專利名稱：一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與基因工程制藥領(lǐng)域，具體涉及一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞以及由其所產(chǎn)生的血紅蛋白在機(jī)體生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoiet in, ΕΡ0)是體內(nèi)紅細(xì)胞生成過(guò)程中最重要的調(diào)控因子,在正常成年人中EPO主要由腎臟產(chǎn)生。慢性腎衰時(shí)，腎臟產(chǎn)生EPO相對(duì)不足或不能分泌ΕΡ0，從而導(dǎo)致貧血。因此，應(yīng)用重組人促紅細(xì)胞生成素(rh-EPO)可以有效治療腎性貧血。此外，rh-EPO還可用于實(shí)體瘤放/化療所致貧血、外科手術(shù)紅細(xì)胞動(dòng)員、自體輸血等的輔助治療。
現(xiàn)有的重組EPO類藥物，其生產(chǎn)都需要采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)和制備，原因是EPO分子必需經(jīng)過(guò)翻譯后的糖基化修飾才具有生物活性。與大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)目的蛋白的周期相對(duì)較長(zhǎng)，成本也相對(duì)較高。EPO 模擬妝(Erythropoietin mimetic peptide, EMP)是 1996 年 Wrighton 等米用噬菌體展示技術(shù)從肽庫(kù)中篩選出來(lái)的一種含有20個(gè)氨基酸的多肽，其氨基酸序列與EPO完全不同源，但卻能特異性結(jié)合EPO受體，尤其是該多肽的二聯(lián)體能夠有效激活EPO受體及相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，從而產(chǎn)生與EPO相似的生物學(xué)功能(Wrighton, et al.，Science,1996，273: 458-463)。由于不需要糖基化修飾，所以無(wú)論是化學(xué)合成，還是通過(guò)細(xì)菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)所制備出的EMP 二聯(lián)體都具有較高的生物活性。然而，EMP的分子量較小，難以通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)與制備，而且由于半衰期短，其體內(nèi)應(yīng)用效果也較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法，所述融合蛋白可顯著延長(zhǎng)EMP 二聯(lián)體半衰期，具有長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成的特性。本發(fā)明所述的促紅細(xì)胞生成素模擬肽與人血清白蛋白HSA的融合蛋白，包含I個(gè)人血清白蛋白HSA和I個(gè)由兩個(gè)頭尾串聯(lián)的促紅細(xì)胞生成素模擬肽EMP組成的EMP 二聯(lián)體(dEMP)o人血清白蛋白HSA存在天然多態(tài)性，本發(fā)明融合蛋白中的人血清白蛋白HSA也包括這些多態(tài)型。優(yōu)選地,所述促紅細(xì)胞生成素模擬肽EMP具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述促紅細(xì)胞生成素模擬肽EMP活性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA活性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，EMP 二聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與EMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)EMP之間均設(shè)有連接肽，所述融合蛋白用結(jié)構(gòu)式表示為HSA-dEMP，具體地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID N0:5所示。 優(yōu)選地，所述EMP 二聯(lián)體位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與EMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)EMP之間均設(shè)有連接肽，所述融合蛋白用結(jié)構(gòu)式表示為dEMP- HSA，具體地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDN0:4所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID N0:6所示。優(yōu)選地，所述人血清白蛋白HSA與EMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)EMP之間的連接肽均由1-30個(gè)氨基酸殘基組成。
更優(yōu)選地，所述人血清白蛋白HSA與EMP 二聯(lián)體之間的連接肽由13個(gè)氨基酸殘基組成，兩個(gè)EMP之間的連接肽由4個(gè)氨基酸殘基組成。更優(yōu)選地,組成連接肽的氨基酸主要為Gly與Ser、Pro的組合。本發(fā)明還提供上述融合蛋白的制備方法，主要包含步驟
1)獲取編碼EMP二聯(lián)體和連接肽的基因序列，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將該基因序列克隆至載體質(zhì)粒I中，獲得質(zhì)粒2 ；
2)以含有HSA的質(zhì)粒DNA為模版，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得兩端帶有合適限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的HSA的cDNA片段；
3)通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將編碼HSA的cDNA片段插入含有EMP 二聯(lián)體的基因的質(zhì)粒2中，獲得含編碼HSA與EMP 二聯(lián)體的融合蛋白的基因的質(zhì)粒3 ；
4)通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將編碼HSA與EMP二聯(lián)體的融合蛋白的基因從質(zhì)粒3亞克隆至表達(dá)載體質(zhì)粒4中，獲得含編碼HSA與EMP 二聯(lián)體的融合蛋白的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒5 ；
5)將步驟4)所述的重組表達(dá)質(zhì)粒5轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，再轉(zhuǎn)化到宿主表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，即得所述融合蛋白。其中步驟I)的質(zhì)粒I為可用于基因克隆的常見(jiàn)質(zhì)粒載體，優(yōu)選的是PUC57質(zhì)粒。其中步驟4)的質(zhì)粒4為可用于重組基因表達(dá)的常見(jiàn)質(zhì)粒載體，優(yōu)選酵母表達(dá)質(zhì)粒載體，更優(yōu)選的是PPICZa質(zhì)粒。其中步驟5)所述宿主是酵母。本發(fā)明還涉及含有上述融合蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體?？捎糜跀y帶編碼本發(fā)明融合蛋白的基因的表達(dá)載體包括但不局限于原核、真核表達(dá)系統(tǒng)常用的質(zhì)粒。本發(fā)明還涉及含有上述重組表達(dá)載體的宿主表達(dá)系統(tǒng)。宿主可以是細(xì)菌、酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，其中優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選的是畢赤酵母；對(duì)于重組表達(dá)的本發(fā)明融合蛋白可以通過(guò)多種方法從相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行提取、純化，這些方法包括離心、超濾及液相層析等技術(shù)，其中液相層析又包括了離子交換、疏水和分子篩等層析技術(shù)。人血清白蛋白(HSA)是血漿中的主要蛋白成分，是一種穩(wěn)定的惰性蛋白，并且具有長(zhǎng)達(dá)兩周以上的血漿半衰期，因此，常被用做藥物的載體。HSA由585個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為66. 5kDa,屬于非糖基化單鏈蛋白(A. Dugaiczyk et al. , PNAS, 1982, 79:71-75)。HSA已被成功地在多種宿主中進(jìn)行表達(dá)(EP330451和EP361991 )，尤其是人們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了 HSA在酵母細(xì)胞中的高水平穩(wěn)定表達(dá)。HSA在宿主細(xì)胞中是以一種原肽形式合成，其中由24個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽和前肽在轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌過(guò)程中能夠被自動(dòng)切除。當(dāng)目的多肽與HSA融合表達(dá)時(shí)不僅可以提高多肽藥物的穩(wěn)定性，而且還可以增加多肽藥物在體內(nèi)的半衰期。通過(guò)與HSA進(jìn)行融合表達(dá)，一些造血生長(zhǎng)因子包括EPO、G-CSF、GM-CSF以及干擾素等其它活性因子，都實(shí)現(xiàn)了藥物作用的長(zhǎng)效性(CN1727488A、CN1405181A、CN1405182A)。申請(qǐng)人:通過(guò)生物活性測(cè)定和代謝動(dòng)力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)表明，HSA-dEMP可以顯著促進(jìn)紅細(xì)胞的增殖，而且在體內(nèi)具有較長(zhǎng)的半衰期，說(shuō)明本發(fā)明所述融合蛋白保留了 EMP 二聯(lián)肽的促紅細(xì)胞增殖活性，并能在體內(nèi)維持較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明所述的融合蛋白可用于制備治療慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、腫瘤化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血等的藥物。本發(fā)明所述融合蛋白可以與藥物載體一起組成藥物制劑使用，這些藥物載體包括水、鹽水、糖類、醇類及氨基酸等。由本發(fā)明融合蛋白制成的藥物制劑優(yōu)選的是含水量低于3%或不含水的凍干制 劑。這些藥物制劑可以用于腎性貧血和其它原因所致貧血的治療，給藥方式包括靜脈輸注、注射(包括皮下和肌肉注射)、鼻內(nèi)、呼吸道等，其中優(yōu)選的是皮下或肌肉注射。本發(fā)明的優(yōu)越性本發(fā)明采用基因重組技術(shù)，將兩個(gè)頭尾串聯(lián)的促紅細(xì)胞生成素模擬肽EMP序列與人血清白蛋白HSA進(jìn)行融合，HSA和EMP 二聯(lián)體之間及兩個(gè)EMP之間設(shè)置有合適長(zhǎng)度的連接肽，通過(guò)與HSA融合不僅可以使EMP 二聯(lián)體能夠采用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)與制備，而且還可以達(dá)到顯著延長(zhǎng)EMP 二聯(lián)體半衰期的目的。本發(fā)明在保持EMP 二聯(lián)體較高生物活性的基礎(chǔ)上，同時(shí)解決EMP 二聯(lián)體的基因工程制備和半衰期短的難題。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。


圖I為pPICZ a / HSA-dEMP重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程；
圖2為HSA-dEMP編碼序列的5’端和3’端測(cè)序結(jié)果，其中A為5’端的測(cè)定序列包含了部分載體序列以及編碼HSA信號(hào)肽、前肽和N端成熟肽的序列；B、C為3’端的測(cè)定序列，其中B顯示的是編碼HSA的C末端數(shù)個(gè)氨基酸及連接肽的序列，C顯示的是編碼EMP 二聯(lián)體的序列；
圖3為HSA-dEMP融合蛋白的Western blot鑒定分析，其中I為HSA標(biāo)準(zhǔn)品，2為純化后的HSA-dEMP融合蛋白；
圖4為純化所得HSA-dEMP融合蛋白的SDS-PAGE純度分析結(jié)果，其中M為蛋白Marker，I為純化后的HSA-dEMP融合蛋白；
圖5為HSA-dEMP融合蛋白的體外促EPO依賴細(xì)胞株UT-7/Epo增殖分化活性分析，其中I為空白對(duì)照組，2為化學(xué)合成的EMP 二聯(lián)體多肽處理組，3為HSA處理組，4為HSA-dEMP融合蛋白處理組。圖6為HSA-dEMP融合蛋白在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)分析。圖7位HSA-dEMP融合蛋白對(duì)大鼠慢性腎性貧血的治療作用分析。
具體實(shí)施例方式主要實(shí)驗(yàn)材料
1.限制性核酸內(nèi)切酶I^Asu11,Not I,BamH I,Hind III，T4 DNA連接酶試劑盒為T(mén)aKara公司產(chǎn)品(中國(guó)大連)； 2.質(zhì)粒DNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品(美國(guó))；
3.DNA膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品(美國(guó))；
4.質(zhì)粒載體pPICZα、畢赤酵母菌株Χ-33為Invitrogen公司產(chǎn)品(美國(guó))；
5.大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞為Invitrogen公司產(chǎn)品(美國(guó))；
6.pUC57/HSA質(zhì)粒由本室構(gòu)建并保存(發(fā)明專利201110420870.0)；
7.UT-7/Epo細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和醫(yī)學(xué)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心(北京)；
8.Zeocin 購(gòu)自 Invitrogen 公司(美國(guó))；
9.SP陽(yáng)離子層介質(zhì)、Q陰離子層析介質(zhì)、疏水和分子篩等層析介質(zhì)及層析柱為GE公司產(chǎn)品(美國(guó))；
10.酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)xford公司(美國(guó))；
11.磷酸鹽緩沖液
NaCl8g
KClO. 2g
Na2HPO41.44g
KH2PO4O. 24g
溶于1000ml去離子水中，并用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 4，高壓蒸氣滅菌。12.LB 培養(yǎng)基 酵母提取物 5g
胰蛋白胨IOg
NaClIOg
溶于IOOOml去離子水中，并用ImoI/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，高壓蒸氣滅菌。13.YPD 培養(yǎng)基 酵母提取物 IOg
胰蛋白胨20g
Agar20g
溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻后加入IOOml經(jīng)濾器除菌后的20%的右旋糖和適當(dāng)濃度的Zeocin。14.YPDS 培養(yǎng)基 酵母提取物 IOg 胰蛋白胨 20g
山梨糖醇182. 2g
溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻后加入IOOml經(jīng)濾器除菌后的20%的右旋糖和適當(dāng)濃度的Zeocin。15.BMGY液體培養(yǎng)基 酵母提取物 IOg胰蛋白胨20g
無(wú)氨基酸酵母氮源 13. 4g 甘油IOg
磷酸鉀26.631g
溶于IOOOml雙蒸水中高壓滅菌，冷至室溫，調(diào)節(jié)pH至6. 0，4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例I :編碼EMP 二聯(lián)體及連接肽的cDNA序列的人工合成
I、首先根據(jù)EMP 二聯(lián)體及連接肽的氨基酸序列推導(dǎo)出其對(duì)應(yīng)的編碼核苷酸序列，并根據(jù)畢赤酵母偏愛(ài)密碼子對(duì)編碼序列進(jìn)行優(yōu)化，為了便于與HSA基因進(jìn)行融合，選擇將緊臨HSA的兩個(gè)氨基酸(Gly、Ser)的編碼序列設(shè)計(jì)為限制性內(nèi)切酶及_7 I的識(shí)別位點(diǎn)(ggatcc);同時(shí)，為了便于克隆，在該編碼核苷酸序列的5’端引入I酶切識(shí)別位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，在3’端引入Afoi I和/Ziz7i/ III的酶切識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)性堿基，最終所得核苷酸序 列如下(SEQ ID N0:7)
aRCRaa ttcffga tccggc gga ggt gga tct gga ggc ggt gga tct ggt ggt ggaact tattcc tgc cat ttt ggt cct ctg aca tgg gtg tgt aaa cct cag gga ggt cca tctgga ccagga ggt aca tac tct tgt cac ttt gga cca tta act tgg gtt tgc aaa cca caa ggt ggataa gcg gcc gcg aag ctt tgc
其中，5’端和3’端最外側(cè)3個(gè)堿基為保護(hù)性堿基序列，帶下劃線的堿基序列分別為EcoR 1和歷/^ III酶切識(shí)別位點(diǎn)，帶陰影的堿基序列分別為I和I酶切識(shí)別位點(diǎn)，斜體部分的堿基序列為編碼連接肽的序列，加粗部分的堿基序列為編碼EMP的序列。2、委托上海生工生物工程公司合成上述序列并將其裝載到pUC57質(zhì)粒中的及^7 I取Hind III酶切位點(diǎn)之間(pUC57質(zhì)粒載體由上海生工生物公司提供)，獲得質(zhì)粒pUC57/dEMP ο實(shí)施例2 :編碼HSA的cDNA片段的獲得 I、設(shè)計(jì)合成HSA基因的PCR引物
Pl (SEQ ID NO:8) :5' -age Raa ttc ttc gaa acg atg aag tgg gta acc ttt atttcc ctt c -3'
P2 (SEQ ID NO:9) :5' -gat gga tcc taa gcc taa ggc age ttg ac_ 3'
其中Pl中下劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶I識(shí)別位點(diǎn)序列，陰影部分堿基為限制性內(nèi)切酶II識(shí)別位點(diǎn)序列，加框部分堿基為翻譯起始密碼子序列；P2中陰影部分為限制性內(nèi)切酶及 # I的識(shí)別位點(diǎn)序列。2、PCR 擴(kuò)增
以pUC57/HSA質(zhì)粒DNA為模版(pUC57/HSA質(zhì)粒為本室保存，具體構(gòu)建方法參見(jiàn)發(fā)明專利201110420870. O),以Pl和P2分別作為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下①變性94°C,5min ;②變性94°C，lmin ;③復(fù)性55°C, Imin ;④延伸72°C,2min 返回步驟“②”，35循環(huán)；⑥延伸72°C，IOmin,總循環(huán)次數(shù)為35次。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增出約I. 9kb大小的DNA條帶，該條帶即為編碼HSA的cDNA片段，且其5’端帶有I,Asu II的識(shí)別位點(diǎn)，3’端帶有I的識(shí)別位點(diǎn)。實(shí)施例3 pPICZ a /HSA-dEMP重組表達(dá)載體的構(gòu)建 I、編碼HSA-dEMP的cDNA片段的克隆與測(cè)序?qū)?shí)施例I所得pUC57/dEMP質(zhì)粒DNA以及實(shí)施例2所得HSA的PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行EcoR I + BamH I雙酶切，膠回收酶切后的DNA片段，然后采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂于氨芐抗性LB板37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，篩選陽(yáng)性克隆。所得克隆送上海生工生物工程公司測(cè)序，序列正確的克隆命名為pUC57/HSA-dEMP。2、酵母表達(dá)載體pPICZ a /HSA-dEMP的構(gòu)建
提取上一步測(cè)序正確的pUC57/HSA-dEMP質(zhì)粒DNA，A / II和I雙酶切質(zhì)粒DNA，膠回收HSA-dEMP對(duì)應(yīng)的DNA片段。同時(shí)，Asw II和Afoi I雙酶切pPICZ a -ACInvitrogen公司產(chǎn)品)質(zhì)粒DNA，膠回收pPICZ a -A載體片段。采用Τ4 DNA酶將HSA-dEMP和pPICZ α -A載體進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行Zeocin抗性篩選，提取質(zhì)粒DNA，再用II和Afoi I雙酶切鑒定，將能夠切下約2. Okb大小DNA片段的質(zhì)粒送上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。整個(gè)pPICZ a /HSA-dEMP重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程如圖I所示，所得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果如圖2所示，由于編碼HSA-dEMP的序列較長(zhǎng)，為 了清楚顯示測(cè)定序列的正確性，特別選擇了關(guān)鍵部位的測(cè)序結(jié)果在圖2中進(jìn)行展示，其中A為5’端的測(cè)定序列包含了 pPICZ α載體的部分序列，以及編碼HSA信號(hào)肽、前肽(前24個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的DNA序列)和N端成熟肽的序列；B、C為3’端的測(cè)定序列，其中B顯示的是編碼HSA的C末端數(shù)個(gè)氨基酸及連接肽的序列，C顯示的是編碼部分連接肽及EMP 二聯(lián)體的序列。 采用限制性內(nèi)切酶fee I對(duì)測(cè)序正確的pPICZ a /HSA-dEMP質(zhì)粒DNA進(jìn)行線性化，膠回收DNA大片斷，轉(zhuǎn)化X-33感受態(tài)細(xì)胞，然后接種于Zeocin抗性YPDS平板，30°C培養(yǎng)3天后挑取克隆，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定。選取6個(gè)以上的陽(yáng)性克隆分別接種BMGY液體培養(yǎng)基，30°C進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，并用抗人HSA的單抗(R&D公司產(chǎn)品，美國(guó))進(jìn)行Western blot分析，顯色陽(yáng)性且分子量約為71kD左右蛋白條帶即為HSA-dEMP融合蛋白(圖3)，最后選擇表達(dá)水平最高的菌株作為工程菌，并放置于_80°C進(jìn)行保種凍存。實(shí)施例4: HSA-dEMP融合蛋白的表達(dá)與純化
將實(shí)施例3篩選出的高表達(dá)HSA-dEMP融合蛋白的酵母工程菌種接種于YPDS平板，30°C過(guò)夜培養(yǎng)活化，然后挑取單個(gè)菌落接種于BMGY培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)20h，然后按I 10轉(zhuǎn)種并繼續(xù)培養(yǎng)至0D_ 4，并以此菌液為種子液移種于裝有基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中(瑞士比歐公司)進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。每IL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有甘油50g、濃磷酸 12ml, KOH 2. 6g, CaSO4 · 2H20 O. 6g, K2SO4 9. 5g, MgSO4 · 7H20 7. 8g,生物素 0. 32mg, YTB溶液(內(nèi)含有 65g/L 的 FeSO4 · 7H20,6g/L 的 CuSO4 · 5H20, 20g/L 的 ZnSO4 · 7H20,6g/L 的MnSO4 · 5H20和0. 5%的濃硫酸)2ml。發(fā)酵條件選擇如下發(fā)酵溫度控制在30°C，溶解氧控制在30% 40%之間，pH值控制在6. O以下，培養(yǎng)至甘油耗盡后開(kāi)始流加甘油，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 150時(shí)開(kāi)始流加甲醇誘導(dǎo)，甲醇流加速率控制在1%左右。誘導(dǎo)表達(dá)72h后停止發(fā)酵，低溫離心取上清，隨后進(jìn)行純化。純化按以下方法進(jìn)行收集發(fā)酵上清并進(jìn)行超濾層析，以去除部分色素、降低鹽離子濃度和更換緩沖液(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH=7. O);隨后樣品過(guò)SP Sepharose FastFlow柱進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析,收集含有目的多肽的組分,然后再上Q Sepharose Fast Flow柱進(jìn)行陰離子交換層析，最后進(jìn)行Sephadex G_75凝膠層析，最終所得收集分離組分即為純化的HSA-dEMP融合蛋白，分子量約為71KD (如圖4所示)，HPLC測(cè)定其純度大于95%。實(shí)施例5 HSA-dEMP融合蛋白的體外生物活性測(cè)性
以EPO依賴的細(xì)胞株UT-7/Epo為觀察對(duì)象，采用CCK-8法(改良MTT法)檢測(cè)HSA-dEMP融合蛋白對(duì)該細(xì)胞的促增殖活性，具體操作如下取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的UT-7/Epo細(xì)胞，離心洗滌，再用僅含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)18-24h后收集進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并按5X 105/ml轉(zhuǎn)接至96孔U型板中，每孔IOOul。分別設(shè)立空白對(duì)照組(培養(yǎng)液中不含任何細(xì)胞因子)、HSA對(duì)照組(10nM)、EMP 二聯(lián)肽處理組(IOnM)及等摩爾濃度的HSA-dEMP融合蛋白處理組(ΙΟηΜ)，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)72h后每孔加入CCK-8試劑10ul，37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)6h后于酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)胞光密度值并分析細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，HSA-dEMP可以顯著促進(jìn)紅細(xì)胞的增殖(如圖5所示)，說(shuō)明本發(fā)明融合蛋白保留了 EMP 二聯(lián)肽的促紅細(xì)胞增殖活性。實(shí)施例6 HSA-dEMP融合蛋白在大鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)分析
給Wistar大鼠體內(nèi)皮下注射HSA-dEMP融合蛋白(150ug/kg)，于處理后2、12、24、48、72、96、120、144時(shí)間點(diǎn)取樣采血，應(yīng)用美國(guó)R&D公司的人HSA特異性ELISA檢測(cè)試劑盒，通過(guò)免疫吸附方法檢測(cè)大鼠血清中HSA-dEMP融合蛋白的濃度，并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從而推導(dǎo)出HSA-dEMP融合蛋白在受試大鼠血液中的半衰期約為96h (如圖6所示)。實(shí)施例7 HSA-dEMP融合蛋白對(duì)慢性腎衰大鼠貧血的治療作用分析
參照文獻(xiàn)方法(N印hron，1986，44: 230-234 ;中國(guó)生物制品雜志，1999，12 (I):32-35)，用含O. 75%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)Wistar大鼠7周，復(fù)制慢性腎性貧血大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。之后，給予模型大鼠單次皮下注射HSA-dEMP融合蛋白，劑量為150ug/kg，同時(shí)設(shè)置生理鹽水陰性對(duì)照組和化學(xué)合成EMP 二聯(lián)肽(與HSA-dEMP融合蛋白等摩爾濃度劑量)處理組，分別于HSA-dEMP融合蛋白處理后的第7、14、21天尾靜脈取血進(jìn)行血常規(guī)測(cè)定。結(jié)果顯示，單次給予HSA-dEMP融合蛋白治療可以顯著提升慢性腎衰大鼠外周血紅細(xì)胞水平(如圖7所示)，而單次給予等摩爾濃度的EMP 二聯(lián)肽則無(wú)顯著升紅細(xì)胞作用，從而提示HSA-dEMP融合蛋白對(duì)慢性腎性貧血具有較好的救治效果。結(jié)論本發(fā)明所公開(kāi)的HSA-dEMP融合蛋白及其制備方法在保持EMP 二聯(lián)體較高生物活性的基礎(chǔ)上，同時(shí)解決EMP 二聯(lián)體的基因工程制備和半衰期短的難題，為EMP 二聯(lián)體的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽EMP與人血清白蛋白HSA的融合蛋白，其特征在于，包含I個(gè)人血清白蛋白HSA和I個(gè)由兩個(gè)頭尾串聯(lián)的促紅細(xì)胞生成素模擬肽EMP組成的EMP 二聯(lián)體(cEMP)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述促紅細(xì)胞生成素模擬肽EMP的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，所述EMP 二聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與EMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)EMP之間均設(shè)有連接肽，所述融合蛋白用結(jié)構(gòu)式表示為HSA-dEMP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述EMP二聯(lián)體位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與EMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)EMP之間均設(shè)有連接肽，所述融合蛋白用結(jié)構(gòu)式表示為dEMP-HSA，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5中所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA與EMP二聯(lián)體之間以及兩個(gè)EMP之間的連接肽均由1-30個(gè)氨基酸殘基組成。
7.權(quán)利要求I所述的融合蛋白的制備方法，其特征在于，有以下步驟 1)獲取編碼EMP二聯(lián)體和連接肽的基因序列，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將該基因序列克隆至載體PUC57質(zhì)粒中，獲得質(zhì)粒pUC57/dEMP ； 2)以含有HSA的pUC57/HSA質(zhì)粒的DNA為模版，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得兩端帶有合適限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的HSA的cDNA片段； 3)通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將編碼HSA的cDNA片段插入含有EMP 二聯(lián)體的基因的質(zhì)粒pUC57/dEMP中，獲得含編碼HSA與EMP 二聯(lián)體的融合蛋白的基因的質(zhì)粒 pUC57/HSA-dEMP ； 4)通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將編碼HSA與EMP二聯(lián)體的融合蛋白的基因從質(zhì)粒pUC57/HSA-dEMP亞克隆至表達(dá)載體質(zhì)粒pPICZ a中，獲得含編碼HSA與EMP 二聯(lián)體的融合蛋白的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a /HSA-dEMP ； 5)將步驟4)所述的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa /HSA-dEMP轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，再轉(zhuǎn)化到宿主表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，即得所述融合蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟5)所述宿主是酵母。
9.一種含有權(quán)利要求I所述的融合蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體。
10.一種含有權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)載體的宿主表達(dá)系統(tǒng)。
11.權(quán)利要求I所述的融合蛋白在制備治療因慢性腎功能衰竭、腫瘤化療及失血所導(dǎo)致貧血的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽(EMP)與人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制備方法。所述融合蛋白由1個(gè)HSA和1個(gè)EMP二聯(lián)體(dEMP)構(gòu)成，其中HSA位于融合蛋白的N-末端，EMP二聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端，或EMP二聯(lián)體位于融合蛋白的N-末端，HSA位于融合蛋白的C-末端；在HSA與EMP二聯(lián)體之間以及兩個(gè)EMP之間均設(shè)有由柔性氨基酸組成的連接肽。所述融合蛋白不僅具有顯著促紅細(xì)胞生成活性，而且具有較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。
文檔編號(hào)A61K38/10GK102796201SQ20121032914
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者趙景宏, 王軍平, 申明強(qiáng), 聶凌, 楊惠標(biāo) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)