本發(fā)明涉及緩釋制劑領(lǐng)域，特別涉及生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

食管癌是起源于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)食管癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第8位，死亡率為第6位。我國是食管癌最高發(fā)的國家之一，國內(nèi)每年食管癌新發(fā)病例超過22萬例，死亡約20萬例，通常食管癌患者確診時已進(jìn)展至中晚期，總體5年生存率不足20％，而早期食管癌通常經(jīng)內(nèi)鏡下微創(chuàng)治療即可根治，5年生存率可超過95％。目前，內(nèi)鏡下粘膜切除術(shù)(Endoscopic mucosal resection EMR)和內(nèi)鏡下粘膜剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection ESD)是早期食管癌的主要治療方式。但是，EMR和ESD通常會破壞患者食管粘膜層，導(dǎo)致食管狹窄。研究表明，大于四分之三周的食管粘膜剝離，術(shù)后食管狹窄的發(fā)生率即高達(dá)88-100％，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響。

通過機(jī)械方法擴(kuò)張狹窄部位，能夠在較短時間內(nèi)為患者解除痛苦。但是，食管狹窄容易復(fù)發(fā)，需進(jìn)行多次介入治療，這無疑會增加消化道內(nèi)壁的損傷和并發(fā)癥的發(fā)生，導(dǎo)致瘢痕形成，形成食管狹窄。食管狹窄是由于固有肌層的破壞和纖維化導(dǎo)致的，黏膜層炎癥反應(yīng)的缺失將會避免固有肌層的損害及過度纖維化從而預(yù)防食管狹窄。類固醇激素能減少脯氨酰羥化酶的活化，促進(jìn)膠原酶的激活來減輕炎癥反應(yīng)從而減少組織膠原的含量。基于這一理念，發(fā)現(xiàn)ESD術(shù)后內(nèi)鏡下曲安奈德的注射可以有效預(yù)防食管狹窄的發(fā)生。但是，局部類固醇藥物的注射往往需要在介入設(shè)備的輔助下多次用藥，這無疑會增加患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不同手術(shù)的創(chuàng)面范圍、注射方式和注射劑量，也會帶來不一樣的療效，同時，多次注射會有穿刺出血的風(fēng)險。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑及制備方法和應(yīng)用，通過內(nèi)鏡直接噴涂緩釋劑在消化道相應(yīng)手術(shù)區(qū)域處，能發(fā)揮持久抗炎作用，減少術(shù)后瘢痕形成，預(yù)防術(shù)后食管狹窄，有效改善患者生活質(zhì)量。

本發(fā)明提供的一種技術(shù)方案是：一種生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑，緩釋劑包含生物蛋白膠、抑肽酶、曲安奈德，其中，生物蛋白膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8％～4.0％，抑肽酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08％～0.10％，曲安奈德的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.09％～0.33％。

上述緩釋劑的制備方法，具有以下步驟，

1)取抑肽酶，溶解配置成質(zhì)量濃度為10％的抑肽酶溶液；

2)取曲安奈德，溶解配置成濃度為10mg/ml的曲安奈德溶液；

3)分別配置生物蛋白主體膠溶液、催化劑溶液，其中，生物蛋白主體膠溶液濃度為50～90mg/ml，催化劑溶液濃度為500IU/ml；

4)取1體積步驟3)配置的生物蛋白主體膠溶液、0.01體積步驟1)配置的抑肽酶溶液、0.125～0.375體積步驟2)配置的曲安奈德溶液，混勻；

5)取1體積步驟3)配置的催化劑溶液、0.01體積步驟1)配置的抑肽酶溶液、0.125～0.375體積步驟2)配置的曲安奈德溶液，混勻；

6)將步驟4)、步驟5)的混合液混合，凝結(jié)，得到生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑。

上述步驟1)用生理鹽水溶解抑肽酶，步驟2)用滅菌注射用水溶液曲安奈德。

上述緩釋劑在制備模擬生物體內(nèi)緩釋曲安奈德制劑的用途。

本發(fā)明提供的另一種技術(shù)方案是：一種生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑，緩釋劑包括生物蛋白膠、曲安奈德，其中，生物蛋白膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5％～4.5％，曲安奈德的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.13％～0.38％。

上述緩釋劑的制備方法，有以下步驟：

1)取曲安奈德，溶解配置成濃度為10mg/ml的曲安奈德溶液；

2)用步驟1)配置的曲安奈德溶液作溶劑，配置濃度為50～90mg/ml的生物蛋白主體膠溶液；

3)配置濃度為500IU/ml的催化劑溶液；

4)將步驟2)所得生物蛋白主體膠溶液與步驟3)所得催化劑溶液等體積混合，凝結(jié)，得到生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑。

上述步驟1)用滅菌注射用水溶解曲安奈德。

上述緩釋劑在制備用于防治消化道內(nèi)鏡治療術(shù)后狹窄的制劑中的用途。

本發(fā)明具有以下有益效果：

生物蛋白膠提取自生物組織內(nèi)，由纖維蛋白原、凝血因子及凝血酶等多種可凝性蛋白組成，其本身具有止血、封閉創(chuàng)面、黏合裂口、促進(jìn)愈合的作用。生物蛋白膠植入體內(nèi)后，根據(jù)局部纖溶活性及生物蛋白膠體積，可在8～18d內(nèi)被組織降解吸收，毒副作用較小，不存在異物殘留問題，避免了某些生物材料植入后需二次手術(shù)取出的問題。

曲安奈德屬于類固醇激素，被應(yīng)用于預(yù)防食管ESD術(shù)后狹窄。

將曲安奈德與生物蛋白主體膠混勻后，再與催化劑混合，模擬發(fā)生生物體凝血反應(yīng)，形成凝膠狀的纖維蛋白多聚體，曲安奈德均勻分布在該纖維蛋白多聚體內(nèi)。纖維蛋白多聚體具有穩(wěn)定及特定的海綿狀三維結(jié)構(gòu)，表面積較大，可延長自身溶解時間與曲安奈德釋放時間，在三維結(jié)構(gòu)內(nèi)構(gòu)建成多個小室間，形成類似半透膜的結(jié)構(gòu)，曲安奈德均勻分布在纖維蛋白多聚體的各小室間內(nèi)，可順濃度梯度方向自半透膜不斷從小室間向外滲透，實現(xiàn)緩釋曲安奈德的目的，持續(xù)對患者手術(shù)區(qū)域處給藥，有效避免了傳統(tǒng)治療手段通過介入設(shè)備輔助多次用藥的缺陷。此外，生物蛋白膠還具有抗壓性、形狀可塑性等優(yōu)點，結(jié)合消化道的管道特點，非常適合用于對消化道用藥。

當(dāng)在生理鹽水中模擬生物體內(nèi)緩釋曲安奈德時，制備緩釋劑過程中加入的抑肽酶用于減緩蛋白膠凝結(jié)速度，使曲安奈德均勻分布在生物蛋白膠內(nèi)，能有效保證曲安奈德緩釋的平順性。

本發(fā)明制備得到的生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑，能發(fā)揮持久抗炎作用，減少術(shù)后瘢痕形成，有效預(yù)防食管術(shù)后狹窄，減少手術(shù)并發(fā)癥。為一次性給藥，減少患者接受治療的次數(shù)，減輕患者負(fù)擔(dān)，有效改善患者的生活質(zhì)量。

本發(fā)明所用生物蛋白膠，購自上海萊士血液制品股份有限公司(催化劑：每瓶1000IU，2ml/瓶，主體膠：每瓶100-180mg，2ml/瓶)；醋酸曲安奈德注射液(5ml∶50mg)，購自天津金耀氨基酸有限公司；抑肽酶，購自上海雅心生物技術(shù)有限公司；THZ-9213型臺式恒溫振蕩器，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；滅菌注射用水，購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；生理鹽水，購自西南藥業(yè)股份有限公司。

說明書附圖

圖1為色譜測定圖，圖中，A為生理鹽水+抑肽酶溶液的色譜圖，B為醋酸曲安奈德注射液的色譜圖，C為曲安奈德+生理鹽水+抑肽酶溶液的色譜圖；

圖2為緩釋劑在37℃生理鹽水中曲安奈德釋放曲線圖，圖中，A表示含2.5mg曲安奈德緩釋劑，B表示含5.0mg曲安奈德緩釋劑，C表示含7.5mg曲安奈德緩釋劑。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例一：制備生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在無菌無酶環(huán)境中用900μl生理鹽水溶解，充分混勻，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，用配套的主體膠溶液溶解主體膠，得到生物蛋白主體膠溶液；

3)配置催化劑溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步驟2)配置的生物蛋白主體膠溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.125ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；取配套的第二注射器，抽取步驟3)配置的催化劑溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.125ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固地連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準(zhǔn)備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結(jié)形成生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑(含曲安奈德2.5mg)。

實施例二：制備生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在無菌無酶環(huán)境中用900μl生理鹽水溶解，充分混勻，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，用配套的主體膠溶液溶解主體膠，得到生物蛋白主體膠溶液；

3)配置催化劑溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步驟2)配置的生物蛋白主體膠溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；取配套的第二注射器，抽取步驟3)配置的催化劑溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固地連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準(zhǔn)備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結(jié)形成生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑(含曲安奈德5.0mg)。

實施例三：制備生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在無菌無酶環(huán)境中用900μl生理鹽水溶解，充分混勻，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，用配套的主體膠溶液溶解主體膠，得到生物蛋白主體膠溶液；

3)配置催化劑溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步驟2)配置的生物蛋白主體膠溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.375ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；取配套的第二注射器，抽取步驟3)配置的催化劑溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.375ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固的連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準(zhǔn)備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結(jié)形成生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑(含曲安奈德7.5mg)。

實施例四：制備生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑

1)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，取生物蛋白主體膠，用醋酸曲安奈德注射液作溶劑，溶解得到生物蛋白主體膠溶液；

2)配置催化劑溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

3)取配套的第一注射器，第二注射器，分別抽取等體積的步驟1)配置的生物蛋白主體膠溶液和步驟2)配置的催化劑溶液，將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固的連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準(zhǔn)備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結(jié)成白色膠凍樣的生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑。

實施例五：制備生物蛋白膠空白對照組

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在無菌無酶環(huán)境中用900μl生理鹽水溶解，充分混勻，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，用配套的主體膠溶液溶解主體膠，得到生物蛋白主體膠溶液；

3)配置催化劑溶液

按照購買的醫(yī)用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步驟2)配置的生物蛋白主體膠溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml生理鹽水，混勻；取配套的第二注射器，抽取步驟3)配置的催化劑溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml生理鹽水，將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固的連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準(zhǔn)備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結(jié)形成生物蛋白膠空白對照組(不含曲安奈德)。

體外緩釋實驗：

將實施例一、二、三、五制備得到的生物蛋白膠分別置于四個燒杯中，各燒杯分別加入生理鹽水5ml，用THZ-9213型臺式恒溫振蕩器于37℃恒溫振蕩，每隔12h(即12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h)吸取釋放液5ml，并補(bǔ)充生理鹽水5ml，繼續(xù)振蕩。

色譜分析：

色譜分析條件：色譜柱(Water×BridgeC18，4.6mm×15mm，5μm)；流動相為水：甲醇＝30∶70；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：30℃；檢測波長：240nm；流速：1ml/min。

專屬性試驗

按上述色譜分析條件分別色譜分析測定生理鹽水+抑肽酶溶液、醋酸曲安奈德注射液、曲安奈德+生理鹽水+抑肽酶溶液，并獲得如圖1所示色譜圖。通過觀察圖1所得色譜峰可知，本試驗方法特異性較好，曲安奈德保留時間約為8.6min，未檢測到其他物質(zhì)對生物蛋白膠內(nèi)曲安奈德測定的干擾。

線性曲線方程

分別用滅菌注射用水配置濃度(X)為0.05μg/ml、0.10μg/ml、1.00μg/ml、10.00μg/ml、50.00μg/ml的5個濃度梯度的曲安奈德溶液，按上述色譜分析條件進(jìn)行色譜分析測定，以峰面積Y為應(yīng)變量，濃度X(μg/ml)為自變量，通過線性回歸算得回歸方程：Y＝63362X-10006(r＝0.9999，n＝5)。將色譜峰面積帶入回歸方程計算相應(yīng)濃度C，并計算濃度偏差(D＝(C-X)*100％)，以偏差在5％內(nèi)確定最低檢測限。結(jié)果表明，曲安奈德在0.05～50μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

精密度實驗

用滅菌注射用水配置濃度為5μg/ml的曲安奈德溶液。按上述色譜分析條件進(jìn)行色譜分析測定。單日內(nèi)每隔3h測定3次，共測定3批；日間于每日同一時間測定3次，連續(xù)測定3d，其結(jié)果見表1。日內(nèi)平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.95％，日間平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.77％。

表1：精密度測試結(jié)果 (n＝3)

穩(wěn)定性實驗

任取體外緩釋實驗的同一釋放液，放入冰箱于4℃保溫，分別于0，2，4，6，8，10，15，20，30d時按上述色譜分析條件進(jìn)行色譜分析檢測，根據(jù)得到的回歸方程計算其曲安奈德的含量，結(jié)果顯示RSD＝0.83％(n＝9)，表明釋放液在30d內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性實驗

取同一釋放液，分成6份，配置成6份平行樣本，按上述色譜分析條件進(jìn)行色譜分析檢測，根據(jù)得到的回歸方程計算其曲安奈德的含量，結(jié)果顯示RSD＝1.01％，(n＝6)，表明該方法重復(fù)性良好。

體外釋放率

按照上述色譜分析條件，分別色譜分析體外緩釋試驗所得釋放液，算得色譜峰面積，代入得到的回歸方程，得到各樣本溶液濃度。再根據(jù)累積釋放率公式得到曲安奈德的累積釋放率，累積釋放率＝(∑CV)/M，其中C為根據(jù)回歸方程計算得到的各樣本釋放液中曲安奈德濃度，V為各樣本釋放液體積，M為溶解入生物蛋白膠內(nèi)曲安奈德的質(zhì)量。以累計釋放率為縱坐標(biāo)(Y軸)，以時間為橫坐標(biāo)(X軸)，做一如圖2所示體外累計釋放率曲線。由圖2可知，生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑可在外界環(huán)境溫度為37℃的條件下，在生理鹽水中持續(xù)穩(wěn)定釋放，緩釋時長長達(dá)120h。表明曲安奈德在生物蛋白膠中的緩釋效果有良好的穩(wěn)定性和時效性。

施藥方法：

將實施例四制備得到的生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑裝入內(nèi)鏡配套的噴涂裝置內(nèi)，內(nèi)鏡管道沿內(nèi)鏡活檢孔道伸入，內(nèi)鏡管道外口與噴涂裝置相連，內(nèi)鏡管道內(nèi)口在直視下對應(yīng)患者消化道指定部位，即可對指定部位噴涂生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑。