Cthrc1蛋白在制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及CTHRC1蛋白在制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用的藥物中的應(yīng)用。CTHRC1蛋白能有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合，并可避免激素類藥物的副作用。
【專利說明】CTHRC1蛋白在制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制藥應(yīng)用領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及CTHRCl蛋白在制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用的藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]一般來說，創(chuàng)面是正常皮膚(組織)在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時(shí)，皮膚的正常功能受損。也稱為傷口或者創(chuàng)傷。
[0003]創(chuàng)面愈合過程可以分為止血期、炎癥期、增生期和重塑期，它是機(jī)體固有的組織修復(fù)過程。
[0004]具體來說，止血期從創(chuàng)面形成的一瞬間開始，機(jī)體首先出現(xiàn)的反應(yīng)是自身的止血過程。這一過程包括一些非常復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng):先是創(chuàng)面周圍的小血管、毛細(xì)血管等反應(yīng)性收縮使局部血流量減少，即之而來的是暴露的膠原纖維吸引血小板聚集形成血凝塊；隨后血小板釋放血管活性物質(zhì)如5-羥色胺及前列腺素等，使血管進(jìn)一步收縮，血流減慢，同時(shí)釋放的磷脂和ADP將吸引更多的血小板聚集。最后，內(nèi)源性及外源性凝血過程也將被啟動(dòng)。凝血過程結(jié)束后，機(jī)體即開始進(jìn)行創(chuàng)面的愈合。
[0005]炎癥期開始自創(chuàng)面形成開始的前2-3天。由于局部血管的收縮，導(dǎo)致局部組織缺血，引起組織胺和其他血管活性物質(zhì)的釋放，使創(chuàng)面局部的血管擴(kuò)張；同時(shí)，因壞死組織，以及可能的致病微生物的存在，引發(fā)機(jī)體的防御反應(yīng)(炎癥反應(yīng)):免疫細(xì)胞如粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向創(chuàng)面移動(dòng)和集中。一方面，粒細(xì)胞防止或吞噬入侵的細(xì)菌，另一方面，巨噬細(xì)胞吞噬消化壞死的組織細(xì)胞碎片，同時(shí)，組織細(xì)胞破壞后釋放出來的自身蛋白溶酶也可以消化溶解壞死的組織細(xì)胞碎片，使創(chuàng)面清潔，以便啟動(dòng)組織的修復(fù)過程。巨噬細(xì)胞除吞噬消化組織細(xì)胞碎片外，同時(shí)也是刺激成纖維細(xì)胞增殖分化，合成膠原蛋白的關(guān)鍵因素。這一過程也被稱為清創(chuàng)階段。同時(shí)，創(chuàng)面會(huì)反應(yīng)性地出現(xiàn)收縮，以期減少創(chuàng)面面積。臨床上因這一時(shí)期的創(chuàng)面大多被黑色的壞死組織所覆蓋，因此也被稱為黑色期。而當(dāng)這一層壞死組織被清除后，創(chuàng)面仍會(huì)被一層薄薄的腐爛失活組織所覆蓋，使創(chuàng)面外觀呈黃色，因此臨床上分期時(shí)常將此時(shí)的創(chuàng)面稱為黃色期。
[0006]增生期開始自創(chuàng)面形成后的2-24天，上皮細(xì)胞再生創(chuàng)面修復(fù)首先是創(chuàng)面周緣健存的基底細(xì)胞開始增生，并向中心部位移行。與此同時(shí)，基底細(xì)胞的增殖刺激創(chuàng)面基底部毛細(xì)血管和結(jié)締組織的反應(yīng)性增生。當(dāng)創(chuàng)面被新生的上皮細(xì)胞覆蓋后，創(chuàng)面外觀呈粉紅色，故而又稱此時(shí)的創(chuàng)面為粉紅色期。肉芽組織形成隨后，基底細(xì)胞的增生刺激肉芽組織的生長。同時(shí)，巨噬細(xì)胞釋放的生長因子如血小板衍生生長因子(PDGF)，β轉(zhuǎn)型生長因子(β-TGF)和α轉(zhuǎn)型生長因子(α-TGF)等，加速肉芽組織的形成。肉芽組織的形成有著重要的生物學(xué)意義，主要表現(xiàn)在:(I)填補(bǔ)組織的缺損；(2)保護(hù)創(chuàng)面，防止細(xì)菌感染，減少出血；(3)機(jī)化血塊和壞死組織及其他異物由于新生健康的肉芽組織外觀呈鮮紅色，因此，臨床上又將此時(shí)的創(chuàng)面稱之為紅色期。隨著肉牙組織的不斷形成，創(chuàng)面組織的缺失被填充，上皮細(xì)胞便從創(chuàng)面周緣向中心移行，最終使得創(chuàng)面得以完全被再生的上皮細(xì)胞覆蓋。
[0007]然而，當(dāng)創(chuàng)面被再生的上皮細(xì)胞完全覆蓋后，創(chuàng)面的愈合過程并沒有完全結(jié)束。這就是創(chuàng)面的重塑期。因?yàn)樾律娜庋拷M織和上皮細(xì)胞還需要進(jìn)一步分裂分化、轉(zhuǎn)型，使其力量增強(qiáng)，才最后使創(chuàng)面得以完全愈合。這一過程主要表現(xiàn)在以下2個(gè)方面:
[0008](I)新形成的上皮細(xì)胞不斷分裂，使表皮層增厚；(2)肉芽組織內(nèi)部轉(zhuǎn)型:形成的膠原纖維排列發(fā)生改變，使新生的結(jié)締組織力量增加；同時(shí)，毛細(xì)血管數(shù)目減少，使創(chuàng)面局部顏色減退，接近于正常色。
[0009]正常的創(chuàng)面愈合需要全身和局部多種因素的協(xié)調(diào)，某些因素的不足或過度就可能造成病理性的創(chuàng)面愈合。延遲的創(chuàng)面愈合，包括難愈合創(chuàng)面就是對廣大患者個(gè)人、家庭及社會(huì)造成嚴(yán)重影響的最常見病理性創(chuàng)面愈合類型。而這種情況的發(fā)生，主要是由于不正常的炎癥和增生過程，其核心的一點(diǎn)是表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞不能及時(shí)覆蓋創(chuàng)面。角質(zhì)形成細(xì)胞及時(shí)覆蓋創(chuàng)面，不但意味著創(chuàng)面滲出的停止，感染可能和營養(yǎng)丟失的緩解，還可以避免繼發(fā)的過度瘢痕形成。因此，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的及時(shí)覆蓋，是治療創(chuàng)面的核心問題。
[0010]影響創(chuàng)面愈合的因素包括全身因素和局部因素。全身因素主要指年齡、性別、有無糖尿病、高血壓、營養(yǎng)狀況等，這些因素雖然重要，但往往難以干預(yù)，或者是僅能部分得到控制。因此，從改善局部因素著手，是治療創(chuàng)面的一個(gè)更重要的方向。而局部因素中，創(chuàng)面微環(huán)境起到了重要作用。細(xì)胞外基質(zhì)不僅是創(chuàng)面微環(huán)境的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它還包含了非常多的成分，如細(xì)胞因子、分泌蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、炎癥細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管外膜細(xì)胞等。其中部分成分不但為正常發(fā)育和組織器官修復(fù)、結(jié)構(gòu)功能維持所必需，對腫瘤、外傷、炎癥、畸形的發(fā)生、發(fā)展、維持和消退也起到重要影響。在創(chuàng)面愈合過程中也是如此，部分細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分的過多或者不足，可能對創(chuàng)面的愈合速度和質(zhì)量起到重要影響。
[0011]由此可見，創(chuàng)面是一個(gè)非常常見而且重要的臨床問題。外傷性創(chuàng)面、糖尿病足、靜脈瘀滯性潰瘍、壓力性潰瘍以及感染、腫瘤切除引起的創(chuàng)面發(fā)病率居高不下，且隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，有不斷增高趨勢。創(chuàng)面不但給患者帶來疼痛、影響工作、生活，還可能造成局部及全身感染可能，延遲愈合的創(chuàng)面往往造成嚴(yán)重的瘢痕，而經(jīng)久不愈的創(chuàng)面可能導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生。目前臨床可用的促進(jìn)創(chuàng)面愈合藥物非常有限，主要是生長因子類藥物及生長激素類藥物。但是效果不能讓人滿意，并且使用有局限性。因此，開發(fā)新的促進(jìn)創(chuàng)面愈合藥物仍然非常必要。
[0012]膠原三股螺旋重復(fù)蛋白I (collagen triple helix repeat containing
I,CTHRC1)是一種細(xì)胞外分泌蛋白，2005年首次被報(bào)導(dǎo)。最初發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞遷移，抑制膠原蛋白表達(dá)的作用，而且是TGF-β信號的負(fù)調(diào)節(jié)因子。后來發(fā)現(xiàn)其還和細(xì)胞分化，腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)(例如，參見王萍等，CTHRCl與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展，《生命科學(xué)》2010年08期；周琦等，宮頸癌組織中膠原三股螺旋重復(fù)蛋白I表達(dá)及臨床意義，《中華實(shí)用診斷與治療雜志》，2011年07期等)。但是，目前為止，CTHRCl與角質(zhì)形成細(xì)胞和創(chuàng)面愈合的關(guān)系還沒有報(bào)導(dǎo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供CTHRCl蛋白在制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用的藥物中的應(yīng)用。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的CTHRCl蛋白選自重組人CTHRCl蛋白或重組小鼠CTHRCl 蛋白。
[0015]所述的創(chuàng)面可以發(fā)生在哺乳動(dòng)物，特別是人和小鼠的身上。
[0016]具體來說，發(fā)明人下面通過小鼠創(chuàng)面標(biāo)本和人正常皮膚及瘢痕標(biāo)本免疫組化證實(shí)，CTHRCl在正常皮膚上皮中基本不表達(dá)，而在創(chuàng)面愈合過程中高表達(dá)，說明它與創(chuàng)面愈合有相關(guān)性。而根據(jù)CTHRCl在其它細(xì)胞中具有促進(jìn)遷移和抑制膠原蛋白表達(dá)的作用，發(fā)明人推測其可能具有加快創(chuàng)面愈合，改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量的作用。為了驗(yàn)證該假說，發(fā)明人構(gòu)建了小鼠源性和人源性CTHRCl蛋白表達(dá)載體，表達(dá)并純化了重組蛋白。接著通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 CTHRCl重組蛋白不明顯影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，但可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移，促進(jìn)小鼠創(chuàng)面愈合。這些結(jié)果揭示了 CTHRCl蛋白具有成為促進(jìn)創(chuàng)面愈合外用藥物的潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1a 為人真皮成纖維細(xì)胞(Human dermal fibroblasts, HDF)及 HaCaT 細(xì)胞CTHRCl的mRNA表達(dá)水平的柱形圖。
[0018]圖1b為人真皮成纖維細(xì)胞及HaCaT細(xì)胞CTHRCl的蛋白表達(dá)水平的柱形圖。
[0019]圖1c為在炎癥因子TGF-β I誘導(dǎo)下(2ng/ml)，HaCaT細(xì)胞CTHRCl的mRNA表達(dá)水平的柱形圖。
[0020]圖1d為正常人皮膚和人未成熟瘢痕的照片。
[0021]圖1e為正常人體皮膚表皮和在未成熟瘢痕表皮中的CTHRCl表達(dá)水平的柱形圖。
[0022]圖1f為正常小鼠皮膚和小鼠創(chuàng)面皮膚的照片。
[0023]圖1g為正常小鼠皮膚和小鼠創(chuàng)面皮膚中的CTHRCl表達(dá)水平的柱形圖。
[0024]圖2a為從合成的小鼠CTHRCl編碼區(qū)中PCR出帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的編碼CTHRCl蛋白的核苷酸序列的瓊脂糖電泳圖。
[0025]圖2b為雙酶切V152、V162載體及CTHRCl編碼序列PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。
[0026]圖2c為所述的雙酶切產(chǎn)物膠回收后經(jīng)轉(zhuǎn)化后選取的8個(gè)單克隆(clonel、clone2、clone3、clone4、clone5、clone6、clone7 和 clone8)的瓊脂糖電泳圖。
[0027]圖2d為clonel經(jīng)測序驗(yàn)證后表達(dá)的CTHRCl重組蛋白的Western blot圖。
[0028]圖3為實(shí)施例三進(jìn)行的劃痕實(shí)驗(yàn)的照片及相應(yīng)的柱狀圖。
[0029]圖4為實(shí)施例四進(jìn)行的增殖實(shí)驗(yàn)的柱狀圖。
[0030]圖5為實(shí)施例五中小鼠創(chuàng)面愈合照片和相應(yīng)的柱狀圖。
[0031]下面基于具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。

【具體實(shí)施方式】
[0032]預(yù)備實(shí)施例、免疫組化步驟；
[0033]人正常皮膚及未成熟瘢痕組織、成熟瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織及小鼠創(chuàng)面組織多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟至水；檸檬酸鈉緩沖液水浴抗原修復(fù)；0.3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；10%BSA室溫封閉I小時(shí)；一抗4度過夜，PBS清洗3次；二抗室溫孵育I小時(shí)，PBS清洗3次；DAB發(fā)色，自來水洗10分鐘；蘇木素復(fù)染10秒，自來水洗10分鐘；脫水透明后封片。
[0034]實(shí)施例一、CTHRCl在體外及體內(nèi)的表達(dá)；
[0035]實(shí)時(shí)定量PCR (Real time PCR):
[0036]RNA提取:①6厘米培養(yǎng)皿中HDF及HaCaT細(xì)胞生長至80_90%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，1*PBS洗一次，加入RNAiso Plus(購自Takara，中國大連)300μ 1，以細(xì)胞刮勺刮下細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至離心管，移液槍反復(fù)吹吸至裂解液中無肉眼可見沉淀。室溫放置5分鐘。②加Λ 60 μ I氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5分鐘。12，000g4°C離心15分鐘。③將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中并加入與上清液等體積的異丙醇，室溫靜置10分鐘。12，000g4°C離心10分鐘。④棄去上清，向沉淀中加入lml75%的乙醇清洗沉淀，12，000g4°C離心5分鐘。⑤棄上清并室溫干燥沉淀，溶解于適量DEPC處理水中，并測定濃度。
[0037]反轉(zhuǎn)錄:配制10 μ I反應(yīng)體系如下,5 X PrimeScriptTM緩沖液(購自Takara,中國大連)2.0 μ I, Random6mers (購自 Takara,中國大連)(100 μ M) 0.5 μ I, PrimeScriptTMRT Enzyme Mixl (Takara,中國大連)0.5 μ 1，Oligo dT Primer (購自 Takara,中國大連)(50 μ Μ) 0.5 μ I,總 RNA (購自 Takara,中國大連)500ng, RNase Free dH20 (購自 Takara,中國大連)加至總體積10 μ I。反轉(zhuǎn)錄條件為:37°C 30分鐘，850C 5秒鐘，4°C保存。
[0038]實(shí)時(shí)定量PCR:采用ABI PRISM7300實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)。反應(yīng)體系配制(10 μ I):SYBR Premix Ex TaqTM(購自 Takara,中國大連)(2 X) 5 μ 1，PCR Forward Primer (購自 Takara,中國大連)(10 μ M) 0.4 μ I, PCR Reverse Primer (購自 Takara,中國大連)(10 μ Μ) 0.4 μ 1，ROX參照染料(購自Takara，中國大連)(50 X) 0.2 μ 1，DNA模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以dH20稀釋40倍)I μ I, dH203 μ I。反應(yīng)條件為:階段195°C，30秒；階段295°C 5秒，600C 31秒，循環(huán)40次； 階段395°C 15秒，60°C 30秒，95°C 15秒。結(jié)果與GAPDH表達(dá)水平采用2-dt CT法定量比較。
[0039]Western blot:①6厘米培養(yǎng)皿中HDF及HaCaT細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，1*PBS洗一次，冰上放置，加入300 μ IlX負(fù)載緩沖液(loading buffer)，刮下細(xì)胞，冰上放置I到2分鐘。沸水浴變性10分鐘后放置于冰上。②聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離膠濃度10%);③轉(zhuǎn)膜，條件為恒流300mA，90分鐘5%脫脂牛奶室溫封閉I小時(shí)后孵育一抗，CTHRCl小鼠單抗(杭州華安生物技術(shù)有限公司制備)，4°C過夜過I X TBS洗4次，每次5分鐘后避光孵育抗小鼠熒光二抗，室溫I小時(shí)；?掃膜后Image J軟件半定量。
[0040]免疫組織化學(xué)染色
[0041]人正常皮膚及未成熟瘢痕組織、成熟瘢痕組織、瘢痕疙瘩組織及小鼠創(chuàng)面組織多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟至水；檸檬酸鈉緩沖液水浴抗原修復(fù)；0.3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；10%BSA室溫封閉I小時(shí)；一抗4度過夜，PBS清洗3次；二抗室溫孵育I小時(shí)，PBS清洗3次；DAB發(fā)色，自來水洗10分鐘；蘇木素復(fù)染10秒，自來水洗10分鐘；脫水透明后封片。
[0042]如圖1所示，CTHRCl在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)水平極低，幾乎不能被檢出。圖1a所不為人真皮成纖維細(xì)胞(Human dermal fibroblasts, HDF)及HaCaT細(xì)胞CTHRCl的mRNA表達(dá)水平，圖1b所示為二者CTHRCl的蛋白表達(dá)水平。但是在炎癥因子TGF-β I誘導(dǎo)下(2ng/ml)，HaCaT細(xì)胞CTHRCl的mRNA表達(dá)水平可以明顯上調(diào)(參見圖lc)。在正常人體皮膚表皮中，通過免疫組化的方法幾乎檢測不到CTHRCl蛋白的表達(dá)，但是在愈合不久的未成熟瘢痕表皮中，可見CTHRCl蛋白表達(dá)明顯增加(參見圖1d和圖le)。類似的結(jié)果通過C57小鼠創(chuàng)面模型也得到了驗(yàn)證，在小鼠正常皮膚表皮中，CTHRCl蛋白幾乎不表達(dá)，但是在創(chuàng)面愈合過程中，CTHRCl蛋白的表達(dá)水平均明顯增加(參見圖1f和圖1g)。
[0043]實(shí)施例二、小鼠源性及人源性CTHRCl重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)、純化；
[0044]①查詢小鼠源性及人源性CTHRCl基因⑶S序列并合成；
[0045]②合成PCR引物，并從⑶S序列中PCR出包含酶切位點(diǎn)的CTHRCl序列；
[0046]③雙酶切PCR產(chǎn)物及載體質(zhì)粒；
[0047]④酶切產(chǎn)物電泳，膠回收后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a細(xì)菌，并涂板，挑單克隆，搖菌，菌液PCR、酶切及測序驗(yàn)證；
[0048]⑤驗(yàn)證成功后提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293吉?jiǎng)P細(xì)胞，兩天后篩選，篩選穩(wěn)定后收上清；
[0049]⑥親和柱層析法純化重組蛋白并測定濃度,分裝，western blot鑒定。
[0050]小鼠CTHRCl重組蛋白表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)、純化、鑒定過程及結(jié)果為:首先從合成的小鼠CTHRCl編碼區(qū)中PCR出帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的編碼CTHRCl蛋白的核苷酸序列，并經(jīng)瓊脂糖電泳驗(yàn)證分子量，如圖2a所示。然后雙酶切V152、V162載體及CTHRCl編碼序列PCR產(chǎn)物，以瓊脂糖電泳分離，如圖2b所示。雙酶切產(chǎn)物膠回收后4度水浴連接16小時(shí)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a細(xì)菌，并涂板，挑單克隆八個(gè)，搖菌后菌液PCR驗(yàn)證連接是否成功，如圖2c所示。挑選其中一個(gè)測序，完全吻合后搖菌提質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染293吉?jiǎng)P細(xì)胞后嘌呤霉素篩選，收集上清，然后以親和柱層析發(fā)純化蛋白，測定濃度后分裝，以Western blot驗(yàn)證,如圖2d所示。人CTHRCl重組蛋白與此相同，僅合成⑶S序列不同。
[0051]實(shí)施例三、體外角質(zhì)形成細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；
[0052]永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)細(xì)胞種入24孔板(3X 105/ml)，以含10% FBS的DMSO培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩天左右細(xì)胞生長融合。換液為含1%FBS的DMEM，24小時(shí)后用移液器小槍頭垂直皿底輕輕劃痕，以PBS清洗3次，去除漂浮細(xì)胞。然后每孔加入含不同濃度重組人CTHRCl蛋白(Onm，lnm, 1nm, 10nm)的培養(yǎng)基(含1%FBS的DMEM)500 μ I。放入活細(xì)胞工作站，每6小時(shí)拍照一次至24小時(shí)。測量每個(gè)視野縮小的面積并統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，算出均值后以Student’ T檢驗(yàn)法比較各組間P值，P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0053]角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移是創(chuàng)面愈合過程中核心的細(xì)胞過程，遷移較快意味著創(chuàng)面愈合加速。如圖3所示，通過劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組人CTHRCl蛋白可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞遷移，而且這種作用有濃度依賴性。
[0054]實(shí)施例四、體外角質(zhì)形成細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)；
[0055]HaCaT細(xì)胞以含10% FBS的DMSO培養(yǎng)基培養(yǎng)至70-80%融合時(shí)消化并種入96孔板，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，每孔種入加入含2000個(gè)細(xì)胞的100 μ I培養(yǎng)基。24小時(shí)后換液為含1%FBS的DMEM并加入不同濃度人源性重組CTHRCl蛋白(Onm，lnm, 1nm,10nm),每兩天換液I次,每兩天以CCK-8法測定波長450nm0D值一次。測定至加蛋白后第6天。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，算出均值后以Student’ T檢驗(yàn)法比較各組間P值，P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0056]結(jié)果顯示，重組人CTHRCl蛋白對HaCaT細(xì)胞體外增殖無明顯影響；角質(zhì)形成細(xì)胞增殖也是和創(chuàng)面愈合密切相關(guān)的細(xì)胞過程，如圖4所示，重組人CTHRCl蛋白在促進(jìn)HaCaT細(xì)胞遷移的濃度范圍內(nèi)，對HaCaT細(xì)胞體外增殖沒有明顯影響。
[0057]實(shí)施例五、小鼠創(chuàng)面愈合模型的建立及重組蛋白處理，創(chuàng)面愈合過程的觀察。
[0058]實(shí)驗(yàn)開始前I天小鼠背部剃毛后以10%硫化鈉脫毛。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)標(biāo)記小鼠背部4個(gè)創(chuàng)面位置，前兩個(gè)創(chuàng)面中點(diǎn)為耳后1.5厘米，背部中線兩次各0.5厘米，另兩個(gè)創(chuàng)面中點(diǎn)為前兩個(gè)創(chuàng)面中點(diǎn)后1.5厘米。創(chuàng)面直徑均為5毫米。畫線后以銳利眼科剪剪去全層皮膚。每天創(chuàng)面給藥一次，分別為空白對照，Onm重組蛋白(即蛋白稀釋液)，1nm小鼠源性重組CTHRCl蛋白，40nm小鼠源性重組CTHRCl蛋白。每天創(chuàng)面大小拍照。共6只小鼠，各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面大小以Student’ T檢驗(yàn)法比較各組間P值，P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0059]如圖5所示，發(fā)明人構(gòu)建了 C57小鼠創(chuàng)面模型，并且將重組小鼠CTHRCl蛋白外用，每日I次，然后觀察創(chuàng)面愈合速度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面直接外用CTHRCl蛋白可以有效促進(jìn)小鼠創(chuàng)面的愈合。
[0060]本發(fā)明據(jù)此發(fā)現(xiàn)了 CTHRCl蛋白外用促進(jìn)創(chuàng)面愈合藥物的潛力，它能有效地幫助創(chuàng)面愈合，并可避免激素類藥物的副作用。
【權(quán)利要求】
1.CTHRCl蛋白在制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的CTHRCl蛋白選自重組人CTHRCl蛋白或重組小鼠CTHRCl蛋白。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的創(chuàng)面發(fā)生在哺乳動(dòng)物上。
4.如權(quán)利 要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是人或小鼠。
【文檔編號】A61P17/02GK104043106SQ201310080556
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月13日
【發(fā)明者】張志剛, 劉曉瑾, 楊小妹 申請人:上海市腫瘤研究所