專利名稱：免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制備方法，尤其涉及免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中重組質(zhì)粒和重組病毒的制備， 屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)由 Barry J. Marshall 和 J. Robin Warren于1983年首次發(fā)現(xiàn)，是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的革蘭氏陰性菌， 是慢性活動(dòng)性胃炎、十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界衛(wèi)生組織/國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(WH0/IARC)將幽門螺桿菌定為I類致癌原。目前全球近50%的人口感染了幽門螺桿菌，在發(fā)展中國家其感染率可高達(dá)70%以上，嚴(yán)重影響了人類的健康。現(xiàn)有的治療幽門螺桿菌的手段主要是聯(lián)合應(yīng)用抗生素及抑酸劑，但存在耐藥性廣泛，副反應(yīng)大，治療費(fèi)用高且易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。免疫治療可能是有效控制幽門螺桿菌的最有效、最有前景的方法之一，幽門螺桿菌疫苗的研制已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)尿素酶(UreA和UreB)、空泡毒素(VacA)、熱休克蛋白(HspA和HspB)、中性粒細(xì)胞激活蛋白(NAP)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白 (CagA)、黏附素(Adhesin)等亞單位蛋白或其融合蛋白均可以作為免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，其中尿素酶B亞單位(UreB)由于缺乏尿素酶活性卻保留了其免疫原性、在幽門螺桿菌中高度保守而被確定為幽門螺桿菌疫苗研究的首選抗原。為了增強(qiáng)幽門螺桿菌蛋白的免疫原性一般將其與粘膜佐劑聯(lián)合應(yīng)用，目前幽門螺桿菌疫苗常用免疫佐劑是霍亂毒素(Cholera toxin, CT)和大腸桿菌不耐熱毒(Heat-labile enterotoxin, LT),但都具有明顯腸毒性，現(xiàn)在多采用CT的B亞單位(CTB)以及LT的B亞單位(LTB)代替全毒素作為免疫佐劑。在口服蛋白亞單位疫苗生產(chǎn)中蛋白亞單位抗原的表達(dá)量成為制約其成本的關(guān)鍵因素，因此尋找低成本表達(dá)抗原蛋白的方法勢在必行。目前家蠶生物反應(yīng)器主要是利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因的表達(dá)。其優(yōu)勢主要有I)表達(dá)量高利用桿狀病毒POlh基因和PlO基因的強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因的高效表達(dá)；2)可容納大的外源基因桿狀病毒基因組在大小上差異很大(88 165kbp)，病毒可以容納較大的外源基因片段而不影響自身正常的復(fù)制和包裝；3)適合于表達(dá)毒性蛋白由于重組桿狀病毒極晚期基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因的表達(dá)是在子代芽殖、有感染力病毒成熟之后進(jìn)行的，因此，表達(dá)具有細(xì)胞毒性的蛋白不會(huì)影響病毒的復(fù)制；4)具轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工能力，表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)、生物活性、免疫原性和糖基化修飾等方面與天然蛋白具有很強(qiáng)的相似性；5)安全性好昆蟲桿狀病毒只在無脊椎動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，對(duì)脊椎動(dòng)物和植物細(xì)胞而言并非病原體，因此昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)使用者是安全無害的 (家蠶桿狀病毒的表達(dá)宿主有家蠶細(xì)胞、家蠶幼蟲和蠶蛹，但家蠶幼蟲和蠶蛹使用范圍較廣，因其便于注射操作)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種重組桿狀病毒BmNPV- (CTB-Linker-^rM)，該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為家蠶核型多角體病毒iBombyx mori nucleopolyhedrovirus')，媒氣編CGMCC No. 5580。上述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker- r￡沿)的制備方法，包括以下步驟
(1)由PCR擴(kuò)增的方法獲得口服免疫佐劑CTB基因序列與幽門螺桿菌抗原蛋白《rM 基因序列，并且在口服免疫佐劑CTB基因與抗原蛋白IireB基因之間加入一段連接肽序列 Linker,構(gòu)建 CTB-Linker-arei 融合基因；
(2)步驟(I)所得CTB-Linker-arM融合基因用BamHI和EcoR I進(jìn)行雙酶切后回收， 連接到載體PBacPAKS，使該融合基因置于多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制之下，轉(zhuǎn)化TG1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK8- (CTB-Linker-yre^)；
(3)取步驟(2)所得的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBaCPAK8-(CTB-Linker- rM)和線性化的家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK6 DNA共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，通過空斑篩選法篩選陽性，即得到所述家蠶重組桿狀病毒 BmNPV- (CTB-Linker-wr^)。上述步驟I)中利用PCR技術(shù)在口服免疫佐劑基因下游連入一段連接肽序列 Linker :AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，然后利用重疊延伸 PCR 技術(shù)將連有連接肽序列的口服免疫佐劑基因與幽門螺桿菌抗原蛋白基因進(jìn)行融合。上述連接肽序列Linker是編碼為(Gly4Ser)n的柔性肽段,其中I彡η彡6。上述家蠶重組桿狀病毒BmNPV- (CTB-Linker-wre^)表達(dá)的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 7 所示。上述蛋白的制備方法，包括以下步驟
(1)將權(quán)利要求I所述的重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-tfrM)感染家蠶BmN細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；
(2)針刺接種法接入家蠶蠶蛹或幼蟲；
(3)收集表達(dá)的權(quán)利5所述蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)在免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供上述蛋白在免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中的應(yīng)用。本發(fā)明具有以下有益效果
(I)人們對(duì)家蠶的馴養(yǎng)已有數(shù)千年的歷史，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，并且現(xiàn)代家蠶人工飼料養(yǎng)殖技術(shù)使得家蠶一年四季都可以養(yǎng)殖，大大降低了以家蠶幼蟲和蠶蛹作為為宿主進(jìn)行外源基因的表達(dá)的成本；(2)抗原蛋白在家蠶生物反應(yīng)器中高效表達(dá)，解決了口服蛋白亞單位疫苗生產(chǎn)中抗原蛋白需求量的制約瓶頸，而且將口服免疫佐劑與抗原蛋白融合表達(dá)作為分子內(nèi)免疫佐劑增強(qiáng)了免疫效果；小鼠口服實(shí)驗(yàn)表明蠶蛹表達(dá)的融合蛋白在小鼠血清中產(chǎn)生了明顯的免疫效應(yīng)，為下一步利用蠶蛹生產(chǎn)幽門螺桿菌口服蛋白亞單位疫苗提供了基礎(chǔ)。(3)利用家蠶生物反應(yīng)器將口服免疫佐劑蛋白與抗原蛋白融合表達(dá)，并在兩者之間加入連接肽片段融合蛋白中口服免疫佐劑作為分子內(nèi)佐劑比單獨(dú)應(yīng)用更能增強(qiáng)抗原蛋白的免疫原性，并且連接肽片段保證了融合蛋白中兩蛋白亞單位的構(gòu)象不發(fā)生改變；本疫苗采用口服給藥，減輕了注射給藥的痛苦，且蠶蛹粉有促進(jìn)蛋白抗原口服吸收的作用，增強(qiáng)蛋白抗原的免疫原性。


圖I為CTB基因PCR擴(kuò)增的電泳分析圖；M DNA標(biāo)記；1 :陰性對(duì)照；2 =PCR產(chǎn)物；
圖2為CTB-Linker PCR擴(kuò)增的電泳分析圖；M DNA標(biāo)記；1 :陰性對(duì)照；2 =PCR產(chǎn)物； 圖3為《τΜ基因PCR擴(kuò)增的電泳分析圖；M DNA標(biāo)記；I :陰性對(duì)照；2: PCR產(chǎn)物； 圖4為CTB-Linker-arMPCR融合的電泳分析圖；M :DNA標(biāo)記；1 :陰性對(duì)照；2 :融合PCR 產(chǎn)物；
圖 5 為 pBacPAK8-(CTB-Linker-areW)的 PCR-雙酶切鑒定圖；M :DNA 標(biāo)記；1 PCR 產(chǎn)物；2 :雙酶切產(chǎn)物；
圖6為BmNPV- (CTB-Linker-wr^)的PCR鑒定圖；M DNA標(biāo)記;I :陰性對(duì)照；2 :引物為M13 F、M13 R的PCR產(chǎn)物；3 :引物為CTB上游引物、M13 R的PCR產(chǎn)物；4 :引物為CTB上游引物、ureB下游引物的PCR產(chǎn)物；
圖7為r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白在BmN細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖；M 預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1 :正常細(xì)胞總蛋白；2 :正常細(xì)胞上清；3 :正常細(xì)胞沉淀；4 :發(fā)病細(xì)胞總蛋白；5 :發(fā)病細(xì)胞上清；6 :發(fā)病細(xì)胞沉淀；
圖8為r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白在BmN細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting 分析圖；M :預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1 :正常細(xì)胞總蛋白；2 :正常細(xì)胞上清；3 :正常細(xì)胞沉淀； 4 :發(fā)病細(xì)胞總蛋白；5 :發(fā)病細(xì)胞上清；6 :發(fā)病細(xì)胞沉淀；
圖9為r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白在蠶蛹中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖；M :預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白I:正常蠶蛹勻漿上清；2:正常蠶蛹勻漿沉淀；3:發(fā)病蠶蛹勻漿上清； 4 :發(fā)病蠶蛹勻漿沉淀；
圖10為r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白在蠶蛹中表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting分析圖；M :預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1 :正常蠶蛹勻漿上清；2 :正常蠶蛹勻漿沉淀；3 :發(fā)病蠶蛹勻漿上清；4 :發(fā)病蠶蛹勻漿沉淀；
圖11為小鼠口服蠶蛹表達(dá)的r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白后血清中特異性抗幽門螺桿菌UreB IgG抗體滴度圖。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的發(fā)明。除非另有說明，本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明本實(shí)例在意本發(fā)明技術(shù)方案為前提的條件下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程(以下所用抗體均為進(jìn)口試劑，其他均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?。實(shí)施例I :CTB-Linker-tfrM融合基因(如SEQ ID NO 1所示)的構(gòu)建
首先利用重疊延伸PCR技術(shù)將口服免疫佐劑CTB基因和幽門螺桿菌ureB基因進(jìn)行融合；為了保證融合基因表達(dá)后兩蛋白亞單位空間結(jié)構(gòu)不受影響，在CTB基因和《TM之間連入了
一段連接肽序列(Linker)(如SEQ ID NO 6所示)
AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，編碼(Gly4Ser)3 的柔性肽段， 保證融合蛋白中兩蛋白亞單位空間結(jié)構(gòu)不受影響。這一連接肽最初是由Husotn等人于 1988年根據(jù)Fab片段X射線衍射分析資料設(shè)計(jì)，后來發(fā)現(xiàn)該肽段較長且柔軟，能夠降低融合蛋白中各個(gè)蛋白亞間的空間位阻，從而更有利于融合蛋白各個(gè)結(jié)構(gòu)域的正確折疊而成為通用連接肽，廣泛應(yīng)用于融合蛋白的表達(dá)(圖I、圖2、圖3、圖4)。I. CTB基因的擴(kuò)增
根據(jù)GenBank登錄號(hào)U25679. I公布的CTB的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于擴(kuò)增CTB基因，并在上游引物(如SEQ ID N0:2所示)的5’端加入BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。 下游引物(如SEQ ID NO 3所示)帶有連接肽的部分片段(劃線部分表示)。 CTB 上游引物5 ’ -CGCGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGG-3 ’ ；
CTB 下游引物5’ -ACCGCCGGATCCACCGCCACCATTTGCCATACTAATTGCGG-3’ ；
利用設(shè)計(jì)的CTB引物，以重組桿狀病毒BmNPV-CTB-INS (該重組桿狀病毒已經(jīng)由中國200310121132. I專利申請(qǐng)“表達(dá)CTB和人胰島素融合蛋白的重組家蠶桿狀病毒及其應(yīng)用”公開，并且在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，保藏編號(hào)為CGMCC No. 1033)基因組DNA為模板擴(kuò)增CTB基因(見圖I)，瓊脂糖凝膠電泳回收CTB基因片段。2. CTB-Linker 基因的構(gòu)建設(shè)計(jì)一段連接肽序列
AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC,以 CTB 上游引物和此連接肽序列作為引物，以回收的CTB片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Τ0Υ0Β0公司的KOD-plus)，將連接肽序列連接在CTB基因的3’端，瓊脂糖凝膠回收擴(kuò)增的片段，即為連接有連接肽序列的 CTB-Linker (見圖 2)。3.基因的擴(kuò)增
根據(jù)GenBank登錄AY714224. I公布的ureB的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)弓I物擴(kuò)增ureB基因。 上游引物(如SEQ ID NO :4所示)帶有連接肽的部分序列(劃線部分表示)；下游引物(如 SEQ ID NO 5所示)的5’端加入EcoR I酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。 Γ 沿上游引物GGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTATTAGCAGAAAAGAATATG ureB 下游引物CCGGAATTCCTAGAAAATGCTAAAGAGTTG ；
利用設(shè)計(jì)的ureB引物，以重組桿狀病毒BmNPV-UreB (蘇州大學(xué)貢成良教授贈(zèng)予，已由 2009年中國蠶學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集(2)中的“幽門螺桿菌尿素酶B亞單位在家蠶桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)”公開)基因組DNA為模板擴(kuò)增《TM基因(見圖3)，瓊脂糖凝膠電泳回收ureB基因片段。4. CTB-Linker- r￡沿融合基因的獲得
以CTB上游弓丨物和ureB下游引物作為引物，以回收的CTB-Linker和ureB基因?yàn)槟０暹M(jìn)行重疊延伸PCR(見圖4)，瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增的片段，即為CTB-Linker-^rM融合基因(如SEQ ID NO 1所示)。實(shí)施例2 :重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK8-(CTB-Linker-tfri i )的構(gòu)建
對(duì)實(shí)施例I所得CTB-Linker-arM融合基因的5 ’和3 ’端分別用BamH I酶和EcoR I酶 (Fermentas公司)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后片段；同時(shí)用BamH I酶和EcoR I酶對(duì)pBacPAK8載體(Invitrogen公司)進(jìn)行酶切并用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后片段； 然后用T4連接酶(Fermentas公司)將回收的融合基因連接到酶切后的pBacPAK8載體，使重組基因置于多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制之下，轉(zhuǎn)化TG1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(InvitiOgen 公司)，篩選陽性克隆，得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK8- (CTB-Linker-wr^)(見圖5)，對(duì)其進(jìn)行基因測序，由測序結(jié)果可知融合基因成功克隆至pBacPAKS載體。實(shí)施例3 :家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)的構(gòu)建 I.線性化病毒DNA的獲得
家香桿狀病毒Bm_BacPAK6 (Clontech公司)接種培養(yǎng)的BmN細(xì)胞(Invitrogen公司)， 27°C培養(yǎng)72 h后，收集病毒培養(yǎng)液，提取Bm-BacPAK6病毒基因組DNA，并用內(nèi)切酶對(duì) Bm-BacPAK6病毒基因組進(jìn)行酶切使之線性化。2.重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與線性化病毒DNA的共轉(zhuǎn)染
(1)將生長狀態(tài)良好的BmN細(xì)胞鋪于50ml培養(yǎng)瓶中，27°C培養(yǎng)4 12 h使細(xì)胞貼壁；
(2)取A離心管加入重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8-(CTB-Linker-tfrM)5μ1、線性化病毒 DNA 20 μ (約 I Pg)，用 HBS (20mM HEPES, N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸； 15mM NaCl)將總體積補(bǔ)足至50 μ ，混勻；
(3)取B離心管加脂質(zhì)體ΙΟμΙ，用HBS將總體積補(bǔ)足至50μ1；
(4)將A和B混合均勻，室溫放置15min，吸去培養(yǎng)瓶中已貼壁細(xì)胞的上清，用無血清培養(yǎng)基(1XSF-900 II SFM(Invitrogen 公司))洗兩次，每次 2 ml ；
(5)加入2ml無血清培養(yǎng)基，將上述的ΙΟΟμΙ混合液滴入，輕輕移動(dòng)培養(yǎng)瓶使混合液均勻分布；加入2 ml無血清培養(yǎng)基，將上述的ΙΟΟμΙ混合液滴入，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，混合液均勻分布；
(6)27°C繼續(xù)培養(yǎng)Γ 6天，在顯微鏡中能觀察到細(xì)胞出現(xiàn)感染癥狀，將共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至另一瓶生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，待感染細(xì)胞破裂后，收集上清，并分裝置于4°C 保存。3.家蠶重組桿狀病毒的篩選
(1)分別將IX IO5個(gè)生長狀態(tài)良好的家蠶細(xì)胞均勻鋪于4個(gè)35 mm培養(yǎng)皿中，貼壁培養(yǎng) 6 12 h 用完全培養(yǎng)基(1XSF-900 II SFM :1XFBS, l:10(v:v), Invitrogen 公司)分別以10_3、10_4、10_5、10_6梯度稀釋重組病毒液，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，分別加入各稀釋度的病毒液I ml，27 °C培養(yǎng)I h ；
(2)吸去感染液，將預(yù)先保溫于40°C水浴中的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖和完全培養(yǎng)基(SF-900II SFM : I XFBS, 1:10 (v: v), Invitrogen公司)按I: I (v: V)混合后，在每個(gè)平皿中各鋪入2 ml混合液，待凝膠凝固后將平皿倒置27°C培養(yǎng)2-5天，其間每隔6 h需在顯微鏡下觀察，以免多個(gè)空斑融合成片；
(3)在顯微鏡下觀察空斑出現(xiàn)后，用藍(lán)色記號(hào)筆在小培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，再在超凈臺(tái)上用滅菌槍頭挑出空斑，釋放在200μ1培養(yǎng)基中，取80μ1接種于事先培養(yǎng)有BmN細(xì)胞的96空斑，并做好標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)34天,在出現(xiàn)明顯感染癥狀的孔中加入 μ x-gal (Invitrogen 公司)，27°C繼續(xù)培養(yǎng)24h，挑選白色孔，進(jìn)入下一輪空斑篩選，經(jīng)過3 4輪的篩選后可獲得純化的該家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)。4.家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-UrM)的鑒定 (I) PCR鑒定
提取重組桿狀病毒基因組DNA，并以此為模板，分別以M13 F和M13 R (通用引物)、目的基因上游引物和M13 R、目的基因上游引物和下游引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增片段的大小判斷是否陽性(見圖6)。(2) SDS-PAGE 和 Western blotting 分析鑒定
將經(jīng)PCR鑒定呈陽性的家蠶重組桿狀病毒接種BmN細(xì)胞，27°C培養(yǎng)72 h，待細(xì)胞發(fā)病 (顯微鏡觀察)后收集細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析，結(jié)果顯示，在76kDa位置有特異性條帶(見圖7、圖8)，說明該家蠶重組桿狀病毒在家蠶BmN 細(xì)胞中成功表達(dá)。實(shí)施例4 :免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗的獲得 I.免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗的分離及純化
測定實(shí)施例3所得家蠶重組桿狀病毒BmNPV- (CTB-Linker-yr^)的滴度后接種家蠶蠶蛹或幼蟲(品種為箐松X皓月)，蠶蛹發(fā)病后低溫凍存，SDS-PAGE和Western blotting 分析結(jié)果顯示，r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白(如SEQ ID N0:7所示)在蠶蛹中成功表達(dá) (圖9、圖10) ;ELISA檢測結(jié)果顯示，該融合蛋白在蠶蛹中的表達(dá)水平為O. 12 mg/g蠶蛹。將凍存的蠶蛹與磷酸鹽緩沖液(pH7. 4，4°C )按500g: IL的比例用勻漿機(jī)進(jìn)行勻衆(zhòng)，勻衆(zhòng)2 min,冰浴2 min,重復(fù)操作10次；然后2(TC, 6000 rpm離心30min,去除沉淀后將上清液用9層脫脂棉紗布過濾去除油脂，重復(fù)操作3次；然后4°C，12000 rpm離心 30 min,去除沉淀后將上清液用9層脫脂棉紗布過濾進(jìn)一步去除油脂，重復(fù)操作3次；將所得上清液用超濾系統(tǒng)30kDa超濾膜包超濾濃縮至200ml，然后于凍干機(jī)中凍干后低溫 (_80°C)保存。然后，將蠶蛹凍干粉用磷酸鹽緩沖液(PH7.4)以50mg:lml比例溶解，采用 ELISA法對(duì)融合蛋白進(jìn)行定量。2. 口服疫苗的效果(小鼠口服實(shí)驗(yàn)鑒定融合蛋白的免疫原性)
ICR小鼠，健康雌性，61周齡，體重18 22 g，由天津市奧易德實(shí)驗(yàn)用品有限公司提供。 將24只小鼠隨機(jī)分為3組，I組為正常蠶蛹粉對(duì)照組；II組為UreB標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照組JII組為 r(CTB-Linker-UreB)融合蛋白實(shí)驗(yàn)組。小鼠免疫前禁食禁水12h，飼喂針灌服胃酸中和液 (0.2 M的碳酸氫鈉溶液)0.5 ml/只,30 min開始灌服抗原。標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照組口服UreB蛋白標(biāo)準(zhǔn)品200 Pg/只(UreB標(biāo)準(zhǔn)品購自上海領(lǐng)潮生物科技有限公司，用磷酸鹽緩沖液pH7. 4 稀釋至200 Pg/ml,小鼠灌胃I ml/只)；r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白實(shí)驗(yàn)組口服融合蛋白蠶蛹凍干粉2 g(約含200 Pg融合蛋白，溶于Iml磷酸鹽緩沖液pH7. 4中，小鼠灌胃Iml/只)；正常蠶蛹粉對(duì)照組灌服2 g正常蠶蛹凍干粉(正常蠶蛹凍干粉處理方法與融合蛋白蠶蛹凍干粉處理方法相同)。小鼠每周免疫I次，共免疫4次。第一次免疫前眼底靜脈叢取血作為陰性血清對(duì)照；以后每次免疫前眼底靜脈叢取血，共取4次。每次所取血液37°C 孵育30 min, 3000 g離心10 min,收集血清于-20O保存?zhèn)溆?。ELISA分析血清中抗體滴度，鑒定r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白的免疫原性，步驟如下
(1)將UreB蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用ELISA包被液(O.05 M碳酸鹽緩沖液，pH9. 6)稀釋至5 μδ /ml, 200 μ /孔，包被96孔板，4°C孵育過夜；
(2)用含O.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 4)洗板(每次5 min，3次)；
(3)用1%BSA的磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)37°C孵育I h;
(4)用含O.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 4)洗板(每次5 min, 3次)；
(4)小鼠血清用磷酸鹽緩沖液(ρΗ7·4)以I:50(V:V)比例稀釋后，再以I :3(v:v)比例系列(初始稀釋比例是1:50，接下來按1:3比例稀釋系列后就是1:150，1:450，1:1350， 1:4050，1:12150，共 6 個(gè)梯度)稀釋，37°C孵育 I h;
(5)用含O.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 4)洗板(每次5 min, 3次)
(6)用磷酸鹽緩沖液(PH7.4)按I:5000 (v:v)比例稀釋辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG 二抗，200 μ /孔，37°C孵育 I h;
(7)用含O.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 4)洗板(每次5 min, 3次);
(8)加底物每孔加入TMB顯色液(Solarbio公司)200μ1，避光顯色10min;
(9)終止反應(yīng)每孔加入50μ1，2 M硫酸終止反應(yīng)；
(10)酶標(biāo)儀測定吸光值OD492(圖11)。ELISA結(jié)果分析小鼠口服蠶蛹表達(dá)的r (CTB-Linker-arM)融合蛋白后血清中特異性抗幽門螺桿菌UreB抗體滴度分析顯示蠶蛹表達(dá)的融合蛋白有較好的免疫原性，可以作為幽門螺桿菌口服疫苗的抗原。以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)中的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)特征的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些潤飾和改進(jìn)也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-tfrM)，該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為=CGMCC No. 5580。
2.一種權(quán)利要求I所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-tfr￡^)的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)由PCR擴(kuò)增的方法獲得口服免疫佐劑CTB基因序列與幽門螺桿菌抗原蛋白《rM 基因序列，并且在口服免疫佐劑CTB基因與抗原蛋白IireB基因之間加入一段連接肽序列 Linker,構(gòu)建 CTB-Linker-arei 融合基因；(2)步驟(I)所得CTB-Linker-arM融合基因用BamHI和EcoR I進(jìn)行雙酶切后回收， 連接到載體pBacPAKS，使該融合基因置于多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制之下，轉(zhuǎn)化TG1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK8- (CTB-Linker-yre^)；(3)取步驟(2)所得的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBaCPAK8-(CTB-Linker- rM)和線性化的家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK6 DNA共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，通過空斑篩選法篩選陽性，即得到所述家蠶重組桿狀病毒 BmNPV- (CTB-Linker-wr^)。
3.根據(jù)權(quán)利2所述的方法，其特征在于，步驟I)中利用PCR技術(shù)在口服免疫佐劑基因下游連入一段連接肽序列Linker AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC,然后利用重疊延伸 PCR 技術(shù)將連有連接肽序列的口服免疫佐劑基因與幽門螺桿菌抗原蛋白基因進(jìn)行融合。
4.根據(jù)權(quán)利3所述的方法，其特征在于，所述連接肽序列Linker是編碼為(Gly4Ser)n 的柔性肽段，其中I彡η彡6。
5.一種權(quán)利要求I所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)表達(dá)的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。
6.一種權(quán)利要求5所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將權(quán)利要求I所述的重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)感染家蠶BmN細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；(2)針刺接種法接入家蠶蠶蛹或幼蟲；(3)收集表達(dá)的權(quán)利5所述蛋白。
7.一種權(quán)利I所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-tfr￡^)在免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中的應(yīng)用。
8.—種權(quán)利要求5所述的蛋白在免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制備方法及其產(chǎn)品，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用PCR技術(shù)在口服免疫佐劑基因下游連入連接肽序列片段，然后利用重疊延伸PCR技術(shù)將連有連接肽序列的口服免疫佐劑基因與蛋白抗原基因進(jìn)行融合，然后構(gòu)建融合基因的重組家蠶桿狀病毒并利用家蠶生物反應(yīng)器進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。本發(fā)明采用家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)了口服免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白，不僅實(shí)現(xiàn)了蛋白的高效表達(dá)，而且將口服免疫佐劑與抗原蛋白融合表達(dá)作為分子內(nèi)免疫佐劑增強(qiáng)了免疫效果。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102604993SQ20121000547
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者張耀洲, 舒特俊, 陳劍清, 高國 申請(qǐng)人:天津耀宇生物技術(shù)有限公司