉囊泡孵化KB細(xì)胞4小吋，隨后使用670nm激光在指定光劑量下處理。第二天使用MTT 測定評估細(xì)胞存活率。卟啉囊泡濃度基于每個卟啉囊泡中具有100，000個卟啉-脂質(zhì)分子的假設(shè)。星號表示高光通量和卟啉囊泡濃度產(chǎn)生最多的細(xì)胞殺傷。誤差條示出了n = 4的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖18示出了在KB異種移植小鼠中I. V.注射卟啉囊泡后的熒光活化。注意到，注射后，來自小鼠的熒光信號很少，表明卟啉囊泡被淬滅。在腫瘤攝取后，嚇啉囊泡未被淬滅 (unquench)并可在腫瘤中檢測到熒光。圖19示出了卟啉囊泡在體內(nèi)可進(jìn)行酶生物降解并具有良好的耐受性，a，卟啉囊泡的酶降解。使用l^Triton X-100裂解卟啉囊泡并在PBS中使用脂肪酶孵化。使用 HPLC-MS分析探測降解。使用過氧化物酶孵化純化的焦脫鎂葉綠酸，并通過監(jiān)測在680nm處的吸光度降低來證實(shí)發(fā)生降解。b，靜脈給予1000mg/kg卟啉囊泡或PBS后小鼠的質(zhì)量變化 (平均+/-SD，n = 3)。c，靜脈給予卟啉囊泡或PBS的小鼠的血液檢測參數(shù)(平均+/_SD，n =3)。由于γ球蛋白的某些檢測值結(jié)果小于5U/L，因此所有小于5U/L的值均報(bào)告為5U/ しd，I. V.注射1000mg/kg卟啉囊泡或PBS2周后小鼠指定器官的代表性的蘇木精和曙紅染色部分。圖20示出了卟啉囊泡的主動和被動裝載。a，羧基熒光素(C. F.)的被動裝載。 在250mM C. F.中擠出不含膽固醇的卟啉囊泡(Porph)或含有30mol. %膽固醇的卟啉囊泡 (Choi. Porph.)，并進(jìn)行凝膠過濾以測定C. F.的結(jié)合。^ 0.5% Triton X-100中測定Pyro 的熒光(藍(lán)色)和C. F.的熒光(緑色)以避免淬滅，b，裝載了 C. F.(緑色)的Choi. Porph. (藍(lán)色)的熒光淬滅。在加入0. 5% Triton X-100前(虛線)后(實(shí)線)采集光譜并歸一化至最大熒光，c，借助硫酸銨梯度的多柔比星(Dox.)的主動裝載。(*當(dāng)卟啉囊泡開始洗脫時收集的)不含(Porph)或含有(Choi. Porph. )50mol. %膽固醇的卟啉囊泡的凝膠過濾流分的熒光分析。在0. 5% TritonX-IOO中測定pyro的熒光(藍(lán)色)和Dox.的熒光(緑色) 以避免淬滅。d，在裝載了 Dox.的Choi. Porph.中pyro的熒光淬滅。在加入0. 5% Triton X-100前(虛線)后(實(shí)線)測量歸一化光譜。e，被動裝載C. F.(黑線)或主動裝載多柔比星(灰線)的卟啉囊泡的大小分布。圖21示出了卟啉囊泡作為體內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換器，a,使用便攜式660nm激光進(jìn)行光熱治療配置，b，24小時前I. V.注射PBS或42mg/kg卟啉囊泡的荷KB瘤小鼠中的代表性熱響應(yīng)。激光輻照(1.9W/cm2)60秒后獲得熱成像。c，在60秒激光輻照過程中的最大腫瘤溫度 (每組5只小鼠的平均+/-SD)，d，示出了使用卟啉囊泡的光熱治療的治療應(yīng)答的照片。e， 在指定條件下處理的荷瘤小鼠的存活曲線。當(dāng)腫瘤達(dá)到IOmm大小時處死小鼠(每組η = 5)。
具體實(shí)施例方式本文所描述的“嚇啉囊泡(porphysome) ”；是由磷脂-卟啉結(jié)合物的亞單元自組裝的有機(jī)納米顆粒，其表現(xiàn)出脂質(zhì)體樣結(jié)構(gòu)和裝載能力、結(jié)構(gòu)相關(guān)的納米級光轉(zhuǎn)換特性、優(yōu)異的生物相容性，并且有望用于多種生物光子應(yīng)用。所描述的結(jié)合卟啉亞単元，但卟啉密度較低的其他卟啉囊泡和ニ嵌段共聚物產(chǎn)生較小的消光系數(shù)，并且缺乏產(chǎn)生新型卟啉囊泡特性的特征性的顯著熒光自淬滅2°’21。卟啉通常用于納米結(jié)構(gòu)應(yīng)用中，包括形成樹枝狀聚合物Μ和納米線3°。最近，描述了卟啉的水不溶性球形組裝體31。然而與卟啉囊泡相比，這些納米顆粒具有不同類型的亞単元，顯示出其有助于熒光自淬滅和光轉(zhuǎn)換。在一些實(shí)施方式中，嚇啉囊泡包括卟啉-脂結(jié)合物雙分子層，每個卟啉囊泡包含約100，000個卟啉分子。由于它們由卟啉亞単元形成并穩(wěn)定化，因此能夠利用一組細(xì)胞靶向部分使卟啉囊泡靶向至細(xì)胞。如下進(jìn)ー步詳細(xì)描述的，嚇啉囊泡是高度可變的，其具有由形成不同類型卟啉的能力，具有螯合不同類型金屬的能力，并具有以不同尺寸組成的能力。 此外，卟啉囊泡顯示出新型納米級性能，即在活化前具有高淬滅和光熱轉(zhuǎn)換效率。雖然將卟啉插入到脂質(zhì)體站進(jìn)行光動カ治療(PDT)已經(jīng)引起了關(guān)注，但卟啉囊泡提供2個顯著的優(yōu)勢1)有效載荷(payload)比任何其他脂質(zhì)體PDT制劑高1_2個數(shù)量級， 和2)該方法首次允許將大量光敏劑靶向于體內(nèi)特定位置(其他制劑給予后會重新分配至血漿蛋白)。在卟啉脂中插入各種金屬不干擾卟啉囊泡的形成，并生成穩(wěn)定的鋅和鈀雙分子層卟啉囊泡，其為靶向金屬治療開辟了新途徑。卟啉囊泡可由不同類型的卟啉形成并可調(diào)整為不同大小。卟啉囊泡顯示出前所未有的熒光和單線態(tài)氧活化，數(shù)量級高于先前所描述的任何物質(zhì)。活化前，在高度淬滅狀態(tài)下，卟啉囊泡以與金納米棒相似的光熱轉(zhuǎn)化效率來驅(qū)除(dissipate)激發(fā)光，表明卟啉囊泡能夠用作光熱和光聲探針。在表達(dá)葉酸受體的細(xì)胞中，結(jié)合葉酸的卟啉囊泡的攝取和活化可由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來誘導(dǎo)，并且這些細(xì)胞在隨后的光輻照下被破壞。作為新型、可靶向和具有治療活性的納米顆粒，顯見卟啉囊泡在光動力學(xué)治療和其他研究領(lǐng)域?qū)⒌玫綇V泛應(yīng)用。本文所述的納米囊泡為小囊泡(即泡或囊)，通常小于200nm，由包含磷脂或其衍生物的雙分子層的膜構(gòu)成。然而，使用標(biāo)準(zhǔn)脂技木，本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠生成更大的雙分子層(如巨型單層囊泡)或平面脂質(zhì)雙分子層。根據(jù)ー個方面，提供了ー種包含至少15摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層的納米囊泡，其中該卟啉-磷脂結(jié)合物包含共價連接于脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、嚇啉衍生物或卟啉類似物，優(yōu)選連接于ー個磷脂的sn-Ι位或sn-2位。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，以升高的優(yōu)先順序，納米囊泡包含至少25，34，45，55，65， 75，85和95摩爾％的卟啉-磷脂結(jié)合物。構(gòu)成本發(fā)明所述納米囊泡的卟啉-磷脂結(jié)合物包括卟啉、嚇啉衍生物和卟啉類似物。示例性的卟啉包括血卟啉、原卟啉和四苯基卟啉。示例性的卟啉衍生物包括焦脫鎂葉綠酸、細(xì)菌葉綠素、葉綠素a、苯并卟啉衍生物、四羥基苯基ニ氫卟酚類(ニ氫卟吩類，chlorins)、紅紫素類(purpurin)、苯并ニ氫卟酚類、萘并ニ氫卟酚類、膽綠素類 (verdins)、玫紅素類(rhodins)、酮ニ氫卟酚類、氮雜ニ氫卟酚類、細(xì)菌ニ氫卟酚類、甲苯基卟啉類和苯并細(xì)菌ニ氫卟酚類。卟啉類似物包括擴(kuò)展的卟啉家族成員(如德克薩卟啉類 (texaphyrin)、噻啉類和六元卟啉類(六卟啉類，hexaphyrins))、和卟啉異構(gòu)體(如卟啉烯類、反轉(zhuǎn)卟啉類、酞菁類或萘酞菁類)。優(yōu)選地，擴(kuò)展的卟啉為德克薩卟啉、噻啉或六元卟啉，嚇啉異構(gòu)體為卟啉烯、反轉(zhuǎn)卟啉、酞菁或萘酞菁。如本文所使用的，“磷脂”為具有包含磷酸酯基的親水性首基和具有疏水性脂尾部的脂質(zhì)類。在一些實(shí)施方式中，嚇啉-磷脂結(jié)合物中的磷脂包含磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰絲氨酸或磷脂酰肌醇。優(yōu)選地，磷脂包含12至22個碳的?；鶄?cè)鏈。在一些實(shí)施方式中，嚇啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉為焦脫鎂葉綠酸_a。在另ー種實(shí)施方式中，嚇啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉為細(xì)菌葉綠素衍生物。在一些實(shí)施方式中，嚇啉-磷脂結(jié)合物中的磷脂為1-棕櫚酰-2羥基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿。在一些實(shí)施方式中，嚇啉-磷脂結(jié)合物為Pyro-脂質(zhì)。在其他實(shí)施方式中，該卟啉-磷脂結(jié)合物為氧基細(xì)菌葉綠素脂。在一些實(shí)施方式中，嚇啉通過0至20個碳的碳鏈接頭連接于磷脂上的甘油基。在一些實(shí)施方式中，納米囊泡進(jìn)ー步包括PEG，優(yōu)選PEG-脂，并且進(jìn)一步優(yōu)選 PEG-DSPE0優(yōu)選地，PEG或PEG-脂以約5摩爾％的量存在。在一些實(shí)施方式中，納米囊泡基本為球形，直徑為約30nm至約200nm，優(yōu)選直徑為約IOOnm或直徑為約30nm。在一些實(shí)施方式中，卟啉-磷脂結(jié)合物包含螯合在其中的金屬，可選地為金屬(優(yōu)選Si、Cu或Pd)的放射性同位素?？蓪⒍喾N生物活性劑或治療劑、藥品或藥物包封在卟啉囊泡內(nèi)部。在一些實(shí)施方式中，該納米囊泡進(jìn)一歩包含包封在其中的活性剤，優(yōu)選為治療劑或診斷劑，優(yōu)選為化療劑，如多柔比星。術(shù)語“治療劑”是本領(lǐng)域認(rèn)可的，是指作為生物、生理或藥理活性物質(zhì)的任何化學(xué)物質(zhì)。治療劑也被稱為“藥物”，其實(shí)例在著名參考文獻(xiàn)中有描述，如Merck Index, Physicians Desk Reierence、々:ロ The Pharmacological Basis 01 rherapeutics，并且其包括但不限于藥物；維生素；礦物質(zhì)補(bǔ)充劑；用于治療、預(yù)防、診斷、治愈或緩解疾病或病痛的物質(zhì)；影響身體結(jié)構(gòu)或功能的物質(zhì)；或前藥，當(dāng)將其置于生理環(huán)境后具有生物活性或活性更強(qiáng)?？墒褂酶鞣N形式的治療藥物，其中當(dāng)給予受試者之后，組合物就能夠從受試者中釋放
10至鄰近組織或流體中?！霸\斷”或“診斷劑”為用于診斷的任何化學(xué)物質(zhì)。例如，診斷激包括顯像劑，如含有放射性同位素如銅或锝的顯像劑；含有碘或釓的造影剤；酶，如辣根過氧化物酶、GFPj^ 性磷酸酶、或β-半乳糖苷酶；熒光物質(zhì)，如銪衍生物；發(fā)光物質(zhì)，如N-甲基吖啶衍生物等。在一些實(shí)施方式中，納米囊泡進(jìn)ー步包含靶向分子，優(yōu)選抗體、肽或適體或葉酸。“靶向分子”是能夠?qū)⒓{米囊泡引導(dǎo)至特定靶點(diǎn)的任意分子，例如通過結(jié)合靶細(xì)胞表面的受體或其他分子。靶向分子可以是蛋白、肽、核酸分子、糖或多糖、受體配體或其他小分子。可通過選擇靶向分子來調(diào)節(jié)特異性程度。例如，抗體通常顯示較高的特異性?？贵w可以為多克隆、單克隆、片段、重組體、或單鏈，其中許多可商購獲得或可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地獲得。在一些實(shí)施方式中，納米囊泡的雙分子層進(jìn)一歩包含膽固醇，優(yōu)選包含30-50摩爾％的膽固醇。根據(jù)另ー個方面，提供了制備納米囊泡的方法，包括將卟啉-磷脂結(jié)合物與緩沖液混合，其中該卟啉-磷脂結(jié)合物包含共價連接于脂側(cè)鏈的卟啉、嚇啉衍生物或卟啉類似物，優(yōu)選連接于ー個磷脂的sn-Ι和/或sn-2位；以及擠出該混合物以產(chǎn)生卟啉-磷脂雙分子層納米囊泡，其包含至少15摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層。優(yōu)選地，卟啉-磷脂結(jié)合物包含螯合在其中的金屬。根據(jù)另ー個方面，提供了制備納米囊泡的方法，包括將卟啉-磷脂結(jié)合物與緩沖液混合，其中該卟啉-磷脂結(jié)合物包含共價連接于脂側(cè)鏈的卟啉、嚇啉衍生物或卟啉類似物，優(yōu)選連接于磷脂的sn-Ι和/或sn-2位；以及對該混合物進(jìn)行聲處理以產(chǎn)生卟啉-磷脂雙分子層納米囊泡，其包含至少15摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層。根據(jù)另ー個方面，提供了在受試者的靶區(qū)域進(jìn)行光動力學(xué)治療的方法，包括提供本文所述的納米囊泡；將該納米囊泡給予受試者；以及使用一定波長的光輻照靶區(qū)域的納米囊泡，其中該波長的光可活化卟啉-磷脂結(jié)合物以產(chǎn)生單線態(tài)氧。優(yōu)選地，在未被淬滅狀態(tài)(unquenched state)下輻照納米囊泡。根據(jù)另ー個方面，提供了在受試者的靶區(qū)域進(jìn)行光熱治療的方法，包括提供本文所述的納米囊泡；將該納米囊泡給予受試者；使用一定波長的光輻照靶區(qū)域的納米囊泡， 其中該波長的光可使納米囊泡的溫度升高。優(yōu)選地，在淬滅狀態(tài)下輻照納米囊泡。根據(jù)另ー個方面，提供了對受試者的靶區(qū)域進(jìn)行成像的方法，包括提供本文所述的納米囊泡；將該納米囊泡給予受試者；使用一定波長的光輻照靶區(qū)域的納米囊泡，其中納米囊泡響應(yīng)該波長的光而發(fā)出光聲信號；以及測量和/或檢測靶區(qū)域的光聲信號。根據(jù)另ー個方面，提供了本文所述的納米囊泡用于進(jìn)行光動力學(xué)治療的應(yīng)用。根據(jù)另ー個方面，提供了本文所述的納米囊泡用于進(jìn)行光熱治療的應(yīng)用。根據(jù)另ー個方面，提供了本文所述的納米囊泡用于進(jìn)行光聲成像的應(yīng)用。根據(jù)另ー個方面，提供了本文所述的納米囊泡用于進(jìn)行熒光成像的應(yīng)用。以下實(shí)施例對本發(fā)明的各方面進(jìn)行說明，不限定本文所公開的較寬泛的方面。實(shí)施例材料和方法Pyro-脂質(zhì)(溶血磷脂酰膽堿(16:0)-焦脫鎂葉綠酸)的合成
將以下物質(zhì)中IOmL無水ニ氯甲烷中合并49.6mg(0. lmmoDl-棕櫚酰-2-羥基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(Avanti Polar Lipids)、26· 7mg (0. 05mmol)焦脫鎂葉綠酸 _a(如前所述，純化自 Spirulina Pacifica)、0. 05mmol EDC(Sigma)、0. 025mmol DMAP (Sigma)和1滴DIPEA (Sigma)。氬氣保護(hù)下，于室溫下在暗處攪拌反應(yīng)混合物48小吋。 將溶劑蒸發(fā)，對殘留物進(jìn)行薄層色譜(TLC)純化(預(yù)包被了熒光指示劑的20x 20cm硅膠 TLC板，厚度為1.5mm)。氯仿-甲醇-冰醋酸-水65 25 8 2 (V V)用作溶剤。從板上分離Rf = 0. 4的主條帶并洗脫，得到45%的終產(chǎn)率。借助HPLC和質(zhì)譜確認(rèn)Pyro-脂質(zhì)的純度和成分，隨后在氮?dú)庀赂稍锊⒁訧umol的等份在氬氣中于-20°C下儲存。氧基細(xì)菌葉綠素-脂的合成在室溫下將49. 6mg (0. Immo 1) 1_棕桐酰_2_羥基-sn-甘油基-3_磷酸膽堿、 30. 5mg(0. 05mmol)細(xì)菌脫鎂葉綠酸 _a、0. 05mmol EDC、0. 025mmoIDMAP 和 1 滴 DIPEA 加入IOmL無水DCM中。在氬氣保護(hù)下，于室溫下在暗處攪拌反應(yīng)混合物48小吋。通過與純 Bchl酸相比，TLC顯示仍有Bchl酸的斑點(diǎn)。將溶劑蒸發(fā)，對殘留物進(jìn)行TLC板純化(預(yù)包被了熒光指示劑的20x 20cm硅膠TLC板，厚度為1.5mm)。氯仿-甲醇-冰醋酸-水 65 25 8 2(V V)用作顯影體系。以38%的產(chǎn)率獲得も=0. 4的終產(chǎn)物。同時將終產(chǎn)物氧化以產(chǎn)生氧基Bchl-脂質(zhì)，通過質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)。純化后，通過分析HPLC-MS確認(rèn)純度和質(zhì)譜。將脂質(zhì)進(jìn)行等分，干燥并在氬氣中于_20°C下儲存。金屬Pyr0-脂質(zhì)的生成為了生成螯合金屬的卟啉-脂質(zhì)結(jié)合物，在氬氣下于室溫下在甲醇中將10倍過量的游離醋酸鋅或氯化鈀與Pyro-脂質(zhì)孵化1小吋。通過5次丁醇水提取除去游離金屬。隨后將金屬卟啉脂質(zhì)進(jìn)行等分，干燥并在氬氣中于-20 0C下儲存。通過HPLC和質(zhì)譜證實(shí)金屬的穩(wěn)定結(jié)合、嚇啉脂質(zhì)的純度和確認(rèn)。標(biāo)準(zhǔn)卟啉囊泡的形成在標(biāo)準(zhǔn)制備中，將95摩爾％的卟啉-脂質(zhì)溶于甲醇，5摩爾％的ニ硬脂?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙ニ醇)-2000 (PEG-P^]溶于氯仿，或?qū)?% PEG-PE加上1，2_ ニ硬脂?；?sn-甘油基_3_磷脂酰乙醇胺-N-[葉酸(聚乙 ニ醇)-2000 (葉酸-PEG-P^ ]溶于氯仿，在氮?dú)饬飨赂稍锊⑦M(jìn)一歩在真空下干燥lh。在氬氣中于-20°C下儲存直到使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，150mM NaCl，IOmM磷酸鹽，pH 7.4)水化并進(jìn)行五個冷凍-解凍循環(huán)。在65°C下使用Avanti Mini-Extruder (Avanti迷你擠出機(jī))通過IOOnm孔徑的聚碳酸酯膜擠出卟啉囊泡混懸液15次。在氬氣中于4°C下儲存卟啉囊泡備用。卟啉囊泡的濃度通常為0. 5mg/mL。小型30nm卟啉囊泡的形成為形成小型30nm的卟啉囊泡，使用0. Img卟啉-脂質(zhì)生成純卟啉-脂質(zhì)膜并在氮?dú)夂驼婵障赂稍?。使?00uL水再水化膜并在55°C下聲處理10分鐘。在氬氣中于4°C下儲存小型卟啉囊泡備用。卟啉囊泡大小和形狀的表征使用 Malvern Nanosizer (Malvern納米粒度儀)(Malvern Instruments Ltd.，伍斯特郡，Μ)測量脂質(zhì)體大小。使用PBS稀釋脂質(zhì)體溶液，進(jìn)行三次測量，每次運(yùn)行15次并計(jì)算平均結(jié)果。
卟啉囊泡的活化電位的表征使用2nm 狹縫寬度，借助 Flouromax 熒光計(jì)(Horiba Jobin Yvon, Edison, NJ)記錄發(fā)射光譜。在420nm處激發(fā)含有Pyro和Pyro-脂質(zhì)的脂質(zhì)體，在470nm處激發(fā)含有NBD 的那些。在600nm至750nm和500nm至600nm處分別收集Pyro/Pyro-脂質(zhì)和NBD的熒光強(qiáng)度。通過用0. 5% Triton X_100存在下的熒光除以不存在洗滌劑時的熒光來測定每個樣品的熒光倍數(shù)自淬滅F/ら。卟啉囊泡的光熱性能的表征將五滴uL的指定溶液置于ー塊封ロ膜上并使用150mW輸出的670nm激光進(jìn)行輻照。使用溫度校準(zhǔn)的紅外攝像機(jī)(Mikroshot)監(jiān)測溫度。卟啉囊泡的光聲性能的表征使用可調(diào)諧鈦寶石激光器進(jìn)行光聲測量，如前所述使用超聲轉(zhuǎn)換器對其進(jìn)行設(shè)置 22O在PBS溶液中使用氧基細(xì)菌葉綠素卟啉囊泡在760nm下進(jìn)行測量。將卟啉囊泡的光聲信號與全牛血相比，也與Triton X_100所裂解的卟啉囊泡相比。對于體內(nèi)研究，使用左前爪注射了 100 μ L 9ηΜ卟啉囊泡的Sprague-Dawley大鼠QOOg)進(jìn)行卟啉囊泡的前哨淋巴結(jié)和淋巴管顯影。在注射和光聲測量之前對重要區(qū)域進(jìn)行剃毛。差示掃描量熱法使用Calorimetry Sciences Corp.的 6100 納米差示掃描量熱儀(Lindon，UT)對 PBS中的5mg/ml DMPC，HSPC，溶血PC和Pyro-脂樣品進(jìn)行差示掃描量熱法。測量前將樣品置于真空中30分鐘。對所有樣品采用rC/min的掃描速度。將PBS用作對照，PBS的ー個掃描周期用作基線。對于每種脂類，進(jìn)行三次冷卻和加熱掃描，計(jì)算平均結(jié)果以測定脂類的相變溫度。共聚焦顯微研究在含有10% FBS的無葉酸RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中持續(xù)培養(yǎng)KB細(xì)胞。 成像前一天，將細(xì)胞以每孔40，000個細(xì)胞接種于8室共聚焦室。除去培養(yǎng)基，在不含血清的無葉酸培養(yǎng)基中使用卟啉囊泡孵化細(xì)胞。卟啉囊泡孵化2小時后，使用共聚焦顯微鏡成像。633nm的激光用于激發(fā)熒光。卟啉囊泡和PDT處理后的細(xì)胞存活率在含有10% FBS的無葉酸RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中將KB細(xì)胞接種于96 孔板。37°C下在5% CO2孵化器中孵化IMi后，使用含有卟啉囊泡的RMPI 1640培養(yǎng)基更換該培養(yǎng)基。孵化細(xì)胞4小時后，使用670nm激光通過具有3種不同的光通量(1 Jem—2、5Jem—2、 或IOJenT2)的PDT進(jìn)行處理，通量率為120mWcm，處理時間為0s、2h和60s。24小時后，使用MTT示蹤劑3バ4，5- ニ甲基噻唑-2-基)-2，5- ニ苯基溴化四唑(Invitrogen)評估細(xì)胞存活率。結(jié)果與討論各種卟啉囊泡亞単元的產(chǎn)生開發(fā)了幾種不同的卟啉-脂質(zhì)結(jié)合物并用于形成卟啉囊泡。卟啉囊泡最初由磷脂酰膽堿(16:0)-焦脫鎂葉綠酸(稱為Pyro-脂質(zhì))的亞單元形成。如圖1所示，使用市售溶血磷脂和先前所報(bào)導(dǎo)的在我們實(shí)驗(yàn)室合成的光敏劑焦脫鎂葉綠酸，通過簡單的如前所述的?；磻?yīng)32形成Pyro-脂質(zhì)33。使用HPLC和質(zhì)譜確認(rèn)了化合物的組成和純度(圖幻。除了焦脫鎂葉綠酸外，使用吸收更長波長的細(xì)菌葉綠素合成另ー種卟啉-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，以生成氧基細(xì)菌葉綠素-脂質(zhì)(圖3)。公知多種離子可螯合在卟啉環(huán)內(nèi)34。如圖4所示，為了檢查卟啉囊泡是否可由金屬螯合雙分子層形成，我們簡單地通過將Pyro-脂質(zhì)與過量金屬離子孵化并通過數(shù)次丁醇-水提取除去游離金屬離子而生成各種金屬Pyro-脂質(zhì)。使用HPLC 和質(zhì)譜確認(rèn)了金屬的組成和純度(圖5)。卟啉囊泡的生成和表征使用具有IOOnm聚碳酸酯膜的常規(guī)脂質(zhì)體擠出裝置，通過磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) 水化的卟啉-脂質(zhì)膜可容易的生成卟啉囊泡。對于生物相容性，包括5摩爾％ PEG-脂及95 摩爾％卟啉-脂質(zhì)。已知PEG可穩(wěn)定脂質(zhì)體并使其保持更長的循環(huán)而得到更好的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)35。使用所生成的各種類型的卟啉-脂質(zhì)可成功地?cái)D出卟啉囊泡。如圖6A所示，嚇啉囊泡的吸收光譜根據(jù)所使用卟啉-脂質(zhì)的類型而有所不同。值得注意的是，卟啉囊泡在近紅外范圍具有強(qiáng)烈的吸收，其中標(biāo)準(zhǔn)Pyro-脂質(zhì)卟啉囊泡吸收680nm，氧基細(xì)菌葉綠素卟啉囊泡在比紅外遠(yuǎn)IOOnm的波長處吸收。對于體內(nèi)光學(xué)應(yīng)用，納米顆粒在近紅外波長下發(fā)揮作用是必要的，以避免任意激發(fā)和發(fā)射光散射和被人體組織吸收。由于不同類型的卟啉囊泡在不同波長下吸收，因此適合限于特定波長的應(yīng)用。由于鋅誘導(dǎo)卟啉吸收的移位，因此鋅卟啉囊泡的吸收光譜移位表明鋅完全螯合至卟啉囊泡中。動態(tài)光散射(DLQ用于評估各種卟啉囊泡的大小。如圖6B所示，所有三種類型的卟啉囊泡在IOOnm處均具有較好的粒度分布，并形成高度單分散的納米顆粒。IOOnm卟啉囊泡為高度呵護(hù)需要的尺寸，這是因?yàn)檎J(rèn)為該尺寸為脂質(zhì)體通過提高滲透性和保留作用在腫瘤中蓄積的最佳尺寸％。雖然IOOnm卟啉囊泡可適用于某些目的，但在其他情況下需要使用更小并可擴(kuò)散至所有脈管系統(tǒng)內(nèi)外的囊泡。聲處理通常用于產(chǎn)生小于50nm的脂質(zhì)體。為產(chǎn)生更小的卟啉囊泡，對水化的Pyro-脂質(zhì)膜進(jìn)行10分鐘的聲處理。如圖7所示，該步驟產(chǎn)生穩(wěn)定的30nm卟啉囊泡，遠(yuǎn)小于通過擠出生成的IOOnm卟啉囊泡。雖然DLS表明擠出的卟啉囊泡平均為IOOnm并具有單分散性， 但由于卟啉囊泡代表全新而未被表征的材料，并且仍未證實(shí)卟啉囊泡的確切結(jié)構(gòu)，因此需要更多的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。透射電子顯微鏡(TEM)用于檢查卟啉囊泡，使用醋酸鈾作為負(fù)染色劑。 如圖8所示，嚇啉囊泡的形狀為完美的球形，其特征為在較高TEM放大倍率下卟啉雙分子層清晰可見。在嚴(yán)格染色和TEM成像過程中始終為圓形表明卟啉囊泡高度穩(wěn)定并具有明確的球形結(jié)構(gòu)。由于這些囊泡幾乎完全由結(jié)合卟啉脂質(zhì)構(gòu)成，所觀察的結(jié)構(gòu)為卟啉雙分子層，其形成直徑為IOOnm的球形納米囊泡。根據(jù)所獲得的化學(xué)和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，在圖9中提供了卟啉囊泡的示意圖。左側(cè)示出了 Pyro-脂質(zhì)亞單元的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以紅色圓圓突出顯示磷酰膽堿首基，以藍(lán)色六邊形突出顯示結(jié)合的卟啉基團(tuán)。右側(cè)示出了卟啉囊泡的結(jié)構(gòu)示意圖，使用相同的亞單元顏色表示。之前的工作表明，在IOOnm脂質(zhì)體中約有100，000個脂質(zhì)37’38。由于卟啉囊泡具有與傳統(tǒng)脂質(zhì)體相同的首基，預(yù)計(jì)卟啉囊泡的每個粒子中包含相似數(shù)量的亞單元。由于焦脫鎂葉綠酸的消光系數(shù)非常大(97，OOOM-1CnT1)，估計(jì)裝配的卟啉囊泡的消光系數(shù)約為IO9M-1CnT1或ΙΟ^Τ^πΓ1。 該消光系數(shù)約比量子點(diǎn)高1000至10，000倍，而卟啉囊泡的尺寸僅大2-10倍。由于具有納米結(jié)構(gòu)，嚇啉囊泡在卟啉裝載方面提供許多優(yōu)于傳統(tǒng)脂質(zhì)體的優(yōu)勢。 脂質(zhì)體不能由濃度高于約15摩爾％的游離卟啉形成。在該濃度下脂質(zhì)體不穩(wěn)定，因此必須使用較小的摩爾百分比。由于可結(jié)合100摩爾％的卟啉，嚇啉囊泡的卟啉裝載可實(shí)現(xiàn)10-100倍的提高。當(dāng)給予脂質(zhì)體配制的光敏劑時，光敏劑迅速重新分布至血清蛋白，使脂質(zhì)體靶向的利用不起作用。由光敏劑穩(wěn)定形成卟啉囊泡，從而首次實(shí)現(xiàn)較高有效載荷的光敏劑靶向。卟啉囊泡比傳統(tǒng)抗體結(jié)合的光敏劑載量提高10，000倍，而該傳統(tǒng)抗體結(jié)合的光敏劑限制在每個粒子約10個光敏劑。卟啉囊泡是具有前所未有的活化電位的光敏劑由于卟啉囊泡具有兩個緊挨著的球形卟啉層，在細(xì)胞納入和活化前易于自淬滅。 如圖IOA所示，將Pyro-脂質(zhì)滴定至由PC Chol(比例為3 2)組成的標(biāo)準(zhǔn)脂質(zhì)體中引起活化電位的驚人升高。加入洗滌劑后，由100% Pyro-脂質(zhì)構(gòu)成的卟啉囊泡顯示1300倍的活化。該活化電位的升高根據(jù)Pyro-脂質(zhì)的濃度約成線性。圖IOB示出了由最大量的游離Pyro(15% )形成的脂質(zhì)體僅顯示10倍活化。更高百分比的結(jié)合至脂質(zhì)膜的游離Pyro 在膜水化過程中不能完全溶解。這表明所結(jié)合的游離Pyro在雙分子層中具有任意方向，而卟啉囊泡的卟啉雙分子層實(shí)際上可使納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化。使用具有較高轉(zhuǎn)變溫度的DSPC代替5%的Pyro-脂質(zhì)未顯著改變卟啉囊泡的活化電位。然而，當(dāng)結(jié)合DSPE-PEG吋，活化電位升高至超過1500倍。DSPE-PEG也可提高卟啉囊泡的長期穩(wěn)定性，當(dāng)儲存于4°C下時可在2 個月以上保持穩(wěn)定。此外，PEG可提高藥物的藥代動力學(xué)和生物分布。當(dāng)使用功能性側(cè)鏈不同(Pyro vs NBD)的熒光示蹤脂質(zhì)NBD-脂質(zhì)代替Pyro-脂質(zhì)時，僅觀察到22倍的活化。 DLS表明使用95摩爾％ NBD-脂質(zhì)無法形成穩(wěn)定脂質(zhì)體，強(qiáng)調(diào)了卟啉相互作用在生成穩(wěn)定卟啉囊泡中的穩(wěn)定效應(yīng)。卟啉囊泡的生物相容性接下來我們評估了與卟啉囊泡的潛在臨床應(yīng)用相關(guān)的因素。卟啉囊泡易于發(fā)生酶降解(圖19a)。當(dāng)用洗滌劑和脂肪酶進(jìn)行孵化，磷脂結(jié)構(gòu)裂解，主要芳香產(chǎn)物為焦脫鎂葉綠酸，其為生成卟啉-脂質(zhì)的合成反應(yīng)的起始原料。與葉綠素相同，已知當(dāng)與過氧化物酶和過氧化氫孵化吋，焦脫鎂葉綠酸可酶裂解為無色吡咯。我們通過監(jiān)測卟啉吸收的降低來證實(shí)該降解，并證實(shí)焦脫鎂葉綠酸可由過氧化物酶有效降解。據(jù)我們所知，這是第一例酶生物可降解的光學(xué)活性納米顆粒。接下來我們進(jìn)行了初歩研究，以評估卟啉囊泡的潛在毒性。當(dāng)使用高劑量卟啉囊泡(1000mg/kg)處理小鼠吋，其在兩周內(nèi)基本保持健康，無主要行為改變或體重減輕(圖1%)。在兩周的時間點(diǎn)，處死小鼠并進(jìn)行血液測試(圖19c)。肝功能測試表明小鼠肝功能基本正常，除了膽汁酸和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶略有升高(小于正常上限范圍的 2倍)。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和屬性未受到高劑量卟啉-脂質(zhì)的影響，不干擾內(nèi)源性卟啉(血紅素) 的生理調(diào)節(jié)。白細(xì)胞計(jì)數(shù)未受影響表明即使以高劑量給予小鼠，在兩周時間點(diǎn)處卟啉囊泡仍無免疫原性。對肝、脾和腎的尸體解剖的組織病理學(xué)檢查表明這些器官狀態(tài)良好，并未受到高靜脈卟啉囊泡劑量的影響(圖19d)。卟啉囊泡較大水性核心的裝載卟啉囊泡最顯著的觀察數(shù)據(jù)之ー為較大的水性核心，其具有物質(zhì)裝載(cargo loading)的潛力(圖8)。與通常通過表面吸附或結(jié)合而裝載物質(zhì)的無機(jī)納米顆粒(如金納米顆粒)不同，嚇啉囊泡可自由地填充其整個體積。當(dāng)使用250mM羧基熒光素溶液水化并擠出卟啉囊泡(含有5%PEG-脂質(zhì))吋，通過凝膠過濾測得僅有限量的羧基熒光素穩(wěn)定地夾帶在卟啉囊泡中(圖20a)。由于已知膽固醇可提高化合物在基于磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體中的裝載，我們在配方中包括30摩爾％膽固醇并重復(fù)被動羧基熒光素的裝載。含有膽固醇的
15卟啉囊泡能夠以比缺少膽固醇的卟啉囊泡高20倍的高效率裝載羧基熒光素(圖20a)。在該較高的裝載濃度下，羧基熒光素在卟啉囊泡中發(fā)生自淬滅(圖20b，左側(cè))。此外，P卜啉囊泡仍然幾乎完全自淬滅(圖20b，右側(cè))，表明其保持了特征性光轉(zhuǎn)換行為。如預(yù)期的那樣， 在水化溶液中，羧基熒光素的被動裝載僅夾帶總熒光團(tuán)的ー小部分。最有效的藥物裝載技術(shù)之ー為主動裝載，其利用PH或離子梯度將兩性弱堿性分子聚集至脂質(zhì)體和卟啉囊泡中。 該裝載技術(shù)的重要性體現(xiàn)在臨床實(shí)施的第一種納米顆粒-Doxil 中，其為主動裝載的多柔比星的脂質(zhì)體制劑。我們應(yīng)用硫酸銨梯度法43將多柔比星主動裝載于卟啉囊泡中，其中多柔比星與pyro-脂質(zhì)的摩爾比為1 5。未加入膽固醇吋，通過凝膠過濾可觀察到多柔比星的裝載，但從溶液中納入的總多柔比星分?jǐn)?shù)約為10% (圖20c)。然而，當(dāng)在卟啉囊泡配方中加入50摩爾％膽固醇吋，可實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的主動裝載，并且卟啉囊泡將溶液中所有游離多柔比星的90%裝載至卟啉囊泡核心中。雖然使用了較大摩爾％的膽固醇，但由于預(yù)計(jì)膽固醇僅占據(jù)了磷脂酰膽堿亞單元空間的四分之一44，因此其對卟啉密度的影響是有限的，從而僅略微降低卟啉雙分子層的密度。其由圖20d示出的保持恒定的極限卟啉自淬滅所支持。 除了具有與未裝載卟啉囊泡相似的光轉(zhuǎn)換性能外，主動和被動裝載的卟啉囊泡保持單一分布并且所顯示尺寸為150nm至200nm(圖20e)。卟啉囊泡作為光轉(zhuǎn)換器由研究如金納米棒的高光熱轉(zhuǎn)換效率所示39，對光熱治療領(lǐng)域的興趣日益增長。由于其在細(xì)胞攝取前具有較大的吸收系數(shù)和較高的淬滅態(tài)，對卟啉囊泡的光熱性能進(jìn)行了研究(圖11)。通過溫度校準(zhǔn)的紅外攝像機(jī)可顯示使用670nm激光進(jìn)行150mW的激光輻照吋， PBS或標(biāo)準(zhǔn)PC Chol (3 2)脂質(zhì)體產(chǎn)生顯著的光熱響應(yīng)。當(dāng)使用激光對670nm下吸收為0. 8的金納米棒進(jìn)行輻照吋，可有效產(chǎn)生熱并通過紅外攝像機(jī)檢測。當(dāng)測得卟啉囊泡具有相同吸收時，其產(chǎn)生相似的光熱轉(zhuǎn)換量。因此，雖然產(chǎn)生相似的光熱效應(yīng)，但卟啉囊泡代表非金屬軟納米顆粒，可用于體溫過高和光聲應(yīng)用。事實(shí)上，當(dāng)在體外測量時卟啉囊泡產(chǎn)生非常強(qiáng)烈的光聲信號，可檢測到低至較低的皮摩濃度，在血信號中可容易地檢測到納摩濃度(圖12A和圖12C)。卟啉囊泡具有與金納米顆粒相似的光聲信號，但在生物相容性和藥物裝載方面具有優(yōu)勢。此外，加入洗滌劑可減弱光聲信號，提供了直接證據(jù)證明亞單元的自組裝與生成光轉(zhuǎn)換性能有關(guān)(圖12B)。通過使用卟啉囊泡有效地對大鼠體內(nèi)前哨淋巴結(jié)進(jìn)行顯影而證實(shí)卟啉囊泡作為光聲探針的功效(圖13)。前哨淋巴結(jié)的檢測和檢查為評估乳腺癌轉(zhuǎn)移狀態(tài)的常用步驟，而使用卟啉囊泡進(jìn)行光聲斷層掃描是以高信噪比在體內(nèi)檢測這些前哨淋巴結(jié)的良好方法。卟啉囊泡能夠不依賴靶向配體而清晰地顯影前哨淋巴結(jié)(因此這些淋巴結(jié)可包含或不包含轉(zhuǎn)移癌)。具有合適的靶向配體吋，嚇啉囊泡可進(jìn)ー步攝取至癌細(xì)胞中，導(dǎo)致不淬滅和熒光的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步檢查Pyro-脂質(zhì)的熱性能，使用差示掃描量熱法(圖14)。DMPC和HSPC 的對照脂質(zhì)表現(xiàn)如預(yù)期的，表明轉(zhuǎn)變溫度分別為和52°C。有趣的是，Pyro-脂質(zhì)未表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)變溫度，這表明卟啉囊泡可能不易發(fā)生(傾向干，prone to)當(dāng)脂質(zhì)改變相時發(fā)生的轉(zhuǎn)變溫度。當(dāng)加熱至95°C保儲15分鐘并冷卻至室溫后，卟啉囊泡保持約為IOOnm的良好的粒度分布。這些數(shù)據(jù)共同顯示，卟啉囊泡熱穩(wěn)定并為良好的光熱和光聲轉(zhuǎn)換器。雖然卟啉囊泡具有顯著較高的對卟啉光敏劑的有效載荷，但在其非活性狀態(tài)時其顯示高度的淬滅熒光，表明單線態(tài)氧的產(chǎn)生也發(fā)生淬滅4°。為了顯示卟啉囊泡可在細(xì)胞中靶向和活化，我們靶向葉酸受體，其為在多種癌癥中過表達(dá)的受體41。由于眾所周知KB癌細(xì)胞可表達(dá)葉酸受體，因此使用KB細(xì)胞42。通過納入1摩爾％葉酸-PEG脂，4摩爾％ PEG-脂和 95% Pyro-脂質(zhì)來生成葉酸卟啉囊泡。使用活細(xì)胞共聚焦顯微鏡檢查卟啉囊泡的攝取。如圖15所示，將葉酸標(biāo)記的卟啉囊泡與KB細(xì)胞孵化兩小時后，卟啉囊泡不僅被細(xì)胞攝取，而且由于在活化前基本無熒光，因此較高的熒光信號表明卟啉囊泡在攝取后發(fā)生活化?；罨瘷C(jī)理可能是卟啉囊泡在內(nèi)吞過程中分解。由于熒光去淬滅與單線態(tài)氧去淬滅相關(guān)，因此卟啉囊泡可能在特定靶向后増加其單線態(tài)氧應(yīng)答。缺少葉酸靶向基團(tuán)的卟啉囊泡顯示最小攝取。當(dāng)使用過量葉酸孵化細(xì)胞時未有效攝取葉酸標(biāo)記的卟啉囊泡，顯示攝取機(jī)制的特異性。 我們也利使用核染色和固定細(xì)胞成像檢查了卟啉囊泡的攝取(圖16)。卟啉囊泡的攝取再次依賴葉酸結(jié)合。在活細(xì)胞成像中，嚇啉囊泡從細(xì)胞核中排除，然而在固定細(xì)胞成像吋，ロ卜啉囊泡在細(xì)胞中的分布更為均勻。這可能表明在兩個小時的時間點(diǎn)處，活細(xì)胞中的卟啉囊泡被分隔在內(nèi)涵體中，還需要更多的時間使卟啉囊泡在細(xì)胞中重新分布。當(dāng)將卟啉囊泡靜脈注射于荷瘤小鼠中吋，起初在小鼠中具有微弱的熒光(圖18，左側(cè))。這表明卟啉囊泡最初在體內(nèi)被淬滅。隨著時間的推移，P卜啉囊泡在腫瘤中蓄積并去淬滅(圖18，右側(cè))。這表明卟啉囊泡可用作熒光成像(以及光動カ治療)的低背景探針。為了顯示卟啉囊泡可通過特定的分子靶向機(jī)制殺傷細(xì)胞，使用含有或不含1摩爾％葉酸靶向脂質(zhì)的卟啉囊泡孵化KB細(xì)胞。然后將細(xì)胞暴露于不同激光輻照強(qiáng)度下。如圖17所示，嚇啉囊泡介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷對卟啉囊泡濃度以及光劑量強(qiáng)度具有劑量響應(yīng)性。有效的PDT需要將葉酸脂納入卟啉囊泡中。與共聚焦顯微法結(jié)果一致，當(dāng)孵化過程中加入過量葉酸，葉酸靶向的卟啉囊泡介導(dǎo)的PDT細(xì)胞殺傷受到抑制，證實(shí)了卟啉囊泡靶向和殺傷的特異性。為了證明有機(jī)納米顆粒的生物光子治療潛力，我們接下來使用卟啉囊泡作為光熱治療藥物進(jìn)行初歩實(shí)驗(yàn)。使用輸出750mW的658nm激光(具有1. 9ff/cm2的能量密度)輻照具有異種移植物的小鼠中的KB腫瘤，隨后給予卟啉囊泡(圖21a)。治療前M小時，對小鼠靜脈注射42mg/kg卟啉囊泡。給予卟啉囊泡或PBS 24小時后，使用激光輻照腫瘤1分鐘，并使用熱感攝像機(jī)監(jiān)測溫度(圖21b)。卟啉囊泡組中的腫瘤溫度迅速達(dá)到60°C，而注射PBS的小鼠中的腫瘤限制在40°C (圖21c)。治療后卟啉囊泡和激光治療組的小鼠的腫瘤上形成焦痂，而僅用激光治療組和僅用卟啉囊泡治療組則未形成焦痂。2周后治療組中的焦痂愈合，腫瘤被永久破壞(圖21d)。與使用卟啉囊泡和光治療的小鼠中的腫瘤不同， 僅接受激光治療或卟啉囊泡注射的小鼠中的腫瘤繼續(xù)迅速增長，并且在21天內(nèi)不得不對在那些組中的所有小鼠實(shí)施安樂死(圖21e)。該光熱實(shí)驗(yàn)相當(dāng)于治療指數(shù)至少為25的治療，得到卟啉囊泡的安全性為lg/kg。結(jié)論新型納米顆粒及其所具有的新型性能是日益增長的納米技術(shù)革命背后的推動力。 卟啉囊泡代表了完全不同類型的納米顆粒，其具有新型納米級性能，可很好的適合治療應(yīng)用。卟啉囊泡是易變的并可生成具有不同光學(xué)和尺寸特性的卟啉囊泡。卟啉囊泡可由金屬螯合的雙分子層構(gòu)成，代表靶向金屬傳輸?shù)男峦緩?。由于每個卟啉囊泡可裝配約100,000 個光敏劑，嚇啉囊泡可攜帯前所未有的光敏劑有效載量以進(jìn)行PDT。此外，其為可靶向的，這是光敏劑的傳統(tǒng)脂質(zhì)體制劑所不具備的屬性。細(xì)胞攝取后卟啉囊泡被活化，活化后熒光升高1000倍。卟啉囊泡顯示與光熱轉(zhuǎn)換的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)-金納米棒范圍相同的光熱轉(zhuǎn)換效率，但與金納米棒不同，P卜啉囊泡的為有機(jī)性質(zhì)，可生物降解并在體內(nèi)具有良好的耐受性。與其他光學(xué)活性納米顆粒不同，嚇啉囊泡的較大水性核心可裝載熒光團(tuán)和藥物。除具有多式光子成像能力外，基于其固有的藥物裝載適應(yīng)性以及光動カ和光熱治療，嚇啉囊泡具有較強(qiáng)的治療潛力。雖然本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不違背本發(fā)明精神或所附權(quán)利要求范圍的前提下可對其進(jìn)行修改。以下及本文所提及的所有參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容以引用方式并入本文作為參考。參考文獻(xiàn)1. Chan, W. C. W. &Nie, S. Science 281，2016-2018，1998.2. Storhoff, J. J.，Lucas, A. D.，Garimella, V.，Bao, Y. P. &Muller, U. R. Nat. Biotechnol. 22，883—887，2004.3. Dolmans, D. Ε.，F(xiàn)ukumura, D. &Jain，R. K. Nat. Rev. Cancer 3，380-387，2003.4. 0 ' Neal, D. P.，Hirsch, L. R.，Halas, N. J.，Payne, J. D. &ffest, J. L. Cancer Lett. 209，171-17620045. Huang, X.，El-Sayed, I. H.，Qian, W. &EトSayed，M. A. J. Am. Chem. Soc. 128， 2115-2120,2006.6. Oraevsky, A. A. Proc. SPIE 2676，22—31，1996.7. Oraevsky, A.A.&Karabutov, A. A. BiomedicalPhotonics Handbook,2003ed.； Vo-Dinh, T.，Ed. ；CRC Press =Bocaa Raton,34. 1-34. 34,2003.8. Xu, M. &ffang, L. V. Rev. Sci. Instrum. 77,0411012006.9. Wang, L. V. Nat. Photonics 3，503—509，2009.10. Vakoc, B. J. etal. Nat. Med. 15，1219-1223，2009.11. ffeissleder, R. &Pittet, M. J. Nature 452，580-589，2008.12. Klostranec, J. M. &Chan, W. Adv. Mater. 18，1953—1964，2006.13. Yguerabide，J. &Yguerabide, Ε. E. Anal. Biochem. 262，137—156，1998.14. Lai, S. , Clare, S.E.&Halas, N. J. Accounts ofChemicalResearch41, 1842-1851,2008.15. Ghosh, P. AdvancedDrugDeliveryReviews60,1307-1315，2008.16. Lewinski, N.，Colvin, V. &Drezek, R. Small4，26—49，2008.17. Nel, A.，Xia, T.，Madler，L. &Li, N. Science 311，622-627，2006.18. Peer, D. etal. Nat. Nanotechnol. 2，75ト760，2007.19. Drain, CM.，Varotto, A. &Radivo jevic，J. Chem. Rev. 109，1630—1658，2009.20. Komatsu, Τ. , Moritake, Μ. , Nakagawa, A. &Tsuchida, E. Chem. Eur. J. 8, 5469-5480,2002.21. Ghoroghchian, P. P. etal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102，2922—2927，2005.22. Woodburn, K. W. ；Engelman, C. J. ；Blumenkranz&M. S. Retina (Philadelphia, Pa.),22，391-405，2002.
23. Babiias, P. ；Karrer, S. ；Sidoroif, A. ；Landthaler, M. &bzeimies, R. Photodermato丄ogy, PhotoimmunologyPhotomedicine,21,142-149,2005. Brown, S.B.Lancet Oncology,5,508,2004. Dougherty, Τ.，etal.，J. Natl. Cancer Inst，90，889-905，1998. Sternberg, E. D. ；Dolphin, D. &B riickner, C. Tetrahedron 54,4151-4202,
Chen, B. ；Pogue, B. W. &Hasan, T.Expert Opin. DrugDeliv. 2，477-487，2005. Miller, G. G. ；Lown&J. W. DrugDev. Res. 42，182-197，1997. Matos, M. S. etal.，Macromolecules33,2967—2973，2000. Tsuda, A. &0suka, A.，Science 293，79—82，2001. Wang, L. ；Liu, H. &Hao, J. Chem. Comm. 1353, 2009.
Mason, J. T. ；Broccoli, A. V. &Huang, C. Anal. Biochem. 113，96—101，1981. Zheng,G.etal.Bioconj. Chem. 13,392-396,2002.
Biesaga, M. ；Pyrzynska, K. ；Trojanowicz, M.Talanta 51,209-224,2000. ,Papahadjopoulos etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 11460-11464,
Nagayasu, A. ；Uchiyama, K. &Kiwada,H. AdvancedDrugDeliveryRev. 40, 75-87,
Schnyder, A. ；Krahenbiihl, S. ；Torok,Μ. ；Drewe,J. &Huwyler,J.Biochem. J, 377，61-67，2004.38. Shi，N. &Pardridge, W. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97，7567-7572，2000.39. Huang, X. ；El-Sayed, I. H. ；Qian, W. &EトSayed，M. A. J. Am. Chem. Soc. 128， 2115-2120,2006.40. Lovel 1, J. F etal. J. Phys. Chem. Bl 13, 3203-3211, 2009.41. Sudimack, J. &Lee，R. J. AdvancedDrugDeliveryRev. 41,147-162,2000.42. Lee, R. J. &Low, P. S. J. Biol. Chem. 269，3198—3204，1994.43. Haran , G. , Cohen , R. , Bar , L.K.&Barenholz, Y. Biochimica etBiophysicaActa-Biomembranes 1151,201-215,1993.44. Hansen, C. B. ，Kao, G. Y. ，Moase, Ε. H. ，Zalipsky, S. Mllen, Τ. Μ. Biochimica et BiophysicaActaBiomembranes 1239,133-144,1995。24,
25,
26,1998.
27,
28,
29,
30
31
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361999.
37,
權(quán)利要求
1.ー種納米囊泡，其包含至少15m0l%的卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物包含共價連接于脂質(zhì)側(cè)鏈的ー個卟啉、卟啉衍生物或卟啉類似物，優(yōu)選連接于ー個磷脂的sn-Ι位或sn-2位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米囊泡，其包含至少25摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米囊泡，其包含至少35摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米囊泡，其包含至少45摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米囊泡，其包含至少55摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米囊泡，其包含至少65摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米囊泡，其包含至少75摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米囊泡，其包含至少85摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米囊泡，其包含至少95摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉、嚇啉衍生物或卟啉類似物選自由血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脫鎂葉綠酸、細(xì)菌葉綠素、葉綠素a、苯并卟啉衍生物、四羥基苯基ニ氫卟酚、紅紫素、苯并ニ氫卟酚、萘并ニ氫卟酚、膽綠素、玫紅素、酮ニ氫卟酚、氮雜ニ氫卟酚、細(xì)菌ニ氫卟酚、甲苯基卟啉、苯并細(xì)菌ニ氫卟酚、擴(kuò)展的卟啉和卟啉異構(gòu)體組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的納米囊泡，其中，所述擴(kuò)展的卟啉為德克薩卟啉、噻啉或六元卟啉，所述卟啉異構(gòu)體為卟啉烯、反轉(zhuǎn)卟啉、酞菁或萘酞菁。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的磷脂包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或磷脂酰肌醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的納米囊泡，其中，所述磷脂包含12至22個碳的酰基側(cè)鏈。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉為焦脫鎂葉綠酸_a。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉為細(xì)菌葉綠素衍生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的磷脂為1-棕櫚酰-2-羥基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物為焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物為氧基細(xì)菌葉綠素脂質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述卟啉通過0至20個碳的碳鏈接頭連接于磷脂上的甘油基。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，進(jìn)ー步包含PEG。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，進(jìn)ー步包含PEG-脂質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，進(jìn)ー步包含PEG-DSPE。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述PEG或PEG-脂質(zhì)以約5 摩爾％的量存在。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述納米囊泡基本為球形，直徑為約30nm至約200nm。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述納米囊泡基本為球形，直徑為約lOOnm。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述納米囊泡基本為球形，直徑為約30nm。
27.根據(jù)權(quán)利要求1- 中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物包含螯合在其中的金屬，可選地為金屬的放射性同位素。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的納米囊泡，其中，所述金屬選自由Zn、Cu和Pd組成的組。
29.根據(jù)權(quán)利要求1- 中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，進(jìn)ー步包括包封在其中的活性剤， 優(yōu)選為治療劑或診斷劑，優(yōu)選為化療劑如多柔比星。
30.根據(jù)權(quán)利要求1- 中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，進(jìn)ー步包含靶向分子，優(yōu)選抗體、肽或適體。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的納米囊泡，其中，所述靶向分子為葉酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的納米囊泡，其中，所述雙分子層進(jìn)一歩包含膽固醇，優(yōu)選包含30-50摩爾％的膽固醇。
33.一種用于制備納米囊泡的方法，包括a.將卟啉-磷脂結(jié)合物與緩沖液混合，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物包括共價連接于脂質(zhì)側(cè)鏈的卟啉、嚇啉衍生物或卟啉類似物，優(yōu)選連接于ー個磷脂的sn-Ι位和/或sn-2位；b.擠出步驟(a)所述的混合物以產(chǎn)生卟啉-磷脂雙分子層納米囊泡，其包含至少15摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物包括螯合在其中的金/禹ο
35.一種用于制備納米囊泡的方法，包括a.將卟啉-磷脂結(jié)合物與緩沖液混合，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物包括共價連接于脂質(zhì)側(cè)鏈的卟啉、嚇啉衍生物或卟啉類似物，優(yōu)選連接于ー個磷脂的sn-Ι位和/或sn-2位；b.對步驟(a)的所述混合物進(jìn)行聲處理以產(chǎn)生卟啉-磷脂雙分子層納米囊泡，其包含至少15摩爾％卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層。
36.ー種在受試者的靶區(qū)域進(jìn)行光動力學(xué)治療的方法，包括a.提供如權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的納米囊泡；b.將所述納米囊泡給予受試者；和c.使用一定波長的光輻照靶區(qū)域的納米囊泡，其中，所述波長的光可活化卟啉-磷脂結(jié)合物以產(chǎn)生單線態(tài)氧。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，在淬滅狀態(tài)下輻照所述納米囊泡。
38.ー種在受試者的靶區(qū)域進(jìn)行光熱治療的方法，包括a.提供如權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的納米囊泡；b.將所述納米囊泡給予受試者；和c.使用一定波長的光輻照靶區(qū)域的納米囊泡，其中，所述波長的光可使所述納米囊泡的溫度升高。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中，在淬滅狀態(tài)下輻照所述納米囊泡。
40.ー種對受試者的靶區(qū)域進(jìn)行成像的方法，包括a.提供如權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的納米囊泡；b.將所述納米囊泡給予受試者；和c.使用一定波長的光輻照靶區(qū)域的納米囊泡，其中所述納米囊泡響應(yīng)該波長的光而發(fā)出光聲信號；和d.測量和/或檢測靶區(qū)域的光聲信號。
41.ー種對受試者的靶區(qū)域進(jìn)行成像的方法，包括a.提供如權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的納米囊泡；b.將所述納米囊泡給予受試者；和c.測量和/或檢測靶區(qū)域的熒光。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的納米囊泡用于進(jìn)行光動力學(xué)治療的應(yīng)用。
43.根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的納米囊泡用于進(jìn)行光熱治療的應(yīng)用。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的納米囊泡用于進(jìn)行光聲成像的應(yīng)用。
45.根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的納米囊泡用于進(jìn)行熒光成像的應(yīng)用。
46.根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的納米囊泡用干與裝載于所述納米囊泡內(nèi)的化療藥物如多柔比星的遞送相結(jié)合來進(jìn)行光熱治療的應(yīng)用。
全文摘要
本申請涉及包含至少15mol％的卟啉-磷脂結(jié)合物的雙分子層的納米囊泡，其中該結(jié)合物包括共價連接于磷脂側(cè)鏈的卟啉、卟啉衍生物或卟啉類似物。該納米囊泡可用于光熱治療、光聲成像和熒光成像。本申請還公開了制備該納米囊泡的方法。
文檔編號A61K47/24GK102573914SQ201080046737
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者喬納森·F·洛弗爾, 鄭崗 申請人:大學(xué)健康網(wǎng)絡(luò)