本發(fā)明屬于磁性復(fù)合材料和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有氧化還原響應(yīng)性的磁性復(fù)合粒子及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

光動(dòng)力治療(PDT)是近年來興起的一種有效的腫瘤治療手段，具有廣闊的發(fā)展前景。光動(dòng)力治療的三要素是光敏劑、氧氣和激光光源。首先光敏劑在腫瘤組織富集，然后用特定波長(zhǎng)激光照射使腫瘤組織處的光敏劑受到激發(fā)，隨之激發(fā)態(tài)的光敏劑把能量傳遞給周圍的氧產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

根據(jù)大量研究表明，Ce6是一種非常有效的光敏劑，但是由于其疏水性，直接注射后經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)腫瘤組織的濃度很低，而且對(duì)正常細(xì)胞也會(huì)有一定的毒性。現(xiàn)急需一種合適的載體材料來來增強(qiáng)其在腫瘤組織的富集和降低副反應(yīng)以及逃逸免疫系統(tǒng)的識(shí)別?，F(xiàn)階段已經(jīng)有很多研究來發(fā)展藥物傳輸體系(Drug Delivery Systems, DDS)，這些載體包括納米水凝膠、各種形態(tài)的膠束、納米粒子、無機(jī)有機(jī)復(fù)合材料等。

近年來，磁性復(fù)合粒子受到人們的廣泛關(guān)注。由于磁性復(fù)合粒子同時(shí)具有無機(jī)磁性物質(zhì)的磁性以及有機(jī)高分子的性質(zhì)，可以在外界磁場(chǎng)的作用下快速、高效地分離，從而在產(chǎn)物分離純化、磁共振檢測(cè)、靶向載藥等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。從應(yīng)用的角度考慮，作為藥物傳輸體系的載體材料，理想的磁性粒子應(yīng)同時(shí)具有合適的粒子尺寸、單分散性好、生物相容性好，長(zhǎng)循環(huán)性能好低毒性等特性。

目前，通過乳液聚合方法可以制備出不同結(jié)構(gòu)的磁性聚合物復(fù)合粒子。但是乳液聚合對(duì)于結(jié)構(gòu)控制相對(duì)較差，要獲得結(jié)構(gòu)較好、磁含量可控的復(fù)合粒子。通常需要采用多步步驟進(jìn)行制備。雖然基于magneto-template和細(xì)乳液聚合的制備方法可以不用借助過渡層，直接在磁性納米粒子表面包覆聚合物殼層(Xia, A.; Hu, J. H.; Wang, C. C.; Jiang, D. L. Small2007, 3, 1811-1817.)，此方法雖然可以無需借助過渡層，但是只能用來制備殼層為疏水殼層的復(fù)合粒子，而基于回流沉淀聚合的方法直接在磁性納米粒子表面包覆PMAA親水殼層(Ma, W. F.; Xu, S.; Li, J. M.; Guo, J.; Lin, Y.; Wang, C. C.; J Polym Sci Part A: Polym Chem2011, 49, 2725-2733.)，但是也是需要先在磁性納米粒子用硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行修飾才能在外層包覆。因此，開發(fā)制備無需過渡層，無需在磁性納米粒子表面進(jìn)行修飾，殼層為親水殼層的復(fù)合粒子是十分必要的。

另外，對(duì)于運(yùn)用到生物體內(nèi)的載體材料，實(shí)現(xiàn)它的循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，腫瘤組織富集能力強(qiáng)也是目前研究的另一大挑戰(zhàn)，目前的研究一方面是通過控制粒子的尺寸，另一方面主要是通過修飾PEG等不帶電荷的親水鏈段的方法達(dá)到抵抗蛋白吸附、延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的目的。近年來，磷酸膽堿作為一種類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，是一種非常優(yōu)異的防蛋白吸附物質(zhì)，也被廣泛用作載體材料的修飾(Shao,Q. and Jiang,S. Y.*, Adv. Mater. 2015, 27, 15–26)目前為止，沒有關(guān)于其直接作為聚合物殼層用來包覆無機(jī)納米粒子的相關(guān)報(bào)道。

基于以上信息，本發(fā)明設(shè)計(jì)制備出一種表面磷酸膽堿包覆的具有氧化還原響應(yīng)性的、單分散性好，循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)、防蛋白吸附、能夠較好逃逸網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除，同時(shí)可以通過EPR效應(yīng)在腫瘤部位富集的核殼式磁性復(fù)合粒子，該類載體材料將會(huì)在癌癥治療領(lǐng)域有極其廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出了一種含磷酸膽堿聚合物包覆的核殼式磁性復(fù)合粒子及其制備方法和用途。

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中所存在的問題，提出無需過渡層且無需對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行表面修飾，首先通過溶劑熱的方法制備磁性四氧化三鐵納米粒子團(tuán)簇，然后以磁性四氧化三鐵納米粒子團(tuán)簇為核，直接用回流沉淀的方法制備以聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿為親水殼層的核殼式磁性復(fù)合粒子。

本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于將聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(PMPC)直接作為聚合物殼層包覆無機(jī)納米粒子，達(dá)到修飾無機(jī)材料的目的。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，首先以六水合三氯化鐵、鈉鹽和檸檬酸鹽為原料制備檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁性納米粒子團(tuán)簇(簡(jiǎn)稱磁簇)；然后通過回流沉淀聚合的方法在磁簇表面包覆一層致密的含磷酸膽堿聚合物的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，得到以磁簇為核、含磷酸膽堿聚合物網(wǎng)絡(luò)為殼的親水性磁性聚合物復(fù)合粒子。

將得到單分散性的核殼式磁性復(fù)合粒子在乙醇中與Ce6、5-ALA等光敏劑混合均勻，從而得到負(fù)載有Ce6的磁性復(fù)合粒子。該類核殼結(jié)構(gòu)粒子因?yàn)橛蓄惣?xì)胞膜結(jié)構(gòu)的磷酸膽堿作為殼層而呈現(xiàn)出很好的單分散性，極好的防蛋白吸附性和生物相容性，而且可以精確的控制聚合物殼層的厚度以及交聯(lián)度，是一種較為理想用于生物體內(nèi)的載體材料，應(yīng)用于癌癥治療領(lǐng)域。

本發(fā)明提出的含磷酸膽堿聚合物包覆的核殼式磁性復(fù)合粒子的制備方法，具體步驟如下：

（1）將六水合三氯化鐵、鈉鹽和檸檬酸鹽溶解在乙二醇中，在140-180℃下機(jī)械攪拌1-1.5h，然后加入含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放置在190-230℃的烘箱中8-48h；取出，用自來水使其冷卻至室溫；用磁分離的方法分離出產(chǎn)物，并用無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌再磁分離除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，得到檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁性納米粒子團(tuán)簇(簡(jiǎn)稱磁簇)，最后將產(chǎn)物分散在無水乙醇中或烘干成粉末，備用；

（2）將以上得到的磁簇，以及磷酸膽堿單體、交聯(lián)劑N,N'-雙(丙烯酰)胱胺(BACy)、2,2-偶氮二異丁腈以及溶劑乙腈加入單口燒瓶中，超聲3-30min，使其混合均勻，然后將燒瓶連接到裝有直形冷凝管的加熱裝置上，在85℃-110℃的溫度下進(jìn)行聚合反應(yīng)，反應(yīng)30min-4h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離得到產(chǎn)物，并用無水乙醇和蒸餾水進(jìn)行洗滌，得到以磁簇為核、含磷酸膽堿聚合物網(wǎng)絡(luò)為殼的親水性磁性聚合物復(fù)合粒子，最后將其分散在無水乙醇/蒸餾水中或凍干，備用。

本發(fā)明中，所述的鈉鹽為醋酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉中的一種。

本發(fā)明中，所述的檸檬酸鹽為檸檬酸和檸檬酸鈉中的一種；也可以是聚丙烯酸，聚丙烯酸鈉，聚谷氨酸及瓊脂糖等親水性高分子中的一種。

本發(fā)明中，所述的磷酸膽堿單體為2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿。

本發(fā)明中，聚合反應(yīng)的體系(即磁簇、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿以及N,N'-雙(丙烯酰)胱胺(BACy)的濃度之和)的濃度為0.001 wt %到5 wt %之間，得到的聚合物殼層厚度為5nm-500nm。

本發(fā)明中，所述的交聯(lián)劑N,N'-雙(丙烯酰)胱胺(BACy)的用量與2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿和N,N'-雙(丙烯酰)胱胺(BACy)用量總和的摩爾比為1:100-10:1，制備得到的粒子殼層交聯(lián)度為0.5%-- 100%。

本發(fā)明制備的含磷酸膽堿聚合物包覆的磁性復(fù)合粒子，具有氧化還原刺激響應(yīng)性，良好的生物相容性和體內(nèi)可降解性。其核可在酸性條件下降解，殼層可在二硫蘇糖醇(DTT)或者還原型谷胱甘肽(GSH)的條件下降解，是一種較為理想的用于生物體內(nèi)的載體材料，用于負(fù)載光敏劑或抗腫瘤藥物，治療相關(guān)疾病。具體做法為：

將負(fù)載物質(zhì)溶解在乙醇或其混合溶劑中，然后將以上得到的含磷酸膽堿聚合物包覆的磁性復(fù)合粒子超聲分散于體系中，室溫?cái)嚢?.5-48h，磁分離除去未負(fù)載的物質(zhì)，得到負(fù)載有負(fù)載物質(zhì)的磁性復(fù)合粒子，最后將其分散于蒸餾水中備用。

本發(fā)明中，所述的負(fù)載物質(zhì)為光敏劑二氫卟吩e6(Ce6)、5-氨基酮戊酸(5-ALA)或者抗腫瘤藥物紫杉醇、阿霉素、SN38、順鉑中的一種。

本發(fā)明中，所述的負(fù)載物質(zhì)（如Ce6等）的用量與負(fù)載物質(zhì)和磁性復(fù)合粒子的用量總和的質(zhì)量比為1:20-1:1，負(fù)載物質(zhì)（如Ce6等）的負(fù)載率為1%-30%。

實(shí)驗(yàn)表明，將載有Ce6的磁性核殼式磁性粒子肝癌細(xì)胞(HepG₂)一起培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞，載有Ce6的磁性核殼式磁性粒子體現(xiàn)出了很好的進(jìn)細(xì)胞能力。通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)24 h后通過磁性核殼式磁性粒子負(fù)載Ce6的方式使得更多的Ce6進(jìn)入細(xì)胞，表現(xiàn)出的結(jié)果為熒光很強(qiáng)，而單獨(dú)的Ce6則表現(xiàn)出熒光較弱。

本發(fā)明制備方法清晰簡(jiǎn)潔高效，得到的磁性復(fù)合粒子載體具有氧化還原響應(yīng)性，可以使得載體在腫瘤組織外低GSH濃度的而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高GSH濃度的環(huán)境中快速降解，釋放Ce6，進(jìn)行腫瘤的光動(dòng)力學(xué)治療，而且由于殼層為磷酸膽堿，使得該磁性復(fù)合粒子在血液中保持穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)，并且可以精確的控制殼層厚度從而可以制備出最適合通過EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織的尺寸大小而不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。而粒子的可生物降解性和降解后的小分子量又可以使得藥物載體迅速代謝排出體外，進(jìn)一步減少對(duì)人體的副作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的核殼式復(fù)合磁性粒子的透射電鏡照片和動(dòng)態(tài)光散射曲線。其中，A是透射電鏡照片，B是動(dòng)態(tài)光散射曲線。

圖2：A是本發(fā)明制備的核殼式復(fù)合磁性粒子及四氧化三鐵磁性納米團(tuán)簇的磁滯回歸曲線圖；B是用TGA表征的本發(fā)明制備的核殼式復(fù)合磁性粒子殼層在不同時(shí)間的降解率。

圖3：用激光共聚焦顯微鏡拍攝的負(fù)載Ce6的核殼式磁性復(fù)合粒子與HepG₂細(xì)孵育24h后粒子的進(jìn)細(xì)胞能力照片。其中，(a)-(e)為負(fù)載Ce6的磁性復(fù)合粒子(Ce6-Fe₃O₄@PMPC); (f)-(j)為負(fù)載Ce6的磁性四氧化三鐵納米團(tuán)簇(Ce6-Fe₃O₄); (k)-(o)為Ce6。

具體實(shí)施方式

下面將通過實(shí)例對(duì)于本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：殼層厚度為150nm左右，以BACy為交聯(lián)劑，交聯(lián)度為15%的核殼式Fe₃O₄@PMPC復(fù)合粒子的制備

1、檸檬酸穩(wěn)定的磁簇的制備

將4.32g六水合三氯化鐵(FeCl₃?6H2O)，4.8g醋酸鈉(NaOAc)，1g檸檬酸鈉超聲溶解在80ml乙二醇中后，加入到150ml三口燒瓶中，升溫至165℃，機(jī)械攪拌，保溫反應(yīng)1.5h后，將燒瓶中液體迅速轉(zhuǎn)移至容量為100ml的含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，再將反應(yīng)釜放入200℃的烘箱反應(yīng)22h后取出，用自來水冷卻至室溫。磁分離法分離出產(chǎn)物，用無水乙醇與蒸餾水交替洗滌除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，最后將產(chǎn)物凍干備用；

2、Fe₃O₄@PMPC復(fù)合粒子的制備

將12.5mg磁簇和40ml乙腈一并加入至100ml單口燒瓶中分散，再加入125mg2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿、19.4mg BACy、1.738mg 2,2-偶氮二異丁腈，使其溶解在反應(yīng)體系中。然后將燒瓶連接到裝有直形冷凝管的加熱裝置上，95℃回流2h。反應(yīng)結(jié)束后磁分離得到產(chǎn)物，并用無水乙醇進(jìn)行洗滌。

實(shí)施例2：殼層厚度為100nm左右，以BACy為交聯(lián)劑，交聯(lián)度為8%的核殼式Fe₃O₄@PMPC復(fù)合粒子的制備1、檸檬酸穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；

2、Fe₃O₄@PMPC復(fù)合粒子的制備同實(shí)施例1-2中所述。所不同的是交聯(lián)劑BACy的用量是8.8mg。

實(shí)施例3：殼層厚度為50nm左右，以BACy為交聯(lián)劑，交聯(lián)度為8%的核殼式Fe₃O₄@PMPC粒子的制備

1、檸檬酸穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；

2、Fe₃O₄@PMPC復(fù)合粒子的制備同實(shí)施例1-2中所述。所不同的是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿、BACy、2,2-偶氮二異丁腈的用量分別是50mg、3.5mg、0.7mg。

實(shí)施例4：

取實(shí)施例中制得的Fe₃O₄@PMPC粒子15mg，加入3.75mg的Ce6，用無水乙醇配成10 mL的溶液，常溫下攪拌24h，產(chǎn)物用磁分離除去未負(fù)載進(jìn)去的Ce6，將負(fù)載有Ce6的載體分散于蒸餾水中備用，載藥率的重量比為10%－20%。