本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有超長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的超聲造影劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

超聲造影劑通常是脂質(zhì)、聚合物或蛋白質(zhì)包裹的直徑在10微米以下的氣體微泡，能夠在超聲成像中用來(lái)增強(qiáng)檢測(cè)部位的回聲信號(hào)。超聲造影劑在人體微小血管和組織血流灌注檢測(cè)與成像方面具有很大優(yōu)勢(shì)。另外，近些年的研究表明超聲造影劑在腫瘤或炎癥部位的靶向成像和藥物遞送等方面表現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，因此可以預(yù)見(jiàn)超聲造影劑在不久的將來(lái)將會(huì)成為臨床上超聲診斷或治療中的不可或缺的試劑。

目前超聲造影劑已經(jīng)有很多產(chǎn)品進(jìn)入臨床應(yīng)用，國(guó)際市場(chǎng)上如definity、optison、sonazoid、sonovue等，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上現(xiàn)在有sonovue、雪瑞欣可以使用。盡管超聲造影劑在超聲診斷中有著諸多應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，但是目前國(guó)內(nèi)臨床診斷中超聲造影劑卻很少被普通民眾所使用，一般只有在三甲以上的醫(yī)院才會(huì)有較多的使用。這其中一個(gè)很重要的原因就是造影劑的價(jià)格非常昂貴，如每瓶sonovue的價(jià)格在700人民幣左右，雪瑞欣的價(jià)格更是高達(dá)每瓶900多人民幣，普通老百姓難以負(fù)擔(dān)得起，極大地限制了超聲造影劑的普及。另外目前已有的超聲造影劑的成像時(shí)間都比較短(sonovue的有效時(shí)間為4-8分鐘，雪瑞欣不足2分鐘)，難以滿足一個(gè)完整的超聲檢查的需求。尤其是隨著介入超聲等技術(shù)的發(fā)展，對(duì)具有長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的造影劑的需求就更加迫切。

另外，隨著超聲分子影像和介入治療的發(fā)展，亞微米的微泡(即含有一定比例的納米泡的超聲微泡)開(kāi)始顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。納米泡在高頻超聲下穩(wěn)定性更好，具有更好的穿透血管的能力，而微米級(jí)微泡的超聲造影增強(qiáng)效果更好，亞微米的微泡結(jié)合了兩者的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)出更好的應(yīng)用價(jià)值。例如研究發(fā)現(xiàn)definity由于含有一定比例的納米泡具有更好的超聲溶栓效果，而同等條件下的 白蛋白微泡由于均是微米級(jí)尺寸則沒(méi)有這種效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于以上需求和問(wèn)題，本發(fā)明提供一種具有超長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的超聲造影劑的制備方法，該方法操作簡(jiǎn)單，微泡包膜材料可以在很溫和的條件下分散得到均一穩(wěn)定的溶液，可以進(jìn)行過(guò)濾除菌，容易進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明所述超聲造影劑為凍干制劑，為了制備凍干制劑，需要先制備超聲微泡包膜材料的混懸液，混懸液中的成分是雙親性包膜材料、凍干保護(hù)劑和溶劑。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種具有超長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的超聲造影劑的制備方法，包括以下步驟：

1)制備微泡包膜材料混懸液，其中所述混懸液的溶劑為叔丁醇和水混合液；

2)冷凍干燥所述混懸液，制得微泡凍干粉；

3)將所述微泡凍干粉充入填充氣體，所述填充氣體為混合氣體。

本發(fā)明所述包膜材料為雙親性包膜材料，其主要組分是帶有負(fù)電荷的磷脂，疏水鏈的長(zhǎng)度以18個(gè)碳為宜，適合的磷脂包括二硬脂?；?磷脂酰甘油、二硬脂?；?磷脂酰絲氨酸、二硬脂?；?磷脂酸等中的一種。研究發(fā)現(xiàn)，由于這些磷脂在生理?xiàng)l件下凈電荷為負(fù)，保證了微泡帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷，從而使得穩(wěn)定性大大提高。且較長(zhǎng)的疏水鏈能夠保證能夠形成穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)以防止微泡內(nèi)部氣體的溢出。另外這些磷脂的親水性頭部中的磷酸、甘油、絲氨酸等結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)氫鍵或靜電相互作用形成穩(wěn)定的親水層，大大提高微泡的穩(wěn)定性。

本發(fā)明所述雙親性包膜材料中除了前面提到的帶有負(fù)電荷的磷脂外，也可以摻入一些其他的雙親性成膜材料，但是為了保證微泡的穩(wěn)定性，前面提到的帶有負(fù)電荷的磷脂(即二硬脂?；?磷脂酰甘油、二硬脂?；?磷脂酰絲氨酸以及二硬脂?；?磷脂酸)的重量比例應(yīng)該在70％以上，優(yōu)選90％以上，更優(yōu)選為100％。其他雙親性材料包括各種天然、半合成的的磷脂化合物，如卵磷脂、卵磷脂酰甘油、氫化大豆磷脂、氫化蛋黃磷脂、氫化磷脂酰絲氨酸，氫化磷脂酰甘油等。也包括各種合成磷脂如帶有各種脂肪酸鏈的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸等。也包括改性的磷脂，例如聚乙二醇化的磷脂。也包括各種合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)，如羥乙基乙二胺基化的磷脂、乙 基磷脂酰膽堿的衍生物(如1,2-二硬脂酸-sn-甘油基-3-乙基膽堿磷酸)、帶有烷基鏈的銨鹽(如硬脂酰氯化銨、十二烷基溴化胺等)等。也包括各種表面活性劑，如司盤(pán)類、吐溫類、聚乙二醇化的脂肪酸、單硬脂酸甘油酯、蔗糖單硬脂酸酯、氫化蓖麻油、棕櫚酸抗壞血酸脂等。也包括類固醇類化合物(如膽固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆固醇、麥角固醇)及其衍生物、維生素e及其衍生物、脂肪酸(如硬脂酸、棕櫚酸、花生酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸等)。

研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述雙親性包膜材料以單一一種磷脂為最佳，即選擇二硬脂?；?磷脂酰甘油、二硬脂?；?磷脂酰絲氨酸以及二硬脂?；?磷脂酸中的一種作為微泡包膜材料。一方面單一一種磷脂避免了由于多種磷脂混合不均導(dǎo)致的微泡均一性和可重復(fù)性差的問(wèn)題。另一方面，采用單一一種磷脂有利于磷脂形成均一的微泡包膜結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性大大提高。

本發(fā)明制備微泡包膜材料混懸液的過(guò)程中還需加入凍干保護(hù)劑。

本發(fā)明優(yōu)選采用的凍干保護(hù)劑是聚乙二醇，平均分子量應(yīng)該在1000-10000之間為宜，優(yōu)選的是平均分子量為4000左右的聚乙二醇。聚乙二醇的主要作用是在混懸液冷凍干燥時(shí)能夠?qū)χ纹鸪赡げ牧?，使其保持在溶液中的穩(wěn)定分散狀態(tài)而不至于塌陷聚集，使得凍干粉在水化時(shí)能夠很容易分散得到均一穩(wěn)定的溶液。另外，聚乙二醇在水中能夠與微泡膜表面的磷脂通過(guò)氫鍵作用大量附著，聚合物的附著可以極大地提高微泡的穩(wěn)定性，也能夠降低微泡在體內(nèi)被識(shí)別的幾率從而延長(zhǎng)微泡的循環(huán)時(shí)間。

為了獲得均一穩(wěn)定的微泡包膜材料混懸液，需要一種溶劑能夠?qū)⑽⑴莅げ牧?和凍干保護(hù)劑)均勻混合分散。另外，為了獲得微泡凍干粉，這種溶劑還需要具有合適的熔點(diǎn)和飽和蒸汽壓。

水是冷凍干燥工藝中最常用的溶劑，但是雙親性材料在水中很容易自組裝成膠束或脂質(zhì)體等結(jié)構(gòu)，直接將多種雙親性材料分散在水中很難實(shí)現(xiàn)分子水平上的均勻混合。

目前能夠用于冷凍干燥的最優(yōu)選的非水溶劑是叔丁醇，由于其具有較高的熔點(diǎn)(25.7℃)和飽和蒸汽壓(26.8mmhg，20℃)，用普通的冷凍干燥設(shè)備實(shí)現(xiàn)冷凍干燥，極大的節(jié)約成本。另外，較低的毒性也使得叔丁醇較適合用于 藥物制劑的冷凍干燥。盡管純的叔丁醇可以溶解大多數(shù)雙親性材料和不同分子量的聚乙二醇，但是卻無(wú)法溶解大多數(shù)的凍干保護(hù)劑。另外，微泡制備時(shí)通常需要加入一定比例的帶有負(fù)電荷的磷脂如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油或磷脂酸等，而這類磷脂在叔丁醇中的溶解度較差。

本發(fā)明中用來(lái)制備微泡包膜材料混懸液的溶劑是叔丁醇和水的混合液。優(yōu)選地，所述叔丁醇和水混合液中叔丁醇的質(zhì)量含量為1％～99％，進(jìn)一步優(yōu)選為30％～70％。

本發(fā)明中所采用的成膜材料主要是帶有負(fù)電荷的磷脂，這類磷脂在水中難以分散，在氯仿、甲醇、正己烷、叔丁醇、乙醇等大多數(shù)有機(jī)溶劑中的溶解性都不好。而且除了要保證磷脂能夠充分分散，還要保證混懸液能夠在一般的冷凍干燥設(shè)備中被凍干。我們經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有叔丁醇和水的混合液能夠滿足需求，帶負(fù)電荷的磷脂在這種溶劑中能夠被很容易地溶解，混懸液中的溶劑能夠很容易地通過(guò)冷凍干燥除去，而且這種溶劑的生物毒性很低，痕量殘留的溶劑毒性可以被忽略。

另外，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，以叔丁醇和水混合液為溶劑能夠同時(shí)溶解絕大多數(shù)雙親性包膜材料和凍干保護(hù)劑，而且溶解過(guò)程不需要太高的溫度，40℃左右甚至更低的溫度就可以溶解，且溶解后冷卻到室溫后不會(huì)析出。最后獲得的所述混懸液澄清、均一、穩(wěn)定，并且很容易利用過(guò)濾進(jìn)行除菌。另外，使用叔丁醇和水混合液為溶劑進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，叔丁醇能夠在水中形成針狀結(jié)晶，大大縮短冷凍干燥的周期。

本發(fā)明所述微泡包膜材料混懸液制備好后通常還需要進(jìn)行過(guò)濾，比較優(yōu)選的是用220nm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。使用叔丁醇和水作為溶劑能夠很容易將包膜材料溶解得到澄清透明的溶液，很容易進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾的目的一方面能夠除去可能存在的微量雜質(zhì)，另一方面能夠起到對(duì)混懸液過(guò)濾除菌的目的。

本發(fā)明中微泡包膜材料混懸液制備好后(例如分裝入藥物制劑用的西林瓶)，通過(guò)冷凍干燥的方法除去溶劑(即叔丁醇和水混合液)得到微泡凍干粉，凍干粉能夠穩(wěn)定存在，常溫條件下即可以保存很長(zhǎng)時(shí)間。所述冷凍干燥可采用本領(lǐng)域常用方法。

本發(fā)明方法還包括將制備好的微泡凍干粉進(jìn)行充入填充氣體的步驟。例如冷凍干燥結(jié)束后向西林瓶中充入填充氣體。填充氣體是超聲微泡內(nèi)核的成分，為了提高超聲微泡的穩(wěn)定性，填充氣體應(yīng)該在水中具有較低的溶解度，還要對(duì)生物體安全無(wú)毒。常用的超聲造影劑的填充氣體是氟化碳類氣體，但是我們的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用氟化碳類氣體如八氟丙烷作為填充氣體時(shí)，最后制備的超聲微泡的尺寸較大，較多的微泡尺寸在10微米以上，由于人體中肺部最細(xì)的血管的內(nèi)徑在10微米左右，這種微泡難以被安全用到生物體中。另一方面，在水中溶解度較高的氣體，如空氣、氮?dú)獾葰怏w用作填充氣體所制備的微泡盡管尺寸較小但是穩(wěn)定性極差。

本發(fā)明中所使用的填充氣體是混合氣體，其含有兩類氣體：氣體a和氣體b。氣體a的特點(diǎn)是分子量比較小(<100)，可以利用的氣體包括空氣、氧氣、氮?dú)?、二氧化碳、氦氣、氖氣、氬氣中的一種或幾種的混合氣。氣體b的特點(diǎn)是分子量較大(>100)，并且含有氟元素，可以利用的氣體包括八氟丙烷、十氟丁烷、八氟環(huán)丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟辛烷等氟化碳類氣體以及六氟化硫等氟化硫類氣體中的一種或幾種的混合氣。

本發(fā)明中填充氣體(即混合氣體)中氣體a的體積比例為1％～99％，優(yōu)選的比例為95％～99％。混合氣體的使用，一方面能夠保證微泡具有很好的穩(wěn)定性，另一方面能夠顯著降低微泡的尺寸使得絕大多數(shù)的微泡尺寸都在7微米以下，并且有很多納米泡。

本發(fā)明中氣體填充過(guò)程可以是在凍干機(jī)外用特定的充氣裝置進(jìn)行。工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)更優(yōu)選的方法是氣體填充、密封的過(guò)程都是在凍干設(shè)備中進(jìn)行。本發(fā)明中混懸液分裝入西林瓶中后，在經(jīng)過(guò)凍干、氣體填充、密封、無(wú)菌處理后即可得到最終的超聲造影劑(微泡凍干粉)成品。

本發(fā)明上述制備方法中，

步驟1)包括將所述包膜材料和凍干保護(hù)劑加入叔丁醇和水混合液中，加熱溶解，制得微泡包膜材料混懸液；然后過(guò)濾除菌；

所述包膜材料和凍干保護(hù)劑的重量比例為1：200～1:5；優(yōu)選為1:50～1:10。

所述包膜材料和凍干保護(hù)劑的總重量占所述溶劑(即叔丁醇和水混合液) 重量的1％～50％；優(yōu)選為5％～20％；

所述叔丁醇和水混合液中叔丁醇的質(zhì)量含量為1％～99％，優(yōu)選為30％～70％。

所述加熱溶解溫度為25℃～70℃；優(yōu)選為35℃～50℃。

所述過(guò)濾除菌優(yōu)選采用220nm的濾膜。

具體地，本發(fā)明所述具有超長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的超聲造影劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將所述包膜材料和凍干保護(hù)劑加入叔丁醇和水混合液中，加熱溶解，制得微泡包膜材料混懸液；然后采用220nm的濾膜過(guò)濾除菌；

2)將步驟1)過(guò)濾除菌的微泡包膜材料混懸液冷凍干燥，得到微泡凍干粉；

3)將步驟2)制備好的微泡凍干粉充入混合填充氣體；

上述制備方法中，

所述包膜材料為二硬脂?；?磷脂酰甘油、二硬脂?；?磷脂酰絲氨酸或二硬脂?；?磷脂酸；

所述凍干保護(hù)劑為平均分子量4000的聚乙二醇；

所述包膜材料和凍干保護(hù)劑的重量比例為1:50～1:10；

所述包膜材料和凍干保護(hù)劑的總重量占所述溶劑重量的5％～20％；

所述加熱溶解溫度為35℃～50℃；

所述混合氣體含有兩類氣體：氣體a和氣體b；其中氣體a的分子量<100；氣體b的分子量>100，并且含有氟元素；

所述氣體a包括空氣、氧氣、氮?dú)?、二氧化碳、氦氣、氖氣、氬氣中的一種或幾種的混合氣；

所述氣體b包括氟化碳類氣體、氟化硫類氣體中的一種或幾種的混合氣；其中，氟化碳類氣體包括八氟丙烷、十氟丁烷、八氟環(huán)丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟辛烷；氟化硫類氣體包括六氟化硫。

本發(fā)明還包括上述方法制得的超聲造影劑。

本發(fā)明所述超聲造影劑(微泡凍干粉)在使用時(shí)需要向所述超聲造影劑中注入水化液，經(jīng)震蕩制得超聲造影劑懸浮液。

具體地，本發(fā)明所述超聲造影劑(微泡凍干粉)在使用時(shí)需要向包裝容器 (如西林瓶)中注入水化液，水化液的量?jī)?yōu)選占包裝容器(如西林瓶)容積的10％～80％。水化液的選擇應(yīng)該是完全無(wú)毒、可以進(jìn)行靜脈注射的。純水和大多數(shù)臨床上使用的注射液都可以被用做水化液，如生理鹽水，磷酸鹽緩沖液，甘油注射液，葡萄糖注射液，氨基酸注射液等。也可以是加入了一定量的甘油和/或丙二醇的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液，甘油的加入能夠提高微泡的粘彈性和穩(wěn)定性，丙二醇可以促進(jìn)雙親性包膜材料的分散。

本發(fā)明所述超聲造影劑(微泡凍干粉)水化后優(yōu)選通過(guò)機(jī)械振蕩器來(lái)激活微泡以獲取可以用于超聲成像造影的微泡混懸液。這里所采用機(jī)械振蕩器與目前臨床上牙科所用的銀汞調(diào)和器的結(jié)構(gòu)原理基本一致。優(yōu)選地，震蕩方式是往復(fù)式，震蕩頻率為2000～7000rpm，震蕩幅度為0.5～3cm，震蕩時(shí)間為30～180s。

本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，微泡各組分之間能夠在很溫和的條件下分散得到均一穩(wěn)定的溶液，達(dá)到分子水平的均勻混合，各組分在制備過(guò)程中不易發(fā)生降解，樣品凍干效率高，樣品均一穩(wěn)定，可以進(jìn)行過(guò)濾除菌，可重復(fù)性高、容易規(guī)模化生產(chǎn)，表現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)方法中因磷脂在高溫條件下或水溶液中長(zhǎng)期存在時(shí)容易發(fā)生降解產(chǎn)生溶血性磷脂，影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明中優(yōu)選的方法采用單一一種帶負(fù)電的磷脂作為成膜材料，提高了產(chǎn)品的均一性和可重復(fù)性。產(chǎn)品高效安全、方法可重復(fù)性高。

本發(fā)明中造影劑體內(nèi)(例如肝臟、腎臟和脾臟等臟器)造影持續(xù)時(shí)間達(dá)到了2-6小時(shí)以上，是目前已報(bào)道的微氣泡類超聲造影劑中超聲造影持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)的一類造影劑。打破了傳統(tǒng)的對(duì)氣體微泡超聲造影劑穩(wěn)定性差的認(rèn)知。這種造影劑除了含有較多的微米級(jí)氣泡之外，還含有很多納米級(jí)的氣泡。另外，這種造影劑的成分簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，主要原料均為fda已經(jīng)批準(zhǔn)的可注射藥用輔料，制備工藝簡(jiǎn)單、可重復(fù)性高、易于進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，預(yù)計(jì)工業(yè)化生產(chǎn)后每瓶生產(chǎn)成本僅為2人民幣左右。良好的超聲造影效果、低廉的價(jià)格使得這種超聲造影劑具有良好的應(yīng)用價(jià)值，預(yù)計(jì)將有助于超聲造影劑的普及應(yīng)用，具有很廣闊的臨床應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1和對(duì)比例1制得的微泡包膜材料混懸液照片。

圖2為實(shí)施例1制得的微泡懸液的微泡顯微鏡照片。

圖3為對(duì)比例2得的微泡懸液的微泡顯微鏡照片。

圖4為實(shí)施例1制得的微泡懸液的微泡的粒徑分布圖。

圖5為實(shí)施例1制得的超聲造影劑(微泡混懸液)對(duì)新西蘭大白兔的腎臟和肝臟實(shí)質(zhì)在不同時(shí)間點(diǎn)的造影效果圖。a，微泡注射前；b，微泡注射后30秒；c微泡注射后30分鐘；d，微泡注射后1小時(shí)；e，微泡注射后3小時(shí)；f，微泡注射后5小時(shí)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過(guò)正規(guī)渠道商購(gòu)買(mǎi)得到的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

準(zhǔn)確稱取128mg二硬脂?；?磷脂酰甘油，1872mgpeg4000，加入溶劑(即9g去離子水和9g叔丁醇的混合液)，加熱到45℃溶解得到微泡包膜材料混懸液，為澄清的溶液(見(jiàn)圖1)，然后冷卻到室溫。將溶解后的溶液用220nm的濾膜過(guò)濾后分裝入2ml的西林瓶(實(shí)際容積約為3.5ml)，每瓶分裝入250mg。將分裝好的西林瓶放于凍干機(jī)隔板上，迅速冷卻到-40℃，冷凍干燥過(guò)夜。冷凍干燥結(jié)束后，保持凍干機(jī)的真空狀態(tài)，充填入氮?dú)怏w積比例為98％的氮?dú)夂桶朔榛旌蠚怏w，待真空度恢復(fù)到常壓后，壓下西林瓶上的橡膠塞，密封西林瓶，制得超聲造影劑。

該超聲造影劑(凍干粉制劑)使用之前，向西林瓶中注入1ml的生理鹽水，放于醫(yī)用銀汞調(diào)和機(jī)的夾頭上，振蕩頻率為4000rpm，振蕩45s后得到微泡懸浮液。

實(shí)施例2

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于將二硬脂?；?磷脂酰甘油成分更換為：128mg二硬脂?；?磷脂酰絲氨酸。

實(shí)施例3

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于將二硬脂酰基-磷脂酰甘油成分更換為：128mg二硬脂?；?磷脂酸。

實(shí)施例4

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于溶劑為12.6g去離子水和5.4g叔丁醇的混合液。

實(shí)施例5

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于溶劑為5.4g去離子水和12.6g叔丁醇的混合液。

實(shí)施例6

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為氮?dú)怏w積含量為95％的全氟丙烷和氮?dú)獾幕旌蠚怏w。

實(shí)施例7

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為空氣體積含量為98％的全氟丙烷和空氣的混合氣體。

實(shí)施例8

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為空氣體積含量為98％的全氟丁烷和空氣的混合氣體。

實(shí)施例9

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為氮?dú)怏w積含量為98％的全氟丁烷和氮?dú)獾幕旌蠚怏w。

實(shí)施例10

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于充填的混合氣體為氧氣體積含量為98％的全氟丙烷和氧氣的混合氣體。

對(duì)比例1

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于以水為溶劑制備微泡包膜材料混懸液。

制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在制備微泡包膜材料混懸液的時(shí)候，實(shí)施例1中只需在45℃加熱溶解5分鐘左右就可以得到澄清透明的混懸液，而對(duì)比例1中在45℃ 加熱溶解30分鐘后仍然可以看到很多顆粒狀不溶物，而且混懸液渾濁不透明(圖1)。在使用傳統(tǒng)的220nmpvdf膜針頭濾器(直徑25mm)對(duì)混懸液進(jìn)行過(guò)濾時(shí)，實(shí)施例1中混懸液在過(guò)濾100ml后沒(méi)有遇到明顯的阻力，而對(duì)比例1中的混懸液過(guò)濾時(shí)過(guò)濾的阻力非常明顯，僅過(guò)濾了2ml后濾器就基本完全被堵塞無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行了。

對(duì)比例2

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例2的區(qū)別僅在于充填的氣體為全氟丙烷單一氣體。

對(duì)比例3

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例2的區(qū)別僅在于充填的氣體為空氣單一氣體。

對(duì)比例4

一種超聲造影劑，其制備方法與實(shí)施例2的區(qū)別僅在于充填的氣體為氮?dú)鈫我粴怏w。

實(shí)驗(yàn)例1

為獲取微泡在光學(xué)顯微鏡下的圖像；具體操作步驟如下：用等體積的生理鹽水分別稀釋實(shí)施例1和對(duì)比例2～4中制得的微泡懸液，用移液器吸取10μl微泡懸液滴在干凈的載玻片上，小心蓋上蓋玻片，使用顯微鏡在不同物鏡倍數(shù)下觀察微泡的大小、形態(tài)及分散情況并拍照。圖2是實(shí)施例1中得到的微泡的顯微照片，可以看到微泡的尺寸大都在2μm以下，并且能夠明顯看到很多納米泡。圖3是對(duì)比例2中得到的微泡的顯微照片，可以看到很多尺寸都位于10μm以上，較多的大尺寸微泡在體內(nèi)使用的時(shí)候容易堵塞血管，安全性沒(méi)有保證，無(wú)法被用于體內(nèi)超聲實(shí)驗(yàn)。而對(duì)比例3和對(duì)比例4中的微泡在顯微鏡可以看到微泡大多都是2μm以下，尺寸很小，但是這種微泡非常不穩(wěn)定，常溫放置約30分鐘后就完全消失了。

實(shí)驗(yàn)例2

采用采用庫(kù)爾特顆粒計(jì)數(shù)儀測(cè)試新型微泡的尺寸分布及濃度。操作步驟如下：取實(shí)施例1新制備的微泡懸液20μl加入到20ml生理鹽水中中，輕微搖 晃混合均勻。設(shè)定分析體積為20μl，測(cè)試微泡的粒徑分布及濃度。樣品測(cè)試重復(fù)三次，取平均值。圖4是其中一次代表性的結(jié)果，可以看到微泡的尺寸分布范圍很窄，大部分都在2μm以下，與顯微鏡照片吻合。

實(shí)驗(yàn)例3

以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，于兔左耳經(jīng)耳緣靜脈建立外周靜脈通道，在導(dǎo)管的末端連接三通管，其中一個(gè)通道用于注射超聲造影劑，一個(gè)通道尾隨生理鹽水。新西蘭大白兔用3％的戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉(30mg/kg)，并輔以0.2％肝素鈉抗凝血。待兔完全麻醉后，以背臥的姿勢(shì)固定在兔床上。右腹部毛發(fā)用脫毛膏小心脫除，對(duì)兔肝臟和腎臟進(jìn)行未注射造影劑的超聲檢查，記錄基礎(chǔ)狀態(tài)下的圖像。待圖像滿意后分別將實(shí)施例1以及對(duì)比例3和對(duì)比例4中的超聲造影劑微泡混懸液按20μl/kg的劑量經(jīng)兔耳緣靜脈團(tuán)注，即刻尾隨2.0ml生理鹽水沖洗管道，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察并記錄兔肝臟和腎臟回聲強(qiáng)度增強(qiáng)情況以及腎臟能量多普勒血流信號(hào)增強(qiáng)情況。

圖5是實(shí)施例1中的微泡在兔肝臟和腎臟的造影結(jié)果，可以看到造影信號(hào)在肝臟和腎臟有顯著的造影增強(qiáng)效果，并且能夠持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，注射后5小時(shí)仍能看到較強(qiáng)的信號(hào)。在注射后7小時(shí)，盡管腎臟的信號(hào)已經(jīng)基本完全消失，但在在肝臟部位仍然能夠看到顯著的增強(qiáng)信號(hào)。

而對(duì)比例3和對(duì)比例4中的造影劑在注射入動(dòng)物體內(nèi)后基本看不到造影增強(qiáng)的信號(hào)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。