組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽錆摲《炯せ顒┲械膽?yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽洳《緝?chǔ)存庫(kù)重激活藥物中的應(yīng)用以及含有苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿┑慕M合物。所述組合物對(duì)人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等多種持續(xù)性感染病毒的儲(chǔ)存庫(kù)具有顯著的激活作用,可以與抗病毒制劑聯(lián)合使用以獲得良好的治療效果。
【專利說(shuō)明】組蛋白去乙酰化酶抑制劑在制備潛伏病毒激活劑中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類針對(duì)持續(xù)性感染病毒體內(nèi)儲(chǔ)存庫(kù)的重激活藥物，屬于微生物學(xué)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 持續(xù)性病毒感染是指機(jī)體長(zhǎng)期持續(xù)的感染狀態(tài)，由于入侵的病毒不能殺死宿主細(xì) 胞，因而兩者之間形成共生平衡，感染者可長(zhǎng)期或終生帶毒，并經(jīng)?；蚍磸?fù)不定期的向外排 毒，但常缺乏出現(xiàn)與免疫病理有關(guān)的臨診癥狀。清除病毒潛伏感染細(xì)胞所構(gòu)成的潛伏儲(chǔ)存 庫(kù)是持續(xù)性病毒感染疾病治愈的關(guān)鍵。引起人類持續(xù)感染的病毒包括人類免疫缺陷病毒 (Human Immunodeficiency Virus, HIV)、乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV)、丙型肝炎 病毒（Hepatitis C Virus, HCV)和巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus, CMV)等。
[0003] HIV
[0004] 獲得性免疫缺陷綜合癥（Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)是由 HIV 感染引起的，已成為嚴(yán)重威脅世界人民健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。聯(lián)合國(guó)數(shù)據(jù)顯示到目前為止， 全世界共有3400萬(wàn)人感染了 HIV或患AIDS，迄今已造成3000多萬(wàn)人死亡。1996年以來(lái)，高 效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法（Highly Active Anti-retroviral Therapy, HAART)聯(lián)合使用三種或 三種以上的抗病毒藥物，使得AIDS從一種致死性疾病變?yōu)橐环N可控的慢性病。盡管HAART 能夠有效減緩疾病進(jìn)程，但并不能從根本上治愈感染者，一旦停藥便立即反彈。HIV不能被 完全清除的主要原因，是由于HIV的潛伏感染細(xì)胞所構(gòu)成的潛伏儲(chǔ)存庫(kù)存在。HIV潛伏病毒 儲(chǔ)存庫(kù)主要由HIV潛伏感染的靜息⑶4+T淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、造血細(xì)胞等構(gòu)成，其 主要特征：一是整合后潛伏，即整合在宿主細(xì)胞基因組上的前病毒發(fā)生基因沉默，避免了免 疫系統(tǒng)和抗反轉(zhuǎn)錄酶病毒的藥物攻擊，一旦條件適當(dāng)，病毒又能恢復(fù)復(fù)制能力；二是感染個(gè) 體攜帶潛伏感染細(xì)胞數(shù)量雖少，但衰減率較慢，以至于僅靠 HAART治療將其徹底清除是不 可能的，因此HIV潛伏病毒儲(chǔ)存庫(kù)是目前臨床治療不能徹底清除HIV的巨大障礙。
[0005] 盡管已達(dá)成共識(shí)認(rèn)為重激活病毒儲(chǔ)存庫(kù)是HIV治愈關(guān)鍵性的第一步，但目前世界 上尚沒(méi)有儲(chǔ)存庫(kù)重激活的上市藥物。組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi)、甲基化抑制劑以及 Bryologs化合物是目前研究極具潛力的三類化合物。
[0006] 藥物Prostratin是從薩摩亞的藥用植物Homolan thusnutans中提取出的一種佛 波酯。Prostratin可結(jié)合和激活蛋白激酶C，介導(dǎo)刺激HIV的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而將潛伏在免疫細(xì)胞 內(nèi)的病毒釋放。此后設(shè)計(jì)合成了一組Bryostatin類似物Bryologs化合物，新化合物被證 實(shí)可以相等或強(qiáng)于原物質(zhì)的效力激活潛伏HIV儲(chǔ)存庫(kù)。
[0007] 表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，受感染細(xì)胞的DNA胞嘧啶甲基化有助于維持HIV潛伏，降低 療效。體外研究數(shù)據(jù)表明，病毒5'端的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR)有CpG甲基化形成，甲基化 抑制劑5-aza_20-脫氧胞苷會(huì)導(dǎo)致原病毒的再激活。已證明這類藥物尤其是與其他藥物聯(lián) 合應(yīng)用非常有效。
[0008] HDACi類藥物也備受關(guān)注，處于臨床試驗(yàn)以及不同的實(shí)驗(yàn)室研究階段。短鏈脂肪酸 類的丙戊酸鈉（VPA)是一種較弱的HDACi，能增加體外培養(yǎng)的、潛伏感染的細(xì)胞HIV基因表 達(dá)和病毒復(fù)制。羥肟酸類的伏立諾他（Vorinostat，SAHA)是病毒儲(chǔ)存庫(kù)激活研究推進(jìn)較為 靠前的HDACi，處于臨床試驗(yàn)評(píng)估階段，能誘導(dǎo)部分慢性HIV感染者潛伏感染的T細(xì)胞系和 靜止的⑶4+T細(xì)胞復(fù)制HIV。
[0009] HBV
[0010] HBV感染是危及人類健康的最普遍的問(wèn)題之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球60億 人口中約有20億人曾感染過(guò)乙肝病毒，約有4億慢性HBV攜帶者，每年約有100萬(wàn)人死 于HBV感染相關(guān)的肝臟疾病。我國(guó)是HBV感染的高流行區(qū)，約有1. 2億乙肝表面抗原攜 帶者，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)人。目前臨床治療乙肝的兩大類抗病毒藥物核苷 (酸）類藥物和干擾素僅能阻止疾病進(jìn)展，延長(zhǎng)生存期，但任何一類都不能完全清除HBV，達(dá) 到根治乙肝的目的。HBV有特殊的反轉(zhuǎn)錄復(fù)制形式，以及特殊的復(fù)制中間體共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。cccDNA 與組蛋白和非組蛋白形成超螺 旋結(jié)構(gòu)的病毒微染色體，穩(wěn)定存在于肝、胰、腎、骨髓等的細(xì)胞核內(nèi)，成為乙型肝炎難治性的 根源，在病毒持續(xù)感染、抗病毒治療后病毒再激活等方面起關(guān)鍵作用。促進(jìn)cccDNA的清除 成為當(dāng)前抗病毒的重要目標(biāo)之一。
[0011] HCV
[0012] 丙型肝炎是由HCV引起的世界性傳染病。由于HCV的高度變異性、泛嗜性、免疫耐 受和免疫損傷等因素，導(dǎo)致HCV感染高度慢性化。目前，全世界有1. 7億人感染HCV，我國(guó)現(xiàn) 有感染者4000萬(wàn)，感染率為3. 2%，是丙型肝炎中度高發(fā)國(guó)家。
[0013] 近幾年采用抗HCV聯(lián)合療法，可使大部分患者獲得持久病毒清除，但仍有慢性丙 型肝炎患者體內(nèi)形成潛伏持續(xù)帶毒狀態(tài)。清除病毒的潛伏儲(chǔ)存庫(kù)，將為患者帶來(lái)疾病徹底 治愈的希望。
[0014] 綜上所述，清除機(jī)體病毒儲(chǔ)存庫(kù)中的病毒分子是病毒感染治療中的重點(diǎn)，而如何 有效激活病毒儲(chǔ)存庫(kù)中的病毒分子則是這種治療的一個(gè)難點(diǎn)，現(xiàn)有技術(shù)雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸如 羥肟酸類的伏立諾他一類的激活劑，但是由于其細(xì)胞毒性以及激活效率的問(wèn)題，在臨床應(yīng) 用上仍然存在著亟待解決的問(wèn)題，因此現(xiàn)有技術(shù)也需要激活效率更高，細(xì)胞毒性更小的潛 伏病毒激活劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的是提供一類針對(duì)持續(xù)性感染病毒體內(nèi)儲(chǔ)存庫(kù)的重激活藥物?；谏?述目的，本發(fā)明首先提供了苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽渲丶せ畛掷m(xù)性感染病 毒藥物中的應(yīng)用。所述苯酰胺類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中含有苯乙酰胺、苯甲酰胺等苯酰胺 類原子團(tuán)的化合物。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿┛乖?是西達(dá)本胺（Chidamide)、恩替諾特（Entinostat)、莫西司他（Mocetinostat)、 AGK-2(C23H13C12N302, CAS 號(hào)：304896-28-4)、AR-42(C18H20N203, CAS 號(hào)：935881-37-1)或 CI-994(C15H15N302, CAS 號(hào)：112522-64-2)。
[0017] 在一個(gè)更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿槲鬟_(dá)本 胺。
[0018] 在上述技術(shù)方案中，所述引起人類持續(xù)性感染的病毒可以為人類免疫缺陷性病 毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述組合物包括苯酰胺類組蛋白去乙酰化酶抑 制劑和制藥學(xué)上可接受的載體。
[0020] 在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿槲鬟_(dá)本胺、 恩替諾特、莫西司他、AGK-2、AR-42或CI-994。
[0021] 在一個(gè)更為優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述苯酰胺類組蛋白去乙酰化酶抑制劑為西達(dá)本 胺。
[0022] 優(yōu)選地，所述西達(dá)本胺的有效劑量為0· 2-50 μ mol/L。
[0023] 更為優(yōu)選地，所述西達(dá)本胺的有效劑量為0. 5-5. 0 μ mol/L。
[0024] 本發(fā)明采用HIV假病毒潛伏感染細(xì)胞模型、HIV病毒潛伏感染細(xì)胞模型和HIV感 染患者臨床標(biāo)本研究證明：苯酰胺類HDACi與羥肟酸類的組蛋白去乙?；敢种苿┓⒅Z 他相比，細(xì)胞毒性更低、激活作用更強(qiáng)。所述羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿┦侵负辛u 肟酸基團(tuán)，羧酸分子中的羧基二價(jià)氧被肟基取代的羧酸衍生物。西達(dá)本胺不僅能有效激活 假病毒潛伏感染細(xì)胞模型A7的HIV啟動(dòng)子和假病毒潛伏感染細(xì)胞模型TZM-bl的HIV啟動(dòng) 子，還能重激活潛伏感染細(xì)胞系U1/HIV-1的HIV病毒，而且西達(dá)本胺能夠有效重激活HIV 患者靜息⑶4+T細(xì)胞中潛伏的HIV。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART)的HIV患者外周血⑶4+ 靜息T細(xì)胞中檢測(cè)不到HIV RNA(拷貝數(shù)〈5〇C〇pieS/mL) ;1 μ mol/L西達(dá)本胺處理后，能夠 重激活⑶4+靜息T細(xì)胞中潛伏的HIV病毒，病毒拷貝數(shù)達(dá)到1161C〇pie S/mL ;而0. 5 μ mol/ L伏立諾他處理未能有效激活潛伏病毒活化。苯酰胺類HDACi包括：西達(dá)本胺、恩替諾特、 莫西司他、AGK-2、AR-42和CI-994。其可能的機(jī)制是通過(guò)表觀遺傳學(xué)修飾，使與HIV病毒 LTR啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的組蛋白乙酰化，形成局部松弛的空間構(gòu)像，從而使轉(zhuǎn)錄復(fù)合體和相關(guān)轉(zhuǎn) 錄啟動(dòng)因子易于進(jìn)入，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。
[0025] HIV、HBV、HCV和CMV等引起人類持續(xù)感染的病毒在初次感染或治療后能夠潛伏在 感染細(xì)胞內(nèi)，在體內(nèi)形成潛伏儲(chǔ)存庫(kù)。表觀遺傳修飾藥物HDACi通過(guò)改變蛋白的乙?；癄?態(tài)，重激活病毒表達(dá)，調(diào)整機(jī)體免疫狀態(tài)，提高抗病毒藥物的治療效果，最終達(dá)到持續(xù)性病 毒感染疾病治愈。
[0026] 因此，在上述藥物組合物中還可以含有抗病毒制劑，所述抗病毒制劑可以為核苷 (酸）類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、整合酶抑制劑、融合抑 制劑、受體拮抗劑和干擾素的一種或多種。
[0027] HIV患者進(jìn)行常規(guī)HAART治療，外周血HIV RNA拷貝數(shù)很低或檢測(cè)不到（拷貝數(shù) 〈5〇C〇pieS/ml)的前提下，基于本發(fā)明的技術(shù)效果，可以繼續(xù)進(jìn)行如下處理清除病毒儲(chǔ)存庫(kù) 中的HIV潛伏病毒：一方面可選擇地進(jìn)行HIV疫苗主動(dòng)免疫（例如吉林大學(xué)疫苗研究中心 和長(zhǎng)春百克藥業(yè)有限責(zé)任公司共同研制的由DNA疫苗及重組病毒載體疫苗組成的預(yù)防性 疫苗一
[0028] "復(fù)合型抗艾滋病毒疫苗"），激活人體特異性的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；另一 方面給予西達(dá)本胺、恩替諾特、莫西司他、AGK-2、AR-42和CI-994等苯酰胺類HDACi處理， 重激活靜息⑶4+T細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中潛伏的HIV，使?jié)摲《净罨捅磉_(dá)； 最終CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞特異性殺傷HIV病毒潛伏的細(xì)胞，釋放出的HIV病毒則通過(guò) 抗病毒藥物治療來(lái)殺滅，最終達(dá)到治愈或功能性治愈的目的。
[0029] 人類免疫缺陷性病毒感染治療藥物主要可分為六大類：1.核苷（酸）類反轉(zhuǎn)錄酶 抑制劑，如齊多夫定、拉米夫定、司他夫定、替諾福韋、阿巴卡韋、雙汰芝（拉米夫定+齊多夫 定）、三協(xié)維（阿巴卡韋+齊多夫定+拉米夫定）、恩曲他濱、阿巴卡韋+拉米夫定、替諾福 韋+恩曲他濱等；2.非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，如依非韋侖、奈韋拉平、依曲韋林等；3.蛋 白酶抑制劑，如克力芝（洛匹那韋+利托那韋）、阿扎那韋、達(dá)蘆那韋等；4.整合酶抑制劑， 如拉替拉韋等；5.融合抑制劑，如恩福韋肽等；和6.受體拮抗劑，如馬拉韋羅等。我國(guó)目前 標(biāo)準(zhǔn)的免費(fèi)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的一線治療方案均包含三種抗病毒治療藥物，即兩種核 苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和一種非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如替諾福韋+拉米夫定+依非韋 侖。
[0030] HBV和HCV的治療可以將組蛋白去乙?；敢种苿┖团R床傳統(tǒng)藥物聯(lián)合應(yīng)用，活 化并清除病毒潛伏儲(chǔ)存庫(kù)，達(dá)到持續(xù)性病毒感染疾病治愈的目的。
[0031] 乙型肝炎病毒感染治療藥物主要分兩大類，分別為核苷（酸）藥物，如拉米夫定、 阿德福韋酯、替比夫定、恩替卡韋、替諾福韋酯等；和干擾素，如普通干擾素 α、聚乙二醇干 擾素 a _2a、聚乙二醇干擾素 a _2b等?？梢酝ㄟ^(guò)核苷類似物拉米夫定和干擾素兩類藥物的 聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行治療。
[0032] 丙型肝炎病毒感染治療藥物可以為聚乙二醇干擾素 α聯(lián)合利巴韋林聯(lián)合應(yīng)用， 以及非結(jié)構(gòu)蛋白3/4Α蛋白酶抑制劑（如telaprevir和boceprevir)、非結(jié)構(gòu)蛋白5Β聚合 酶抑制劑和非結(jié)構(gòu)蛋白5A蛋白抑制劑等。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1.西達(dá)本胺對(duì)HIV潛伏感染細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；
[0034] 圖2.西達(dá)本胺重激活A(yù)7細(xì)胞的HIV LTR啟動(dòng)子；
[0035] 圖3.西達(dá)本胺重激活TZM-bl細(xì)胞的HIV LTR啟動(dòng)子；
[0036] 圖4.西達(dá)本胺重激活潛伏感染細(xì)胞系U1/HIV-1的HIV病毒；
[0037] 圖5.西達(dá)本胺重激活HIV患者靜息⑶4+T細(xì)胞中的HIV基因表達(dá)。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍構(gòu)成進(jìn)一步 的限定。
[0039] 實(shí)施例1.西達(dá)本胺對(duì)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
[0040] 本實(shí)施例采用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HDACi藥物西達(dá)本胺對(duì)病毒潛伏感染細(xì)胞A7 生長(zhǎng)的影響，確證西達(dá)本胺的細(xì)胞毒性以及用于重激活潛伏感染病毒的濃度范圍。
[0041] 1.1實(shí)驗(yàn)方法
[0042] 1. 1. 1 細(xì)胞系：
[0043] HIV假病毒潛伏感染細(xì)胞系J-Lat Tat-GFP Clone A7(以下簡(jiǎn)稱A7)由美國(guó)NIH AIDS部門(mén)NIH AIDS研究和標(biāo)準(zhǔn)試劑項(xiàng)目組Eric Verdin博士饋贈(zèng)。A7細(xì)胞是通過(guò)病毒載 體穩(wěn)定整合 LTR-Tat-IRES-GFP 的人 Jurkat T 細(xì)胞。LTR(long terminal repeats)在病毒 轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的功能；Tat基因編碼蛋白可與LTR結(jié)合，以增加病毒基因轉(zhuǎn) 錄率；GFP(Green Fluorescent Protein)則作為HIV啟動(dòng)子激活的標(biāo)志，可以采用流式細(xì) 胞儀進(jìn)行檢測(cè)。A7細(xì)胞培養(yǎng)條件是加有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。
[0044] 1. 1. 2實(shí)驗(yàn)方案：
[0045] 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A7細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔100yL含10% FBS的 RPMI1640培養(yǎng)基中含5X103個(gè)細(xì)胞。然后每孔中加入不同濃度的西達(dá)本胺，濃度分別為： 0· 1 μ mol/L、0. 5 μ mol/L、L 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L、3. 0 μ mol/L、4. 0 μ mol/L、5. 0 μ mol/L、 10. 0 μ mol/L，以0. 5 μ mol/L伏立諾他作為陽(yáng)性對(duì)照，以不加藥物處理組為陰性對(duì)照。在 37°C 5% C02分別培養(yǎng)2天和4天后，收集細(xì)胞用MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，每個(gè)處理?xiàng)l件 設(shè)3個(gè)復(fù)孔。MTT檢測(cè)方法是：每孔加入5mg/mL的MTT10 μ L，37°C繼續(xù)孵育4h，然后每孔 加入100μ L10% SDS，孵育2h后，在570nm處檢測(cè)并記錄。
[0046] 1. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0047] 根據(jù)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，西達(dá)本胺對(duì)A7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制 具有劑量和時(shí)間依賴性，結(jié)果見(jiàn)圖1。文獻(xiàn)報(bào)道濃度為〇. 5 μ mol/L的羥肟酸類組蛋白去乙 ?；敢种苿┓⒅Z他病毒激活效應(yīng)明顯，在實(shí)施例中作為陽(yáng)性對(duì)照，藥物處理2天和4天 的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別是17. 3% ±5. 8%和32. 5% ±13.0%，大大高于同濃度西達(dá)本胺的 細(xì)胞毒性（西達(dá)本胺處理2天和4天的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別是11. 3% ±2. 9%和11. 2% ±4. 6% )，稍高于3. 0 μ mol/L西達(dá)本胺的細(xì)胞毒性（西達(dá)本胺處理2天和4天的細(xì)胞生長(zhǎng) 抑制率分別是16. 0% ±2. 0%和20. 3% ±4. 4% )。據(jù)此建議西達(dá)本胺重激活潛伏病毒時(shí) 處理細(xì)胞的濃度彡3. 0 μ mol/L。
[0048] 該實(shí)施例以文獻(xiàn)報(bào)道的伏立諾他潛伏病毒重激活濃度為參照，證明同濃度的西達(dá) 本胺細(xì)胞毒性更低。
[0049] 實(shí)施例2.西達(dá)本胺激活假病毒潛伏感染細(xì)胞模型A7的HIV啟動(dòng)子
[0050] 本實(shí)施例采用HIV假病毒潛伏感染細(xì)胞模型A7來(lái)證明西達(dá)本胺等HDACi對(duì)HIV 病毒啟動(dòng)子的重激活作用，探索HDACi用于制備持續(xù)性感染病毒體內(nèi)儲(chǔ)存庫(kù)的重激活藥物 的可能性。有關(guān)A7細(xì)胞的描述見(jiàn)實(shí)施例1。
[0051] 2.1實(shí)驗(yàn)方法
[0052] 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HIV假病毒潛伏感染細(xì)胞A7接種在12孔培養(yǎng)板中，每孔在lmL 含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中加入1X106細(xì)胞。然后每孔中加入不同濃度的西達(dá)本 胺，濃度分別為：〇· 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L，以0· 5 μ mol/L伏立諾他作為陽(yáng)性 對(duì)照，以不加藥物處理組為陰性對(duì)照。在37°C 5% C02分別培養(yǎng)48h和96h后收集細(xì)胞，用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分率。
[0053] 2. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0054] 流式細(xì)胞分析顯示，西達(dá)本胺能夠明顯激活A(yù)7細(xì)胞中GFP的表達(dá)，且具有劑量和 時(shí)間依賴性，結(jié)果見(jiàn)圖2。濃度為0· 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L的西達(dá)本胺處理48h 后，A7細(xì)胞中GFP陽(yáng)性率分別是2. 0%、3. 7%和5. 3% ;空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照藥物伏立諾他 的GFP陽(yáng)性率分別是1. 5%和2. 9% ;西達(dá)本胺濃度在1. 0 μ mol/L以上時(shí)激活作用優(yōu)于伏 立諾他。濃度為0. 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L的西達(dá)本胺處理96h后，A7細(xì)胞中 GFP陽(yáng)性率分別是2. 6%、5. 1%和10. 5% ;空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照藥物伏立諾他的GFP陽(yáng)性 率基本不變，分別是1. 8%和2. 6% ;西達(dá)本胺對(duì)HIV潛伏病毒的重激活能力具有濃度依賴 性，濃度在1. 〇 μ mol/L以上時(shí)激活作用優(yōu)于伏立諾他。
[0055] 該實(shí)施例采用假病毒潛伏感染細(xì)胞模型A7證明西達(dá)本胺能夠明顯活化HIV LTR 啟動(dòng)子，重激活潛伏病毒庫(kù)，而且重激活作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物伏立諾他。
[0056] 實(shí)施例3. HDACi激活假病毒潛伏感染細(xì)胞模型TZM-bl的HIV啟動(dòng)子
[0057] 本實(shí)施例采用另一個(gè)HIV假病毒潛伏感染細(xì)胞模型TZM-bl來(lái)進(jìn)一步證明西達(dá)本 胺等HDACi對(duì)HIV病毒啟動(dòng)子的重激活作用。
[0058] 3. 1實(shí)驗(yàn)方法
[0059] 3. 1. 1 細(xì)胞系：
[0060] HIV假病毒潛伏感染細(xì)胞模型TZM-bl細(xì)胞由美國(guó)NIH AIDS部門(mén)NIH AIDS研究和 標(biāo)準(zhǔn)試劑項(xiàng)目組饋贈(zèng)，是穩(wěn)定整合HIV LTR啟動(dòng)子和熒光素酶基因（Luc)的人Hela細(xì)胞， 當(dāng)HIV啟動(dòng)子被激活時(shí)，細(xì)胞中就會(huì)有熒光素酶產(chǎn)生，可以通過(guò)熒光素酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行 分析。TZM-bl細(xì)胞的培養(yǎng)液是加有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。
[0061] 3. 1.2實(shí)驗(yàn)方案：
[0062] 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HIV假病毒潛伏感染細(xì)胞TZM-bl接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔在 100 μ L含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中加入1 X 104細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后每孔加入不同濃度的西 達(dá)本胺，濃度分別為：〇· 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L、3. 0 μ mol/L，以 0· 5 μ mol/L 伏 立諾他作為陽(yáng)性對(duì)照，以不加藥物處理組為陰性對(duì)照。繼續(xù)在37°C 5% C02培養(yǎng)48h用熒 光素酶檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒中的細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解，再將96孔板和熒光素酶底物拿到生 物發(fā)光儀中進(jìn)行測(cè)量。
[0063] 3. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0064] 熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，西達(dá)本胺能夠明顯激活TZM-bl細(xì)胞中熒光素酶的表 達(dá)，且具有劑量依賴性，結(jié)果見(jiàn)圖3。與未處理組相比，濃度為0· 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、 2· 0 μ mol/L、3. 0 μ mol/L的西達(dá)本胺作用TZM-bl細(xì)胞后，熒光素酶活性分別增高了 1· 24、 1. 44、1. 65、1. 82倍；陽(yáng)性對(duì)照藥物伏立諾處理組則增高了 1. 15倍。結(jié)果說(shuō)明西達(dá)本胺病 毒重激活作用優(yōu)于伏立諾他，與假病毒潛伏感染細(xì)胞模型Α7的結(jié)果一致。
[0065] 實(shí)施例4. HDACi重激活潛伏感染細(xì)胞系U1/HIV-1的HIV病毒
[0066] 本實(shí)施例采用病毒潛伏感染細(xì)胞模型TZM-bl來(lái)證明西達(dá)本胺等HDACi能否重激 活整合在宿主細(xì)胞基因組上的HIV前病毒。
[0067] 4. 1實(shí)驗(yàn)方法
[0068] 4. 1. 1 細(xì)胞系：
[0069] HIV潛伏感染細(xì)胞系U1/HIV-1由美國(guó)NIH AIDS部門(mén)NIH AIDS研究和標(biāo)準(zhǔn)試劑 項(xiàng)目組饋贈(zèng)，是潛伏感染HIV-1的人U937原單核細(xì)胞，當(dāng)HIV前病毒被重新激活時(shí)，將轉(zhuǎn) 錄、翻譯病毒蛋白，其中P24蛋白分泌至細(xì)胞培養(yǎng)上清中，可以通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附（ELISA) 的方法檢測(cè)到，作為潛伏病毒重激活的標(biāo)志。U1/HIV-1細(xì)胞的培養(yǎng)液是加有10% FBS的 RPMI1640培養(yǎng)基。
[0070] 4. 1. 2實(shí)驗(yàn)方案：
[0071] 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HIV潛伏感染細(xì)胞系U1/HIV-1接種在12孔培養(yǎng)板中，每孔在lmL 含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中加入1 X 106細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后每孔加入不同濃度的西達(dá) 本胺，濃度分別為：1· 0 l·1 mol/L、2. Ο μ mol/L、5. Ο μ mol/L、10. Ο μ mol/L，以 0· 5 μ mol/L 伏 立諾他作為陽(yáng)性對(duì)照，以不加藥物處理組為陰性對(duì)照。繼續(xù)在37°C 5% C02培養(yǎng)48h，取細(xì) 胞培養(yǎng)上清，用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)病毒P24的含量。
[0072] 4. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0073] 酶聯(lián)免疫吸附分析顯示，西達(dá)本胺能夠明顯激活U1/HIV-1細(xì)胞中HIV前病毒基 因組表達(dá)，且具有劑量依賴性，結(jié)果見(jiàn)圖4。濃度為L(zhǎng)0ymol/L、2.0ymol/L、5.0ymol/ L、10. 0 μ mol/L的西達(dá)本胺處理48h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中ρ24病毒蛋白的含量分別達(dá)到 150. 6pg/mL、214. 6pg/mL、233. Opg/mL和242. 7pg/mL ;空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照藥物伏立諾他 的p24病毒蛋白的含量分別是99. lpg/mL和122. 9pg/mL。結(jié)果說(shuō)明西達(dá)本胺病毒重激活作 用優(yōu)于伏立諾他。
[0074] 該實(shí)施例采用HIV潛伏感染細(xì)胞模型證明西達(dá)本胺能夠明顯重激活整合在宿主 細(xì)胞基因組上的HIV前病毒，而且重激活作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物伏立諾他。
[0075] 實(shí)施例5. HDACi對(duì)HIV感染患者潛伏病毒庫(kù)的重激活作用
[0076] 靜息⑶4+T淋巴細(xì)胞是HIV潛伏感染主要的病毒儲(chǔ)藏庫(kù)，為了驗(yàn)證西達(dá)本胺等 HDACi對(duì)HIV患者靜息T淋巴細(xì)胞中潛伏病毒的重激活作用，本實(shí)施例首先分離HIV患者外 周血單個(gè)核細(xì)胞中的靜息T淋巴細(xì)胞，然后采用PCR和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)潛伏病毒重 激活后HIV基因和蛋白的表達(dá)，相關(guān)結(jié)果通過(guò)病毒載量分析系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0077] 5. 1實(shí)驗(yàn)方法：
[0078] 5. 1. 1分離HIV患者的靜息⑶4+T淋巴細(xì)胞
[0079] HIV患者的入組條件是：接受常規(guī)HAART治療1年以上；血液中檢測(cè)不到病毒 載量（HIV-1RNA拷貝數(shù)<50copies/mL) 1年以上；外周血⑶4+T細(xì)胞數(shù)量高于300/μ L。 在臨床知情同意的情況下，取進(jìn)行常規(guī)HAART治療的HIV患者外周血，用淋巴細(xì)胞分離 液密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。接著采用德國(guó)美天旎公司的MACS磁場(chǎng)分離 ⑶4+CD25TD69_HLA-DR_靜息T淋巴細(xì)胞，基本操作是：在⑶4+T細(xì)胞陰性分選試劑中加入 ⑶25、⑶69和HLA-DR三種抗體標(biāo)記磁珠，制備成靜息⑶4+T淋巴細(xì)胞陰性分選磁珠；在MACS 緩沖液中將密度梯度離心法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞和靜息CD4+T淋巴細(xì)胞陰性分 選磁珠混合，通過(guò)MACS磁場(chǎng)陰性分選⑶25XD69-HLA-DR-的靜息⑶4+T細(xì)胞；并以⑶4-FITC、 CD25-PE、CD69-APC和HLA-DR-PerCP-Cy5抗體進(jìn)行標(biāo)記分析細(xì)胞的純化效率。
[0080] 5. 1. 2PCR檢測(cè)HIV病毒pol基因的表達(dá)：
[0081] 將上述分離獲得的⑶4+靜息T細(xì)胞接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔3mL含10U/mL IL-2和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入5X 106細(xì)胞。培養(yǎng)孔中分別加入西達(dá)本 胺1. 0 μ mol/1和2. 0 μ mol/L進(jìn)行處理，以5. 0 μ g/mL植物血凝素（PHA)或CD3單克隆抗 體處理孔作為陽(yáng)性對(duì)照，以0. 5 μ mol/L伏立諾他作為對(duì)照藥物，以未加藥物處理孔為陰性 對(duì)照。作用6天后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，提取核酸。設(shè)計(jì)并合成HIV-1病毒基因組pol區(qū)的 特異性引物，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，檢測(cè)藥物作用能否重激活CD4+靜息T細(xì)胞中潛伏病毒的 表達(dá)。
[0082] 5. 1. 3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIV病毒蛋白p24的表達(dá)：
[0083] 將上述細(xì)胞培養(yǎng)上清各取lmL，包括1. 0 μ mol/L和2. 0 μ mol/L西達(dá)本胺處理組、 5. 0 μ g/mL PHA處理組、⑶3單克隆抗體處理組、0. 5 μ mol/L伏立諾他處理組以及未加藥物 處理組。用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)病毒蛋白P24的含量，對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
[0084] 5. 1. 4病毒載量分析系統(tǒng)檢測(cè)西達(dá)本胺處理HIV潛伏感染的T細(xì)胞后病毒載量的 變化：
[0085] 收集1. 0 μ mol/L西達(dá)本胺和0· 5 μ mol/L伏立諾他處理組細(xì)胞，分離核酸，采用法 國(guó)生物梅里埃公司的NucliSENS EasyQ HIV-1病毒載量分析系統(tǒng)（病毒RNA的線性動(dòng)力學(xué) 檢測(cè)范圍是50-3000000copies/mL)對(duì)CD4+靜息T細(xì)胞藥物作用后HIV RNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢 測(cè)。以未加藥物處理孔為陰性對(duì)照。NucliSens EasyQ HIV-1核酸擴(kuò)增使用了針對(duì)野毒株 HIV-1RNA序列和人工合成內(nèi)標(biāo)物RNA序列（EasyQ HIV-lCalibrator)的特異引物，檢測(cè)是 利用祀特異的分子信標(biāo)進(jìn)行的。NucliSens EasyQ HIV-1應(yīng)用了兩種不同的分子信標(biāo)，一個(gè) 對(duì)于WT HIV-1擴(kuò)增物是特異性的，另一個(gè)對(duì)于校準(zhǔn)擴(kuò)增物是特異性的。熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)分 析揭示了 WT和校準(zhǔn)RNA的轉(zhuǎn)錄率，據(jù)此就可以推出原始樣本中HIV-1RNA的數(shù)量。這樣，利 用HIV-1分析軟件中應(yīng)用數(shù)據(jù)還元運(yùn)算法就可以定量病毒載量。
[0086] 5. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0087] 5. 2. 1MACS分離獲得HIV患者的靜息⑶4+T淋巴細(xì)胞
[0088] 采用德國(guó)美天旎公司的MACS磁場(chǎng)經(jīng)過(guò)陰性分選從進(jìn)行常規(guī)HAART治療的HIV患 者外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離得到⑶4+⑶25XD69-HLA-DR-靜息T淋巴細(xì)胞，以⑶4-FITC、 ⑶25-PE、⑶69-APC和HLA-DR-PerCP-Cy5抗體進(jìn)行標(biāo)記分析細(xì)胞的純化效率，結(jié)果顯示純 化效率>95%。由于⑶25和⑶69在分選前后含量都極低，圖5列出了其中一次分選實(shí)驗(yàn) 中⑶4-FITC和HLA-DR-PerCP-Cy5標(biāo)記的結(jié)果，A為分選前的HIV患者外周血單個(gè)核細(xì)胞， ⑶4+HLA-DIT細(xì)胞占19. 3 % ;B為分選出的⑶4+靜息T淋巴細(xì)胞，⑶4+HLA-DIT細(xì)胞占95. 4 %。
[0089] 5. 2. 2西達(dá)本胺有效重激活HIV患者靜息⑶4+T細(xì)胞中潛伏的HIV
[0090] HIV病毒pol基因的PCR檢測(cè)結(jié)果如圖5C所示，圖中的1-6分別是：1:未處理 組，2:⑶3單克隆抗體處理組，3:5. 0μ g/mL PHA處理組，4:0. 5ymol/L伏立諾他處理組， 5:1. 0 μ mol/L西達(dá)本胺處理組和6:2. 0 μ mol/L西達(dá)本胺處理組。1. 0 μ mol/L和2. 0 μ mol/ L西達(dá)本胺處理組以及PHA或⑶3單克隆抗體處理組均擴(kuò)增出HIV病毒pol基因特異性條 帶，說(shuō)明靜息⑶4+T細(xì)胞中潛伏的HIV被重新激活；而未加藥物處理組和為伏立諾他處理組 結(jié)果為陰性，說(shuō)明該組中的潛伏感染病毒未能有效激活。
[0091] 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIV病毒蛋白p24的表達(dá)，1. 0 μ mol/L和2. 0 μ mol/L 西達(dá)本胺處理組以及PHA或⑶3單克隆抗體處理組均檢測(cè)到病毒蛋白p24,分別為：1. 3pg/ mL、1. 3pg/mL、1. lpg/mL和4. 8pg/mL ;而未加藥物處理組和為伏立諾他處理組未檢測(cè)到p24 蛋白。結(jié)果與PCR結(jié)果一致。
[0092] HIV病毒載量檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)西達(dá)本胺能夠有效重激活HIV患者靜息⑶4+T細(xì)胞 中潛伏的HIV。常規(guī)HAART治療的HIV患者外周血⑶4+靜息T細(xì)胞中檢測(cè)不到HIV RNA (拷 貝數(shù)〈5〇C〇pieS/mL) ; 1 μ mol/L西達(dá)本胺處理后，能夠重激活⑶4+靜息T細(xì)胞中潛伏的HIV 病毒，病毒拷貝數(shù)達(dá)到1161copies/mL ;而0. 5 μ mol/L伏立諾他處理未能有效激活潛伏病 毒活化。
[0093] 本實(shí)施例成功分離了 HIV患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的靜息T淋巴細(xì)胞，證明西達(dá) 本胺等HDACi能夠有效激活靜息T淋巴細(xì)胞中的HIV潛伏病毒；即使對(duì)照藥物伏立諾他不 能起作用的病例，西達(dá)本胺等苯酰胺類HDACi依然有較好地療效。
【權(quán)利要求】
1. 苯酰胺類組蛋白去乙酰化酶抑制劑在制備重激活持續(xù)性感染病毒藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿?為西達(dá)本胺、恩替諾特、莫西司他、AGK-2、AR-42或CI-994。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿?為西達(dá)本胺。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述引起人類持續(xù)性感染的病毒 可以為人類免疫缺陷性病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
5. -種藥物組合物，所述組合物包括苯酰胺類組蛋白去乙酰化酶抑制劑和制藥學(xué)上可 接受的載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种?劑為西達(dá)本胺、恩替諾特、莫西司他、AGK-2、AR-42或CI-994。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述苯酰胺類組蛋白去乙?；敢种?劑為西達(dá)本胺。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述西達(dá)本胺的有效劑量為 0.2-50 μ mol/L〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述西達(dá)本胺的有效劑量為 0· 5_5· 0 μ mol/L〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有 抗病毒制劑，所述抗病毒制劑可以為核苷（酸）類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制 齊U、蛋白酶抑制劑、整合酶抑制劑、融合抑制劑、受體拮抗劑和干擾素的一種或多種。
【文檔編號(hào)】A61K31/4406GK104083763SQ201410340048
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】于群, 任素萍, 鄶啟源, 喬志新, 王艷冰, 王璇琳, 賀敏, 李偉靜, 王鈺 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所