一種二氫楊梅素在白血病細胞周期阻滯藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種二氫楊梅素在治療白血病藥物中的應用，更進一步是提供在一種二氫楊梅素在白血病細胞周期阻滯藥物或白血病細胞繼續(xù)分化藥物中的應用。本發(fā)明的優(yōu)點在于，公開了二氫楊梅素在治療惡性增殖性白血病方面的作用機理，具體來說，二氫楊梅素可以通過誘導白血病細胞的細胞周期發(fā)生阻滯，從而擾亂白血病細胞的代謝活動與增殖機能，進一步誘發(fā)白血病細胞的死亡或凋亡，從而達到對白血病細胞的抑制作用。本發(fā)明為二氫楊梅素治療白血病提供了理論支持，填補了二氫楊梅素在治療白血病應用上的空白。
【專利說明】一種二氫楊梅素在白血病細胞周期阻滯藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及二氫楊梅素的應用，更具體地，涉及一種二氫楊梅素在白血病細胞周期阻滯藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖毎驗樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他組織和器官，同時正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結腫大和骨骼疼痛。據(jù)報道，我國各地區(qū)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中占第六位，是一類嚴重危害人民健康的惡性疾病。因此，尋找與開發(fā)治療白血病，抑制白血病細胞增殖的藥物，可有效延長白血病患者的生存時間，并提聞患者的生存質量。
[0003]二氫楊梅素(Dihydromyricetin, DHM),又名蛇葡萄素(Ampelopsin)。提取自葡萄科蛇葡萄屬植物藤茶的葉中，屬黃酮類化合物，其分子式為C15H1208 (圖1)。已有的對二氫楊梅素的研究主要集中在其保肝護肝作用上，如已證實的DHM可加速乙醇代謝產(chǎn)物乙醛的快速分解，從而降低酒精對肝臟的損害，同時可改善肝細胞損傷引起的血清乳酸脫氫酶活力增加，抑制肝性Μ細胞膠原纖維形成等。目前雖然有將二氫楊梅素作為治療白血病藥物的報道，但是對其作用的機理以及最后的作用的方向并沒有做相關的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于，提供二氫楊梅素的新應用。
[0005]本發(fā)明提供一種二氫楊梅素在白血病細胞周期阻滯藥物中的應用。
·[0006]所述的白血病細胞為惡性增殖性白血病細胞。
[0007]所述的細胞周期阻滯為細胞群內(nèi)處于G0/G1期，S期或G2/M期中任意時期的細胞比例發(fā)生變化.所述的白血病細胞周期阻滯為，阻滯早幼粒白血病細胞在G0/G1期。
[0008]所述的白血病細胞周期阻滯為，對于急性淋巴瘤細胞系U937和慢性髓源白血病細胞系Κ562，DHM對其周期的阻滯作用則主要發(fā)生在S期。
[0009]根據(jù)需求在一種二氫楊梅素在白血病細胞繼續(xù)分化藥物中的應用。
[0010]所述的白血病細胞繼續(xù)分化是指提高⑶11和⑶14的表達量。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點如下:
公開了二氫楊梅素在治療惡性增殖性白血病方面的作用機理，具體來說，二氫楊梅素可以通過誘導白血病細胞的細胞周期發(fā)生阻滯，從而擾亂白血病細胞的代謝活動與增殖機能，進一步誘發(fā)白血病細胞的死亡或凋亡，從而達到對白血病細胞的抑制作用。本發(fā)明為二氫楊梅素治療白血病提供了理論支持，填補了二氫楊梅素在治療白血病應用上的空白。
【專利附圖】

【附圖說明】[0012]圖1: 二氫楊梅素分子式。
[0013]圖2:不同濃度二氫楊梅素對HL-60細胞的細胞周期阻滯作用流式結果。
[0014]圖3:不同濃度二氫楊梅素對U937細胞的細胞周期阻滯作用流式結果。
[0015]圖4:不同濃度二氫楊梅素對K562細胞的細胞周期阻滯作用流式。
[0016]圖5:不同濃度二氫楊梅素對HL-60細胞表面抗原⑶11和⑶14表達的影響。
[0017]圖6:不同濃度二氫楊梅素對U937細胞表面抗原⑶11和⑶14表達的影響。
[0018]圖7:不同濃度二氫楊梅素對K562細胞表面抗原⑶11和⑶14表達的影響。
[0019]圖8:不同濃度二氫楊梅素處理HL-60細胞，NBT陽性程度檢測結果。
【具體實施方式】
[0020]下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設備和方法為本【技術領域】常規(guī)市購的試劑、設備和常規(guī)使用的方法。
[0021]實施例1 二氫楊梅素對白血病細胞系細胞周期阻滯的作用一、背景簡介
細胞的生命開始于產(chǎn)生它的母細胞的分裂，結束于它的子細胞的形成，通常將通過細胞分裂產(chǎn)生的新細胞的生長開始到下一次細胞分裂形成子細胞結束為止所經(jīng)歷的過程稱為細胞周期。在這一過程中，細胞的遺傳物質復制并均等地分配給兩個子細胞。細胞周期分為G0/G1期:從有絲分裂到DNA復制前的一段時期，又稱合成前期，此期主要合成RNA和核糖體；S期(synthesis):即DNA合成期，在此期，細胞進行DNA合成，同時進行必要的蛋白質合成；G2/M期:DNA合成后期，是有絲分裂的準備期以及有細胞分裂期。
[0022]在一個增殖的細胞群中，并非所有的細胞都是同步增殖的，因此在進行細胞周期檢測的時候，同時檢測到處于不同周期階段的細胞。正常情況下在一個細胞群中，處于各階段的細胞的比例是相對穩(wěn)定的，但在受到外界不利環(huán)境的刺激下，細胞周期圖譜會發(fā)生變化，使得處于某一階段的細胞總數(shù)突然增多，這種現(xiàn)象稱為細胞周期阻滯，即細胞分裂因某種原因停滯在某一時相，而較難以進入下一時相的現(xiàn)象。周期阻滯可以導致細胞內(nèi)代謝紊舌L從而誘導細胞進一步出現(xiàn)細胞增殖障礙，凋亡或細胞死亡等。
[0023]在細胞周期圖譜中，第一道峰(高)所占面積代表G0/G1期細胞占總細胞數(shù)的比例；第二道峰(低)所占面積代表G2/M期細胞占總細胞的比例；兩峰之間的梯形面積為S其細胞占總細胞的比例。
[0024]二、DHM對細胞周期的抑制作用主要試驗材料:二氫楊梅素(Dihydromyrictin, DHM, Sigma)溶解于二甲亞砜(DMSO)中，配制成50 mM濃縮液，-20 °C保存，使用時分別稀釋為10，20，30，和40 μΜ，即配即用；細胞周期與細胞凋亡試劑盒(碧云天)。
[0025]試驗方法:將細胞消化，離心并重懸浮于相應培養(yǎng)液中，以3Χ 105/皿的密度種植于60 mm培養(yǎng)皿中，置于37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移除原培養(yǎng)液，加入新鮮配制的，分別含有10，20，和30 μΜ DHM的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后終止培養(yǎng)，按細胞周期與細胞凋亡試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀檢測。
[0026]試驗結果:結果顯示，DHM對不同類型的白血病細胞均有細胞分裂周期的阻滯作用，從而使細胞不能順利分裂增殖。但是，不同細胞型在DHM作用下會被阻滯在細胞周期的不同時期。對于早幼粒白血病細胞HL-60，DHM的作用可有效將其細胞周期阻滯在G0/G1期(圖2);對于急性淋巴瘤細胞系U937和慢性髓源白血病細胞系K562，DHM對其周期的阻滯作用則主要發(fā)生在S期(圖3，4)。
[0027]實施例2 二氫楊梅素對白血病細胞的繼續(xù)分化作用一、背景簡介
細胞分化受阻是克隆性白血病的致病原因之一。分化受阻使得大量低分化，無正常功能的細胞在血液中大量增殖，從而導致機體功能異常。通過藥物作用使白血病患者血液中低分化的病變細胞能夠繼續(xù)分化成為分化程度較高的功能性細胞，從而降低其無限增殖的能力，并產(chǎn)生正常的細胞功能，是治療白血病的有效方法之一。
[0028]⑶11和⑶14是細胞表面的抗原標志物，它們的表達量與細胞的分化程度呈正相關，即:未分化細胞的CD11和CD14表達量較低，已分化的功能性細胞，其表面的CD11和CD14增高。
[0029]細胞分化過程耗氧量增加，磷酸已糖旁路代謝活動增強，葡萄糖-6-磷酸氧化脫氫。此時若向其中加入硝基四氮唑藍(NBT)，NBT中的四氮唑基可接受葡萄糖-6-磷酸脫下的氫，生成甲脘基使原先呈淡黃色的NBT還原生成點狀或塊狀的藍紫色沉淀，通過檢測其吸光度的變化，即可判定細胞是否處于分化階段。
[0030]本試驗證明二氫楊梅素可有效地提高白血病細胞表面⑶11和⑶14的表達量，并增強白血病細胞中磷酸已糖旁路代謝活動，促進白血病細胞從低分化狀態(tài)逐漸向功能性細胞分化，從而減少對機體的損害，達到治療白血病的作用。
[0031]二、二氫楊梅素對⑶11和⑶14表達的影響
細胞系:本試驗使用三種不同類型的白血病細胞系:早幼粒白血病細胞HL-60 ;急性淋巴瘤細胞系U937和慢性髓源白血病細胞系K562。
`[0032]主要試驗材料:DHM，溶解于二甲亞砜(DMS0)中，配制成50mM濃縮液，-20 °〇保存，使用時分別稀釋為10，20和30 μ M，即配即用；CD11, CD14流式抗體(BD Pharmingen)；Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium (eBioscience) ;PBS ;60mm 培養(yǎng)皿，流式專用
上樣管。
[0033]試驗方法:將細胞消化成細胞懸液后，以合適的密度鋪于60 mm培養(yǎng)皿中，于37°C，5 % 0)2培養(yǎng)箱中孵育約24 h，待細胞生長至占培養(yǎng)皿底部50%左右時，移除原培養(yǎng)液，加入新鮮配制的，分別含有5，10，20 μ M DHM的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后小心收集上清液并使用Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium消化細胞,將細胞懸液與上清液混合離心，將收集到的細胞用4°C預冷的PBS洗滌兩次，調整細胞濃度至106/100 μ L，加入抗體，避光孵育20 min，用冷PBS洗去多余抗體，使用流式細胞儀檢測CD11和CD14的表達量變化。
[0034]試驗結果:在流式圖像上，峰的右移表示熒光增強，進一步代表抗原的表達升高。在本試驗中，無論是HL-60，U937還是K562，在施加大于20 μ M DHM處理后，峰圖均有明顯的右移趨勢，說明大于20 μ Μ劑量的DHM可有效誘導白血病細胞的分化(圖5~7)。
[0035]三、ΝΒΤ法檢測二氫楊梅素對白血病細胞分化的作用細胞系:本試驗使用的細胞系為早幼粒白血病細胞HL-60
試驗材料:DHM，溶解于二甲亞砜(DMS0)中，配制成50mM濃縮液，-20 °C保存，使用時分別稀釋為10，20和30 μ M，即配即用;硝基四氮唑藍(NBT，Sigma)溶于PBS中，質量分數(shù)為0.2%，4°C保存，配制后一周內(nèi)使用;胰酶(Gibco) ；PBS ；96孔板(Nunc)。
[0036]試驗方法:將細胞消化，離心并重懸浮于相應培養(yǎng)液中，以1 X 104/孔的密度種植于96孔板，置于37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移除原培養(yǎng)液，加入新鮮配制的，分別含有5，10，20和30 μ M DHM的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后終止培養(yǎng)，向每孔加入10 μ L ΝΒΤ，再重新置于37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，取出3~5 X 105個細胞，離心后加入DMS0混勻，酶標儀0D 570nm處檢測各孔的吸光值。每個濃度設置三個重復組。
[0037]試驗結果:結果顯示隨著DHM處理劑量的增加，各組細胞的分化程度依次增高。說明DHM可有效誘導低分化的白血病細胞進行進一步的分化，從而達到治療白血病的目的(圖 8)?！?br> 【權利要求】
1.一種二氫楊梅素在白血病細胞周期阻滯藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的白血病細胞周期阻滯為，阻滯早幼粒白血病細胞在G0/G1期。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的白血病細胞周期阻滯為，對于急性淋巴瘤細胞系U937和慢性髓源白血病細胞系K562，DHM對其周期的阻滯作用則主要發(fā)生在S期。
【文檔編號】A61K31/352GK103622948SQ201310440803
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權日:2013年9月25日
【發(fā)明者】朱潤芝, 李明意, 夏娟, 劉潔, 劉斌, 張慶余 申請人:廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院