專利名稱：一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，具體涉及一種狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
研究顯示，血腦屏障的存在對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)有著至關(guān)重要的作用，但同時，其也阻礙了診斷或治療藥物向腦內(nèi)的有效遞送。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，血腦屏障的主要成分是腦毛細血管內(nèi)皮細胞，其特點是細胞間有致密的緊密連接，絕大多數(shù)物質(zhì)難以通過；而另外一方面，一些內(nèi)源性的蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)可通過結(jié)合特定受體，利用受體介導(dǎo)的穿細胞作用，跨過血腦屏障，到達腦內(nèi)；此外，一些病原體如狂犬病毒也可通過特定的受體，跨過血腦屏障，引起腦內(nèi)感染。有研究發(fā)現(xiàn)，一種由狂犬病毒糖蛋白衍生的29個氨基酸的多肽RVG29保留了與血腦屏障上特異受體結(jié)合的特性，因此采用RVG29多肽修飾藥物遞釋系統(tǒng)，可實現(xiàn)高效的腦靶向遞釋；并且由于神經(jīng)元細胞也表達有特異性的受體，RVG29修飾的藥物遞釋系統(tǒng)跨過血腦屏障后，將有利于進一步靶向神經(jīng)元，對于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病等有
重要意義。聚酰胺胺樹枝狀分子(PAMAM)是近年來發(fā)展應(yīng)用的一類新型陽離子樹枝狀聚合物大分子，其特征為納米級的尺寸，表面有豐富氨基，一方面有利于進行進一步的修飾，另一方面由于其在生理條件下帶有正點荷，可與負電性的質(zhì)粒DNA復(fù)合，通過靜電相互作用自組裝成載基因納米粒，起到保護質(zhì)粒DNA在循環(huán)過程中不被酶類降解。有研究表明，通過親水性聚合物可將陽離子樹枝狀大分子與腦靶向多肽進行連接，同時親水性聚合物也可延長載基因納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時間，減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的非特異性攝取，減少非靶組織的攝取，進而降低給藥系統(tǒng)的副作用。但目前腦部基因遞釋存在的種種局限，現(xiàn)急需一種新型的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，該遞釋系統(tǒng)可增加納米基因遞釋系統(tǒng)在體外血腦屏障模型的攝取和穿過效率，提聞納米基因遞釋系統(tǒng)在動物腦內(nèi)的畜積，進而提聞報告基因在腦內(nèi)的表達量，實現(xiàn)基因跨過血腦屏障向腦內(nèi)的遞釋。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，尤其是一種狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)及其制備方法。本發(fā)明的遞釋系統(tǒng)為一種新型的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29修飾的陽離子樹枝狀大分子包載基因的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明利用陽離子樹枝狀大分子材料的高度分枝特性，在其表面進行聚乙二醇PEG化修飾，既作為連接劑，利于后續(xù)靶向多肽的修飾，也可中和陽離子樹枝狀大分子表面的正電性，以降低其毒性，延長基因遞釋系統(tǒng)在體內(nèi)的循環(huán)時間，同時使用極具臨床應(yīng)用潛力的腦靶向頭基——RVG29多肽修飾陽離子樹狀大分子材料，增加納米基因遞釋系統(tǒng)在體外血腦屏障|旲型的攝取和穿過效率，提聞納米基因遞釋系統(tǒng)在動物腦內(nèi)的畜積，進而提聞報告基因在腦內(nèi)的表達量，實現(xiàn)基因跨過血腦屏障向腦內(nèi)的遞釋。具體而言，本發(fā)明的一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，由腦靶向載體和編碼特定基因的質(zhì)粒DNA構(gòu)成，所述的腦靶向載體由陽離子樹狀大分子材料、親水性聚合物和RVG29組成。本發(fā)明中，采用狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29作為腦靶向頭基，陽離子樹枝狀大分子為載體材料，通過親水性聚合物連接RVG29多肽構(gòu)建新型腦靶向載體；所述的腦靶向載體再進一步通過靜電復(fù)合作用與編碼特定基因的質(zhì)粒DNA復(fù)合，制成腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)。其中，所述的腦靶向載體為RVG29修飾的樹枝狀大分子腦靶向載體，是以陽離子樹枝狀大分子材料、親水性聚合物和RVG29多肽為組分，三者以共價方式連接制成；所述的親水性聚合物與陽離子樹狀大分子材料的分子比是I 20 I ；所述的RVG29多肽與陽離子樹狀大分子材料的分子比為I 10 : I ;所述的腦靶向載體與質(zhì)粒DNA復(fù)合的質(zhì)量之比是3 10 I ；所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29多肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)，具有SEQ ID NO. I的序列。本發(fā)明中，所述的腦靶向載體通過下述方法制備陽離子樹枝狀大分子材料和親水性聚合物以I : I 20的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應(yīng)60 180分鐘，兩種分子中含有的基團發(fā)生特異性反應(yīng)，生成陽離子樹枝狀大分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物并更換為pH值6. 8 7. 2磷酸鹽緩沖液；同時，RVG29多肽以I 10 I的分子比與陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物上的特異基團室溫攪拌反應(yīng)12 36小時后生成陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物-RVG29，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的RVG29多肽，制得腦革El向載體。本發(fā)明中，所述的陽離子樹枝狀大分子材料選自樹枝狀聚賴氨酸(dendrigraftpoly-L-lysines DGLs,簡稱 DGLs)和聚酸胺-胺(polyamidoamine,簡稱 PAMAM)；所述的親水性聚合物為聚乙二醇(polyethyleneglycol,簡稱PEG)。本發(fā)明中，將質(zhì)粒DNA溶于50mM硫酸鈉溶液中，所述腦載體溶液與DNA溶液以摩爾比3 10 I混合后，渦旋30s，制得腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)。本法明的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)適用于將特定基因質(zhì)粒經(jīng)靜脈給藥形成，通過血腦屏障，遞釋入腦內(nèi)。本發(fā)明采用氫核磁共振技術(shù)對腦靶向載體進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果顯示，所述的樹狀大分子與含有雙功能基團的PEG (琥珀酰亞胺-PEG3500-馬來酰亞胺)反應(yīng)后在3. 6ppm處出現(xiàn)PEG的特征吸收峰，表明樹狀大分子-PEG合成成功；樹狀大分子-PEG進一步與RVG29多肽反應(yīng)后在2. 2ppm至3. 3ppm出現(xiàn)RVG29與PAMAM的質(zhì)子峰，證明腦靶向載體三個成分均已連接成功。本發(fā)明通過瓊脂糖凝膠電泳對腦靶向載體包載質(zhì)粒DNA的能力進行驗證，結(jié)果顯示，在載體與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比在10 I時，未見明顯DNA遷移，表明腦靶向載體可對質(zhì)粒DNA進行完全包封，起到保護DNA的目的。本發(fā)明的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)與未修飾腦靶向頭基的系統(tǒng)包載熒光標記的質(zhì)粒DNA后，分別孵育腦毛細血管內(nèi)皮細胞，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，腦靶向組的攝取明顯高于非靶向組，且所述的攝取依賴于RVG29多肽修飾。本發(fā)明的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)孵育腦毛細血管內(nèi)皮細胞后，對于內(nèi)涵體進行染色，顯示腦靶向基因遞釋系統(tǒng)主要通過內(nèi)吞途徑進入細胞。
本發(fā)明通過體外血腦屏障模型驗證了放射標記的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)的穿越腦毛細血管內(nèi)皮細胞單層膜的效率顯著過于非靶向組，而與此同時在實驗整個過程中由腦毛細血管內(nèi)皮細胞組成的單層血腦屏障模型保持完整。本發(fā)明利用活體成像儀考察腦靶向基因遞釋系統(tǒng)在裸鼠體內(nèi)分布特性，經(jīng)尾靜脈給藥后，結(jié)果顯示腦靶向組在腦部的蓄積明顯高于非靶向組，結(jié)果表明，RVG29多肽可高效的介導(dǎo)腦靶向基因遞釋系統(tǒng)的入腦。本發(fā)明所制備的載有報告基因綠熒光蛋白的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)經(jīng)尾靜脈給藥后，表達48小時進行灌流和冰凍腦切片，熒光顯微鏡下觀察綠熒光蛋白在腦內(nèi)各區(qū)域的表達，結(jié)果顯示，RVG29多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)可有效的介導(dǎo)報告基因在腦部各主要區(qū)域包括皮層、海馬、紋狀體和黑質(zhì)的表達，表達量高于未修飾RVG29多肽的非靶向組。本發(fā)明所制備的載有報告基因熒光素酶的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)經(jīng)尾靜脈給藥后，表達48小時進行處死，取出腦組織，通過超聲等步驟提取出熒光素酶后，加入過量的底物，通過化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，定量的與非靶向組比較報告基因的表達效率，結(jié)果顯示，腦靶向基因遞釋系統(tǒng)可有效的介導(dǎo)報告基因在腦部的聞表達。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點及特征利用陽離子樹枝狀大分子材料的高度分枝特性，在其表面進行聚乙二醇PEG化修飾，既作為連接劑，利于后續(xù)靶向多肽的修飾，也可中和陽離子樹枝狀大分子表面的正電性，以降低其毒性，延長基因遞釋系統(tǒng)在體內(nèi)的循環(huán)時間，同時使用極具臨床應(yīng)用潛力的腦靶向頭基——RVG29多肽修飾陽離子樹狀大分子材料，增加納米基因遞釋系統(tǒng)在體外血腦屏障1旲型的攝取和穿過效率，提聞納米基因遞釋系統(tǒng)在動物腦內(nèi)的畜積，進而提聞報告基因在腦內(nèi)的表達量，實現(xiàn)了基因跨過血腦屏障向腦內(nèi)的遞釋，為診斷和治療基因的腦部應(yīng)用提供了一種高效和安全的策略。


圖I為本發(fā)明的核磁共振圖譜，其中，A PAMAM-PEG ；B :PAMAM_PEG_RVG29。圖2顯示了本發(fā)明凝膠電泳考察不同載體包載基因的納米粒的遷移情況，其中，M :核酸分子量標準；A :質(zhì)粒 DNA ；B PAMAM/DNA ；C PAMAM-PEG/DNA ；D:PAMAM-PEG-RVG29/DNA。圖3顯示了腦毛細血管內(nèi)皮細胞(BCECs)對RVG29修飾前后的納米粒的攝取情況比較，其中，A PAMAM-PEG/DNA 在 37 °C 的攝取圖；B PAMAM-PEG-RVG29/DNA 在 37 O 的攝取圖；C PAMAM-PEG-RVG29/DNA 在 4°C 的攝取圖；D PAMAM-PEG/DNA在預(yù)孵育過量游離RVG29肽后的攝取圖；E PAMAM-PEG-RVG29/DNA在預(yù)孵育過量游離RVG29肽后的攝取圖。圖4為不同抑制劑對PAMAM-PEG-RVG29/DNA的腦毛細血管內(nèi)皮細胞攝取影響的考察情況，其中， A PAMAM-PEG-RVG29/DNA 的攝取圖；B PAMAM-PEG-RVG29/DNA在預(yù)孵育過量游離GABA后的攝取圖；C PAMAM-PEG-RVG29/DNA在預(yù)孵育過量游離GABA后的攝取圖；D PAMAM-PEG-RVG29/DNA在預(yù)孵育過量乙酰膽堿后的攝取圖；E PAMAM-PEG-RVG29/DNA在預(yù)孵育過量美加明后的攝取圖；F PAMAM-PEG-RVG29/DNA在預(yù)孵育過量尼古丁后的攝取圖；G PAMAM-PEG-RVG29/DNA在預(yù)孵育過量氧化苯砷后的攝取圖；H PAMAM-PEG-RVG29/DNA在預(yù)孵育過量秋水仙堿后的攝取圖；I :PAMAM-PEG-RVG29/DNA在預(yù)孵育過量菲力平后的攝取圖。圖5顯示了激光共聚焦顯微鏡觀察PAMAM-PEG-RVG29/DNA攝取15min和60min后在腦毛細血管內(nèi)皮細胞中的分布情況，其中，A :孵育15min后,酸性內(nèi)體的突光信號；B :孵育 15min 后，PAMAM-PEG-RVG29/DNA 的熒光信號；C :孵育15min后，酸性內(nèi)體與PAMAM-PEG-RVG29/DNA的熒光信號疊加圖；D :孵育60min后，酸性內(nèi)體的熒光信號；E :孵育 60min 后，PAMAM-PEG-RVG29/DNA 的熒光信號；F 孵育60min后，酸性內(nèi)體與PAMAM-PEG-RVG29/DNA的熒光信號疊加圖。圖6顯示了在腦毛細血管細胞單層構(gòu)成的體外血腦屏障模型上考察納米粒的跨膜效率，其中，A =125I標記的納米的跨膜速率隨時間變化曲線；B =14C標記蔗糖清除體積隨時間變化曲線。圖7顯示了納米基因遞釋系統(tǒng)在裸鼠體內(nèi)的分布情況，其中，A 經(jīng)尾靜脈給藥80min后，PAMAM/DNA納米粒的分布情況；B :經(jīng)尾靜脈給藥80min后，PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒的分布情況。圖8顯示了定性考察不同納米粒經(jīng)尾靜脈給藥后綠熒光蛋白基因在Balb/c小鼠腦內(nèi)的表達情況，其中，A PAMAM/DNA給藥組，紋狀體區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；B PAMAM/DNA給藥組，海馬區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；C PAMAM/DNA給藥組，黑質(zhì)區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；D PAMAM-PEG/DNA給藥組，皮層區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；E PAMAM-PEG/DNA給藥組，海馬區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；
F PAMAM-PEG/DNA給藥組，黑質(zhì)區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；G PAMAM-PEG/DNA給藥組，皮層區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；H PAMAM-PEG-RVG29/DNA給藥組，皮層區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；I PAMAM-PEG-RVG29/DNA給藥組，海馬區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；J PAMAM-PEG-RVG29/DNA給藥組，黑質(zhì)區(qū)域綠熒光蛋白表達情況；K PAMAM-PEG-RVG29/DNA給藥組，皮層區(qū)域綠熒光蛋白表達情況。圖9顯示了定性考察不同納米粒經(jīng)尾靜脈給藥后蟲熒光素酶基因在Balb/c小鼠體內(nèi)表達情況，其中，
A PAMAM/DNA, PAMAM-PEG/DNA 和 PAMAM-PEG-RVG29/DNA 分別給藥后，腦內(nèi)的蟲熒光素酶活性的比較，以光子數(shù)/毫克蛋白表示； B PAMAM/DNA, PAMAM-PEG/DNA 和 PAMAM-PEG-RVG29/DNA 分別給藥后，其他主要臟器包括心、肝、脾、肺和腎中蟲熒光素酶活性的比較，以光子數(shù)/毫克蛋白表示。
具體實施例方式實施例I取2mg聚酰胺-胺(PAMAM, 77. 35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入O. 48mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，lmg/ml O. 035M pH 8. O磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為I 2，于室溫攪拌反應(yīng)2h，NHS基團與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，制成核磁共振氫譜表征載體的合成。實施例2取2mg聚酰胺-胺(PAMAM, 77. 35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入O. 48mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，lmg/ml O. 035M pH 8. O磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為I 2，于室溫攪拌反應(yīng)2h，NHS基團與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺_胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. O磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入O. 23mg RVG29多肽(2mg/ml pH 7. O磷酸鹽溶液)，與PAMAM摩爾比例為I : I，室溫攪拌反應(yīng)24h，MAL基團與RVG29多肽半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-RVG29)復(fù)合物，MWCO 10000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的RVG29多肽，核磁共振氫譜表征靶向載體的合成，結(jié)果如圖I所示。實施例3取2mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，制成載體溶液。將質(zhì)粒DNA溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成O. Img/ml，使與聚酰胺-胺的摩爾比為I : 10，室溫條件下渦旋30s，制成載基因的非靶向PAMAM/DNA納米粒。實施例4取2. 48mg聚酰胺-胺-聚乙二醇復(fù)合物溶液。將質(zhì)粒DNA溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成O. lmg/ml，使與聚酰胺-胺的摩爾比為I : 10，室溫條件下渦旋30s，制成載基因的非靶向PAMAM-PEG/DNA納米粒。
實施例5 取2. 7Img聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-RVG29)載體溶液。將質(zhì)粒DNA溶解在50mM硫酸鈉溶液中，稀釋成O. lmg/ml，使與聚酰胺-胺的摩爾比為I : 10，室溫條件下渦旋30s，制成載基因的靶向PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒。
實施例6按照實施例4和實施例5法分別新鮮制備載基因的非靶向PAMAM/DNA和PAMAM-PEG/DNA納米粒，以及靶向PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒；稱取O. 14g瓊脂糖于三角燒瓶中，加入電泳液I X TAE，微波加熱至沸，使瓊脂糖完全溶解，室溫放置約50度，加入10μ I 500ug/ml溴乙啶，倒入電泳槽中，置入梳子，冷凝成凝膠。將各組樣品加入至凝膠中，開啟電源，電壓為100V，約25min停止，紫外燈下觀察載體對質(zhì)粒DNA的包封效率，如圖2所示，結(jié)果表明三種載體均可以有效包封質(zhì)粒DNA，未見DNA遷移。實施例7小鼠腦毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在含有20 %胎牛血清，100單位/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，I %谷氨酰胺，O. 01 %神經(jīng)營養(yǎng)因子和40單位/ml肝素鈉注射液的DMEM培養(yǎng)基，在37度5% 二氧化碳濕度條件下培養(yǎng)。實施例8將質(zhì)粒溶液以氨基丁三醇-鹽酸緩沖液(Tris*HCI，pH8. 5)稀釋至lmg/ml，核酸標記探針EMA以純水稀釋至O. lmg/ml,將質(zhì)粒溶液與探針EMA稀釋液按體積比I : 9混合，室溫避光孵育30min，不時混勻。將混合液以小液滴的形式平鋪于保鮮膜表面，置于紫外燈下(波長365nm)照射lh。收集混合液滴于離心管中，以移液器確定準確體積，加入適量無水乙醇，使混合液與乙醇的體積比為3 7，適當(dāng)渦旋，使其混合均勻，室溫避光放置15min，以21，000g的離心力離心20min，使熒光標記的質(zhì)粒EMA-DNA復(fù)合物沉淀，棄上清，沉淀以50mM硫酸鈉溶液中復(fù)溶，稀釋成O. lmg/ml，制成EMA-DNA溶液。實施例9取2mg聚酰胺-胺(PAMAM, 77. 35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入O. 48mg聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，lmg/ml O. 035M pH 8. O磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為I 2，于室溫攪拌反應(yīng)2h，NHS基團與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500);取211^聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入 O. 48mg 聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，lmg/ml O. 035M pH 8. O 磷酸鹽溶液)，二者摩爾比例為I : 2，于室溫攪拌反應(yīng)2h，NHS基團與PAMAM表面的氨基特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG)復(fù)合物溶液，MWCO 10000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG3500)，pH 7. O磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入O. 23mgRVG29多肽(2mg/ml pH 7. O磷酸鹽溶液)，與PAMAM摩爾比例為1:1，室溫攪拌反應(yīng)24h，MAL基團與RVG29多肽半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生特異性的反應(yīng)，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-RVG29)復(fù)合物，MWCO 10000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的RVG29多肽。取2. 48mg聚酰胺-胺-聚乙二醇復(fù)合物(PAMAM-PEG)溶液與EMA-DNA溶液復(fù)合，使與聚酰胺-胺的摩爾比為I : 10，室溫條件下渦旋30s，制成載基因的非靶向的熒光標記的 PAMAM-PEG/DNA 納米粒。取2. 7Img聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-RVG29)載體溶液與EMA-DNA溶液混合，使與聚酰胺-胺的摩爾比為I : 10，室溫條件下渦旋30s，制成載基因靶向熒光標記的 PAMAM-PEG-RVG29/DNA 納米粒。實施例10將5萬個腦毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在24孔板上，48h后顯微鏡下觀察匯合度，給予上述熒光標記的納米粒孵育60min，用Hank’ s液替換掉藥液，熒光顯微鏡下觀察各組中熒光標記納米粒的攝取情況。結(jié)果如圖3中A和B所示，腦毛細血管內(nèi)皮細胞對靶向納米粒PAMAM-PEG-RVG29/DNA的攝取高于非靶向納米粒PAMAM-PEG/DNA的攝取。
實施例11將5萬個腦毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在24孔板上，48h后顯微鏡下觀察匯合度，吸去培養(yǎng)基，加入290ul的RVG29多肽溶液(2mg/ml，Hank’ s液)預(yù)孵育lOmin，吸去RVG29多肽溶液，分別加入非靶向的熒光標記的PAMAM-PEG/DNA納米粒和靶向熒光標記的PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒溶液，繼續(xù)孵育60min，用Hank’ s液替換掉藥液，熒光顯微鏡下觀察熒光標記納米粒的攝取情況。結(jié)果如圖3中D和E所示顯示，腦毛細血管內(nèi)皮細胞對靶向納米粒PAMAM-PEG-RVG29/DNA的攝取明顯減少，而對非靶向納米粒PAMAM-PEG/DNA的攝取沒有變化，結(jié)果表明，靶向納米粒的入胞增加是由于RVG29多肽介導(dǎo)的。實施例12將5萬個腦毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿上，48h后顯微鏡下觀察匯合度，將培養(yǎng)皿置于4°C冰箱中平衡20min，靶向熒光標記的PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒溶液同樣置于4°C冰箱中平衡20min，加入靶向熒光標記的PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒溶液，繼續(xù)在4°C孵育60min，用Hank’ s液替換掉藥液，熒光顯微鏡下觀察熒光標記納米粒的攝取情況。結(jié)果如圖3中C所示，腦毛細血管內(nèi)皮細胞對靶向納米粒PAMAM-PEG-RVG29/DNA的攝取在4°C時受到顯著抑制。實施例13將5萬個腦毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在24孔板上，48h后顯微鏡下觀察匯合度，吸去培養(yǎng)基，加入200ul的Y-氨基丁酸(GABA)溶液，乙酰膽堿(acetylcholine)溶液，美加明(mecamylamine)溶液,尼古丁(nicotine)溶液,氧化苯砷(phenylarsine)溶液,秋水仙堿(colchicine)溶液和菲力平(filipin)溶液預(yù)孵育lOmin。加入祀向突光標記的PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒溶液，繼續(xù)孵育60min，用Hank’ s液替換掉藥液，熒光顯微鏡下觀察熒光標記納米粒的攝取情況。結(jié)果如圖4所示，表明PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒的攝取顯著受到GABA的影響，而基本不受乙酰膽堿受體激動劑或阻斷劑乙酰膽堿，美加明和尼古丁的影響；此外，納米粒的攝取受到氧化苯砷，秋水仙堿和菲力平的影響，表明PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒的入胞機制與網(wǎng)格蛋白、巨胞飲途徑和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑相關(guān)。實施例14將2萬個腦毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中，48h后顯微鏡下觀察匯合度，吸去培養(yǎng)基，加入靶向熒光標記的PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒溶液，分別孵育15min和60min，在孵育結(jié)束前IOmin,加入Lysotracker Green溶液，共孵育IOmin,用Hank’ s液替換掉藥液，激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光標記納米粒和酸性內(nèi)體的共定位情況。結(jié)果顯示，PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒入胞后主要存在于酸性內(nèi)體中，分布于細胞漿內(nèi)。實施例15在BH試劑(3ug)中加入125I約ImCi和適量氯胺T溶液，振蕩反應(yīng)10s_20s，迅速加入偏重亞硫酸鈉溶液，NaI溶液，DMF溶液和苯適量，振搖，苯層合并，氮氣吹干，測定放射性強度，適量PAMAM溶于硼酸鹽緩沖液(01. M，pH8. 5)，與125I標記的BH試劑周期性渦旋混合，冰上孵育15min，PBS (pH8. O)透析除去未反應(yīng)的1251，得到放射性標記的PAMAM。

實施例16取適量放射性標記的PAMAM，加入PEG3500，使二者的摩爾比為I : 2，室溫反應(yīng)兩小時，MWCO 10000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的PEG3500，pH 7. O磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，加入RVG29多肽，使多肽與PAMAM的摩爾比為I : 1，室溫攪拌反應(yīng)24h，MWCO 10000超濾離心管中以12000rpm超濾30min去除未反應(yīng)的RVG29多肽，得到放射性標記的 PAMAM-PEG-RVG29 溶液。 分別將同等放射性強度的125I標記的PAMAM與PAMAM-PEG-RVG29溶液與質(zhì)粒DNA硫酸鈉溶液復(fù)合，分別制備成放射標記的非靶向的PAMAM/DNA和靶向的PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒溶液。實施例17將5，000個腦毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在Transwell小室中，72h后顯微鏡下觀察匯合度，將適量培養(yǎng)基加入到Tanswell小室中，形成內(nèi)外液面差，過夜培養(yǎng)，確定液面差維持。分別測定Transwell小室中四個位點的跨膜電阻，選取電阻平均，且大于200 Ω的Transwe 11進行下述實驗。吸去培養(yǎng)基，分別加入含有3ul (O. 6uCi) 14C標記的蔗糖的放射標記的PAMAM/DNA納米粒溶液和含有3ul (O. 6uCi)14C標記的蔗糖的放射標記的PAMAM-PEG-RVG29/DNA 納米粒溶液，分別在 5min，IOmin, 15min, 30min, 45min 和 60min 吸取Transwell外培養(yǎng)液20ul,及時補足20ul,并在第60min時吸取Tranwell內(nèi)藥液20ul,測定各時間點樣品的Y計數(shù)。取IOul測定液，加入Iml閃爍液，渦旋均勻，室溫避光放置過夜，測定β計數(shù)。結(jié)果如圖6中B所示，證明在實驗整個過程中由腦毛細血管內(nèi)皮細胞組成的單層血腦屏障模型保持完整；同時，如圖6Α所示，PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒的跨血腦屏障模型效率顯著高于非靶向的PAMAM/DNA納米粒。實施例18將實施例9制備的熒光標記的非靶向納米粒PAMAM/DNA與靶向納米粒PAMAM-PEG-RVG29/DNA,經(jīng)裸鼠尾靜脈給藥，劑量為50ug DNA/裸鼠，分別于給藥后80min將裸鼠麻醉，使用小動物成像儀觀察熒光標記的納米粒在裸鼠體內(nèi)的分布情況，成像結(jié)果如圖7所示，經(jīng)過RVG29多肽修飾的納米粒可有效的蓄積于腦部。實施例19分別采用PAMAM，實施例I和實施例2制備的載體溶液與編碼綠熒光蛋白(GFP)基因的質(zhì)粒DNA (pEGFP-N2)復(fù)合，渦旋30s，制備成非靶向的PAMAM/DNA和PAMAM-PEG/DNA納米粒以及靶向的PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒，經(jīng)Balb/c小鼠尾靜脈給藥，劑量為50ugDNA/裸鼠，于給藥后48h麻醉，心臟灌流，以200ml生理鹽水灌注，再以4%多聚甲醛灌注，解剖取腦，繼續(xù)在4°C的多聚甲醛溶液中固定24h，換以30%蔗糖溶液進行脫水，待腦組織沉于溶液底部，進行冰凍冠狀切片，厚度為20um,切片后用DAPI進行細胞核染色,置于熒光顯微鏡下觀察綠熒光蛋白表達情況，切片結(jié)果如圖8所示，PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒給藥組，腦部各區(qū)域包括海馬，紋狀體，黑質(zhì)和皮層的報告基因表達量均高于非靶向納米粒給藥組。實施例20分別采用PAMAM，實施例I和實施例2制備的載體溶液與編碼蟲熒光素酶基因的質(zhì)粒DNA(pGL-2)復(fù)合，渦旋30s，制備成非靶向的PAMAM/DNA和PAMAM-PEG/DNA納米粒以及靶向的PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒，經(jīng)Balb/c小鼠尾靜脈給藥，劑量為50ug DNA/裸鼠，于給藥后48h采用頸椎脫白法處死，分別在冰上取腦、心、肝、脾、肺和腎，置于5ml離心管中，剪碎，加入Iml組織細胞裂解液(CCLR)，采用組織細胞超聲粉碎儀，將組織破碎成勻 漿，去800ul勻漿置于1.5ml離心管中，在4°C 12，OOOrpm下離心20min，取上清液600ml，40ul上清液與IOOul蟲熒光素酶活性分析底物混勻后采用光學(xué)發(fā)光計數(shù)儀測定每IOs的計數(shù)之和，再分別利用蛋白測定試劑盒測定每個樣品的蛋白量，每個樣品的結(jié)果以計數(shù)/mg蛋白表示，結(jié)果如圖9所示，PAMAM-PEG-RVG29/DNA納米粒給藥組腦內(nèi)的單位蛋白中蟲熒光素酶活性高于非靶向納米粒給藥組。
權(quán)利要求
1.一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，由腦靶向載體和編碼特定基因的質(zhì)粒DNA構(gòu)成，所述的腦靶向載體由陽離子樹狀大分子材料、親水性聚合物和狂犬病毒糖蛋白衍生妝RVG29組成。
2.按權(quán)利要求I所述的多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的腦革巴向載體為RVG29修飾的樹枝狀大分子腦祀向載體，其中，以陽尚子樹枝狀大分子材料、未水性聚合物和RVG29多肽為組分，三者以共價方式連接。
3.按權(quán)利要求I所述的多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的腦靶向載體通過靜電與編碼特定基因的質(zhì)粒DNA復(fù)合。
4.按權(quán)利要求I或2所述的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的腦靶向載體通過下述步驟制備 陽離子樹枝狀大分子材料和親水性聚合物以I : I 20的分子比溶于pH值7. 8 8.2磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應(yīng)60 180分鐘，生成陽離子樹枝狀大分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物并更換為pH值6. 8 7. 2磷酸鹽緩沖液；同時，RVG29多肽以I 10 : I的分子比與陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物上的特異基團室溫攪拌反應(yīng)12 36小時后生成陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物-RVG29，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的RVG29多肽，制得腦靶向載體。
5.按權(quán)利要求I或2所述的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的親水性聚合物與陽離子樹狀大分子材料的分子比是I 20 I ； 所述的RVG29多肽與陽離子樹狀大分子材料的分子比為I 10 : I。
6.按權(quán)利要求I或2所述的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29多肽具有SEQ ID NO. I的序列。
7.按權(quán)利要求I或2所述的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的陽離子樹枝狀大分子材料選自樹枝狀聚賴氨酸或聚酰胺-胺。
8.按權(quán)利要求I或2所述的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的親水性聚合物為聚乙二醇PEG。
9.按權(quán)利要求3所述的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的腦靶向載體與質(zhì)粒DNA復(fù)合的質(zhì)量之比是3 10 I。
10.權(quán)利要求I的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，其包括步驟 將質(zhì)粒DNA溶于50mM硫酸鈉溶液中，所述腦載體溶液與DNA溶液以摩爾比3 10 I混合后，渦旋30s，制得腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)及其制備方法。本發(fā)明采用狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29作為腦靶向頭基，陽離子樹枝狀大分子為載體材料，通過親水性聚合物連接RVG29多肽構(gòu)建腦靶向載體；腦靶向載體再通過靜電復(fù)合作用與編碼特定基因的質(zhì)粒DNA復(fù)合，制成所述的腦靶向納米基因遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明能增加納米基因遞釋系統(tǒng)在體外血腦屏障模型的攝取和穿過效率，提高納米基因遞釋系統(tǒng)在動物腦內(nèi)的蓄積，提高報告基因在腦內(nèi)的表達量，實現(xiàn)基因跨過血腦屏障向腦內(nèi)的遞釋，為診斷和治療基因的腦部應(yīng)用提供了一種高效和安全的策略。
文檔編號A61K47/34GK102836440SQ20111017473
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月25日
發(fā)明者蔣晨, 劉洋 申請人:復(fù)旦大學(xué)