本公開一般涉及針對(duì)前列腺特異性膜抗原(psma)的親和結(jié)合實(shí)體。本文提供了能夠結(jié)合psma的嵌合抗原受體(car)、多核苷酸、包含所述多核苷酸和/或car的宿主細(xì)胞，以及治療患者中與psma相關(guān)的病癥的方法。

背景技術(shù)：

1、從早期專注于基本淋巴因子活化和/或腫瘤浸潤(rùn)到最近的工程化免疫細(xì)胞以表達(dá)遺傳工程化抗原受體(諸如嵌合抗原受體(car))的策略，過(guò)繼細(xì)胞療法已經(jīng)歷了超過(guò)三十年(30)的近乎不斷迭代。盡管在此過(guò)程中已經(jīng)有一些暗示和跡象表明了這些方法的治愈潛力，但仍有許多工作要做。特別是，car-t淋巴細(xì)胞能否成功根除腫瘤取決于car-t細(xì)胞的持久性和效應(yīng)功能，但其中任何一種過(guò)量都會(huì)觸發(fā)患者的移植物抗宿主(gvh)效應(yīng)。此外，雖然表達(dá)car的t細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面已顯示出一些成功，但在其他癌癥類型，特別是實(shí)體腫瘤中僅顯示出有限的功效。與血液系統(tǒng)疾病相比，實(shí)體腫瘤面臨著獨(dú)特的挑戰(zhàn)，包括但不限于高度免疫抑制和代謝挑戰(zhàn)的腫瘤微環(huán)境。

2、前列腺特異性膜抗原(psma)，也稱為谷氨酸羧肽酶ii、或n-乙酰化α連接酸性二肽酶1或葉酸水解酶1(folh1)，是一種二聚體2型跨膜糖蛋白。psma是一種前列腺癌相關(guān)細(xì)胞膜抗原，在前列腺上皮內(nèi)瘤變(pin)(一些前列腺細(xì)胞開始出現(xiàn)外觀和行為異常的疾患)、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌以及其他實(shí)體腫瘤(例如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、腎癌)的新生血管中經(jīng)常過(guò)表達(dá)。psma表達(dá)與疾病進(jìn)展和格里森評(píng)分(gleason?score)相關(guān)。psma表達(dá)在轉(zhuǎn)移性疾病、激素難治性病例和高級(jí)別病變中增加，并且在雄激素不敏感腫瘤中進(jìn)一步上調(diào)。

3、迄今為止，針對(duì)psma的過(guò)繼細(xì)胞治療方法存在毒性問(wèn)題，從而限制了此類方法的實(shí)際轉(zhuǎn)化。2020年8月，poseida?therapeutics進(jìn)行的一項(xiàng)i期臨床研究因一名用p-psma-101治療的患者死亡而暫停，p-psma-101是一種利用αβt細(xì)胞的自體car-t細(xì)胞療法，所述細(xì)胞被設(shè)計(jì)靶向表達(dá)psma的前列腺癌細(xì)胞。本實(shí)例中的患者出現(xiàn)了與巨噬細(xì)胞活化綜合征(mas)一致的癥狀，mas是一種與car-t療法有關(guān)的嚴(yán)重的且有時(shí)致命的免疫系統(tǒng)過(guò)度活化。2021年3月，公布了賓夕法尼亞大學(xué)進(jìn)行的一項(xiàng)i期臨床試驗(yàn)的結(jié)果，所述試驗(yàn)測(cè)試了利用被設(shè)計(jì)靶向psma的αβt細(xì)胞并配備顯性負(fù)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tgf)-β的自體car-t細(xì)胞的功效(narayan等人,(2022)nature?medicine.doi:10.1038)。結(jié)果揭示，在接受所有四個(gè)劑量水平療法的13名患者中，有5名患者出現(xiàn)了≥2級(jí)細(xì)胞因子釋放綜合征(crs)，包括一名患者因4級(jí)crs與并發(fā)膿毒癥而死亡。因此，迄今為止，psma靶向的car-t已在αβt細(xì)胞的背景下進(jìn)行了檢查，其中潛在功效似乎受到總體上較高的同種反應(yīng)潛力以及其引發(fā)諸如crs和mas的并發(fā)癥的傾向的連累。

4、伽馬德爾塔(γδ)t細(xì)胞是胸腺衍生的淋巴細(xì)胞，其在活化和功能機(jī)制以及解剖分布方面與αβt細(xì)胞不同。具體而言，雖然αβt細(xì)胞專門在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用，但γδt細(xì)胞是先天性樣免疫細(xì)胞，它們通過(guò)一系列活化受體以mhc非依賴性方式識(shí)別惡性細(xì)胞，類似于nk細(xì)胞(welsh等人,immunol?rev.1997；159:79-93)。因此，并且與αβt細(xì)胞相比，γδt細(xì)胞可潛在地用于同種異體環(huán)境，而不會(huì)有引起移植物抗宿主病(gvhd)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，最近的研究已表明，工程化的γδ-t細(xì)胞可比αβ-t細(xì)胞產(chǎn)生更少的促炎細(xì)胞因子，從而可降低患者發(fā)生crs的風(fēng)險(xiǎn)(harrer等人,bmc?cancer?2017；17(1):551)。

5、盡管car-t療法發(fā)展迅速并且強(qiáng)勁，但將導(dǎo)致體內(nèi)和人體功效的car-t細(xì)胞-靶標(biāo)相互作用的最佳參數(shù)尚不清楚。鑒于αβt細(xì)胞與γδt細(xì)胞相比的作用機(jī)制和功能差異，在αβt細(xì)胞背景下展示的car功能和有效性并不能預(yù)測(cè)在γδt細(xì)胞背景下car的功能和有效性。因此，psma靶向的car?t治療方法對(duì)γδt細(xì)胞的實(shí)際轉(zhuǎn)化充其量是不確定的。

6、因此，顯然仍然需要改進(jìn)的策略來(lái)提高施用后細(xì)胞的活性、存活和/或擴(kuò)增，同時(shí)提高靶向psma的過(guò)繼細(xì)胞治療方法的安全性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開提供了提高靶向psma的過(guò)繼細(xì)胞治療方法的安全性和有效性的方法、細(xì)胞、組合物和試劑盒。在一個(gè)方面中，提供了一種親和結(jié)合實(shí)體，其包含特異性結(jié)合到前列腺特異性膜抗原(psma)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的重鏈可變區(qū)/輕鏈可變區(qū)(hcvr/lcvr)序列對(duì)：seq?id?no:1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34和35/36；或選自由以下組成的組的hcvr/lcvr序列對(duì)的六個(gè)cdr：seq?id?no:1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34和35/36。在實(shí)施方案中，使用的編號(hào)系統(tǒng)是kabat等人。

2、在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的hcvr/lcvr序列對(duì)：seq?id?no:1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12和13/14；或選自由以下組成的組的hcvr/lcvr序列對(duì)的六個(gè)cdr：seq?id?no:1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12和13/14。

3、在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合到人psma的殘基574-686內(nèi)的表位，殘基根據(jù)圖18b中的seq?id?no:329進(jìn)行編號(hào)。在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合到由人psma的殘基574-686組成的表位，殘基根據(jù)圖18b中的seq?id?no:329進(jìn)行編號(hào)。在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合到包含人psma的殘基574-580、644-649和674-686或由其組成的表位，殘基根據(jù)圖18b中的seq?id?no:329進(jìn)行編號(hào)。在實(shí)施方案中，使用與鏈霉親和素珠結(jié)合的生物素化的重組人psma蛋白，通過(guò)噬菌體淘選來(lái)定位表位。在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no:1/2的hcvr/lcvr序列對(duì)。

4、在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合到人psma的殘基150-261內(nèi)的表位，殘基根據(jù)圖18b中的seq?id?no:330進(jìn)行編號(hào)。在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合到由人psma的殘基150-261組成的表位，殘基根據(jù)圖18b中的seq?id?no:330進(jìn)行編號(hào)。在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合到包含人psma的殘基150-161、167-172和256-261或由其組成的表位，殘基根據(jù)圖18b中的seq?id?no:330進(jìn)行編號(hào)。在實(shí)施方案中，使用與鏈霉親和素珠結(jié)合的生物素化的重組人psma蛋白，通過(guò)噬菌體淘選來(lái)定位表位。在實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no:9/10的hcvr/lcvr序列對(duì)。

5、在實(shí)施方案中，親和結(jié)合實(shí)體是抗體或抗體片段。在實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段是雙特異性的。在實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段是嵌合的、人源化的或人的。在實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段是單克隆的。在實(shí)施方案中，所述親和結(jié)合實(shí)體選自由以下組成的組：scfv、fab、fab'、fv、f(ab')2、dsfv、dab及其任和組合或多個(gè)。

6、根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種包含親和結(jié)合實(shí)體的嵌合抗原受體(car)，所述親和結(jié)合實(shí)體包含特異性結(jié)合到前列腺特異性膜抗原(psma)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的hcvr/lcvr序列對(duì)：seq?id?no:1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12和13/14；或選自由以下組成的組的hcvr/lcvr序列對(duì)的六個(gè)cdr：seq?idno:1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12和13/14。

7、在實(shí)施方案中，car進(jìn)一步包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含甘氨酸聚合物、甘氨酸-絲氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物、免疫球蛋白重鏈鉸鏈或受體衍生的鉸鏈。在實(shí)施方案中，受體衍生的鉸鏈?zhǔn)莄d8α鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，cd8α鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含如seq?id?no:156所示的氨基酸序列。

8、在實(shí)施方案中，car進(jìn)一步包含跨膜(tm)結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，tm結(jié)構(gòu)域包含以下的tm區(qū)：4-1bb/cd137、活化nk細(xì)胞受體、免疫球蛋白、b7-h3、baffr、blame(slamf8)、btla、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154、cd100(sema4d)、cd103、cd160(by55)、cd18、cd19、cd19a、cd2、cd247、cd27、cd276(b7-h3)、cd28、cd29、cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd30、cd4、cd40、cd49a、cd49d、cd49f、cd69、cd7、cd84、cd8、cd8α、cd8β、cd96(tactile)、cd11a、cd11b、cd11c、cd11d、cds、ceacam1、crt?am、細(xì)胞因子受體、dap10、dnam1(cd226)、fcγ受體、gads、gitr、hvem(lightr)、ia4、icam-1、igα(cd79a)、il-2rβ、il-2rγ、il-7rα、誘導(dǎo)型t細(xì)胞共刺激因子(icos)、整合素、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb2、itgb7、itgbl、kirds2、lat、lfa-1、特異性結(jié)合cd83的配體、light、ltbr、ly9(cd229)、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1；cd11a/cd18)、mhc?1類分子、nkg2c、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46、nkp80(klrf1)、ox-40、pag/cbp、程序性死亡-1(pd-1)、psgl1、selplg(cd162)、信號(hào)傳導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化分子(slam蛋白)、slam(slamf1；cd150；ipo-3)、slamf4(cd244；2b4)、slamf6(ntb-a；lyl08)、slamf7、slp-76、tnf受體蛋白、tnfr2、tnfsf14、toll配體受體、trance/rankl、vla1或vla-6或其片段、截短體或組合。在實(shí)施方案中，tm結(jié)構(gòu)域包括cd8的tm結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地其中cd8?tm結(jié)構(gòu)域是cd8α的tm結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，tm結(jié)構(gòu)域包含如seq?id?no:158所示的氨基酸序列。

9、在實(shí)施方案中，car進(jìn)一步包含共刺激結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，共刺激結(jié)構(gòu)域包括以下的共刺激結(jié)構(gòu)域：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、b7-h3、ceacam1、crtam、cd2、cd3c、cd4、cd7、cd8α、cd8β、cd11a、cd11b、cd11c、cd11d、il2rβ、il2γ、il7rα、il4r、il7r、il15r、il21r、cd18、cd19、cd19a、cd27、cd28、cd29、cd30、cd40、cds、cd49a、cd49d、cd49f、cd54(icam)、cd69、cd70、cd80、cd83、cd84、cd86、cd96(tactile)、cd100(sema4d)、cd103、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd152(ctla-4)、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd244(2b4)、cd270(hvem)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、cd278(icos)、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、fcr、fcγri、fcγrii、fcγriii、lat、nkg2c、slp76、trim、zap70、gitr、baffr、ltbr、lat、gads、light、hvem(lightr)、kirds2、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、nkg2c、nkg2d、ia4、vla-1、vla-6、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、slamf4、slamf6(ntb-a、ly108)、slamf7、slamf8(blame)、slp-76、pag/cbp、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、btla、jaml、cd150、psgl1、tslp、tnfr2或trance/rankl，或其部分或其組合。在實(shí)施方案中，共刺激結(jié)構(gòu)域是4-1bb共刺激結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，4-1bb共刺激結(jié)構(gòu)域包含如seq?id?no:162所示的氨基酸序列。

10、在實(shí)施方案中，car進(jìn)一步包含細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是cd3ζ細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，cd3ζ細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含如seq?id?no:164、166或167所示的氨基酸序列。

11、在實(shí)施方案中，car進(jìn)一步包含信號(hào)肽。在實(shí)施方案中，信號(hào)肽包含如seq?id?no:152所示的氨基酸序列。

12、在本發(fā)明的一方面，提供了一種分離的多核苷酸，其包含編碼前述親和結(jié)合實(shí)體中的任一種的核酸序列。在實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含所述多核苷酸。在實(shí)施方案中，所述多核苷酸可操作地連接到順式作用調(diào)控元件。

13、根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種細(xì)胞，其包含前述親和結(jié)合實(shí)體、多核苷酸和/或表達(dá)載體中的任一種或多種。

14、根據(jù)在本發(fā)明的一方面，提供了一種分離的多核苷酸，其包含編碼前述car中的任一種的核酸序列。在實(shí)施方案中，所述多核苷酸進(jìn)一步包含編碼至少一個(gè)多順?lè)醋咏宇^區(qū)的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述多順?lè)醋訁^(qū)編碼切割序列。在實(shí)施方案中，所述切割序列選自t2a、f2a、p2a、e2a、弗林蛋白酶和弗林蛋白酶-p2a(fp2a)。在實(shí)施方案中，所述多順?lè)醋咏宇^區(qū)編碼內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)。

15、在實(shí)施方案中，所述分離的多核苷酸進(jìn)一步包含編碼一個(gè)或多個(gè)額外的多肽的核酸序列。在實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)額外的多肽選自包含以下的組或選自由以下組成的組：淋巴毒素β受體(ltbr)、低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(lngfr)、tgf-β或fas的顯性負(fù)(dn)受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體(egfrt)的截短形式和膜結(jié)合il-12(mbil-12)或其任何組合。在實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)額外的多肽選自熒光蛋白、γ鏈細(xì)胞因子、cd19、cd20、lngfr、egfrt、ltbr、dntgfβr2及其任何組合。

16、在實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)額外的多肽是tgf-β的顯性負(fù)受體。在實(shí)施方案中，tgf-β的顯性負(fù)受體是dntgfβr2。在實(shí)施方案中，dntgfβr2包含如seq?id?no:265所示的氨基酸序列。在實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)額外的多肽是淋巴毒素β受體(ltbr)。在實(shí)施方案中，所述ltbr包含如seq?id?no:267所示的氨基酸序列。在實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)額外的多肽是表皮生長(zhǎng)因子受體(egfrt)的截短形式。在實(shí)施方案中，egfrt包含如seq?id?no:261所示的氨基酸序列。在實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)額外的多肽是低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(lngfr)。在實(shí)施方案中，lngfr包含如seq?id?no:273所示的氨基酸序列。在實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)額外的多肽是顯性負(fù)fas(dnfas)。在實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)額外的多肽是膜結(jié)合il-12(mbil-12)。在實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)額外的多肽是與cd70結(jié)合的car。

17、在實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)額外的多肽可操作地連接到編碼信號(hào)肽的核酸序列。在實(shí)施方案中，信號(hào)肽包含選自seq?id?no:259、seq?id?no:263、seq?id?no:267、seqid?no:271和seq?id?no:248的氨基酸序列。

18、在實(shí)施方案中，包含編碼car的核酸序列的所述分離的多核苷酸包含seq?id?no:205、209、213、217、221、225、229或233的核酸序列。在實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含分離的多核苷酸，其包含編碼car的核酸序列。在實(shí)施方案中，多核苷酸可操作地連接到順式作用調(diào)控元件。

19、根據(jù)一方面，本文提供了一種γδt細(xì)胞，其包含a)編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列，所述car包含特異性結(jié)合到前列腺特異性膜抗原(psma)的親和結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和/或(b)包含car的多肽，所述car包含由(a)的核酸序列編碼的氨基酸序列，其中γδt細(xì)胞在γδt細(xì)胞的表面上功能性地表達(dá)多肽或核酸編碼的car的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在實(shí)施方案中，所述γδt細(xì)胞是δ1、δ2、δ3或δ4γδt細(xì)胞，優(yōu)選地δ2-γδt細(xì)胞，更優(yōu)選地δ1γδt細(xì)胞。

20、根據(jù)一方面，本文提供了一種包含car的修飾的免疫細(xì)胞、包含編碼car的核酸序列的分離的多核苷酸和/或包含有包含編碼car的核酸序列的多核苷酸的表達(dá)載體，如本文所述。在實(shí)施方案中，所述修飾的免疫細(xì)胞是γδt細(xì)胞、γδnkt細(xì)胞、αβt細(xì)胞、nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。在實(shí)施方案中，所述修飾的免疫細(xì)胞是γδt細(xì)胞。在實(shí)施方案中，所述γδt細(xì)胞是δ1、δ2、δ3或δ4γδt細(xì)胞，優(yōu)選地δ2-γδt細(xì)胞，更優(yōu)選地δ1γδt細(xì)胞。

21、在實(shí)施方案中，針對(duì)表現(xiàn)出psma細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，所述修飾的免疫細(xì)胞或所述γδt細(xì)胞表現(xiàn)出體外和/或體內(nèi)腫瘤細(xì)胞殺傷活性。在實(shí)施方案中，所述細(xì)胞殺傷活性大于不包含car構(gòu)建體的相同類型的對(duì)照修飾的免疫細(xì)胞或?qū)φ咋忙膖細(xì)胞中的體外和/或體內(nèi)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的先天性水平。在實(shí)施方案中，所述修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞響應(yīng)于與表現(xiàn)出psma細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的接觸而增殖。在實(shí)施方案中，與不包含car構(gòu)建體的相同類型的對(duì)照修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞相比，所述修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞響應(yīng)于與表現(xiàn)出psma細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的接觸而表現(xiàn)出增加的增殖。

22、在實(shí)施方案中，所述修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞在包含表現(xiàn)出psma細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的宿主生物體中增殖。

23、在實(shí)施方案中，所述修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞在與表現(xiàn)出psma細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤細(xì)胞接觸后表達(dá)促炎細(xì)胞因子。

24、在實(shí)施方案中，所述修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞包含至少一個(gè)破壞的基因。在實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)破壞的基因是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的含sh2蛋白(cish)。在實(shí)施方案中，至少一種破壞的內(nèi)源基因是cbl原癌基因b(cbl-b)。在實(shí)施方案中，至少一種破壞的內(nèi)源基因是鋅指蛋白91(zfp91)。在實(shí)施方案中，至少一種破壞的內(nèi)源基因是roquin。在實(shí)施方案中，至少一種破壞的內(nèi)源基因是cd58和/或icam-1。

25、根據(jù)一方面，提供了如本文公開的多個(gè)修飾的免疫細(xì)胞。

26、根據(jù)一方面，提供了如本文公開的多個(gè)γδt細(xì)胞，優(yōu)選地其中所述γδt細(xì)胞包含(a)編碼如本文公開的car的核酸，所述car包含特異性結(jié)合到psma的親和結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和/或(b)包含car的多肽，所述car包含由(a)的核酸編碼的氨基酸序列，其中γδt細(xì)胞在γδt細(xì)胞的表面上功能性地表達(dá)多肽或核酸編碼的car的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

27、在實(shí)施方案中，所述多個(gè)修飾的免疫細(xì)胞或所述多個(gè)γδt細(xì)胞包含為至少60％、80％或約60％或80％至約90％或95％的δ1、δ2、δ3或δ4γδt細(xì)胞，優(yōu)選地δ1或δ2γδt細(xì)胞，更優(yōu)選地δ2-γδt細(xì)胞，最優(yōu)選地δ1γδt細(xì)胞的組成。

28、在實(shí)施方案中，所述多個(gè)修飾的免疫細(xì)胞或所述多個(gè)γδt細(xì)胞分別包含至少約107個(gè)修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞，優(yōu)選地分別約108個(gè)修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞至約1011個(gè)修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞。

29、根據(jù)一方面，提供了一種制備修飾的免疫細(xì)胞、γδt細(xì)胞、多個(gè)修飾的免疫細(xì)胞或多個(gè)γδt細(xì)胞的方法，其中所述方法包括用包含編碼如本文公開的car的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞，任選地其中所述細(xì)胞具有至少一個(gè)破壞的基因。在實(shí)施方案中，方法包括逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。在實(shí)施方案中，方法包括離體擴(kuò)增免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞，其中離體擴(kuò)增在免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞轉(zhuǎn)染前和/或轉(zhuǎn)染后進(jìn)行。

30、根據(jù)本發(fā)明的方面，提供了一種抗體-藥物綴合物(adc)，其包含前述親和結(jié)合實(shí)體中的任一種。

31、根據(jù)本發(fā)明的方面，提供了一種藥物組合物，其包含前述親和結(jié)合實(shí)體、修飾的免疫細(xì)胞、γδt細(xì)胞或adc中的任一種，以及藥學(xué)上可接受的載劑。

32、根據(jù)本發(fā)明的方面，提供了一種抑制表現(xiàn)出psma細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括使所述細(xì)胞與前述親和結(jié)合實(shí)體、修飾的免疫細(xì)胞、γδt細(xì)胞、adc或藥物組合物中的任一種接觸。

33、根據(jù)本發(fā)明的方面，提供了一種殺傷表現(xiàn)出psma細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的方法，方法包括使腫瘤細(xì)胞與治療有效量的前述親和結(jié)合實(shí)體、修飾的免疫細(xì)胞、γδt細(xì)胞、adc或藥物組合物中的任一種接觸。在實(shí)施方案中，所述方法包括將治療有效量的親和結(jié)合實(shí)體、修飾的免疫細(xì)胞、γδt細(xì)胞、adc或藥物組合物引入到包含腫瘤細(xì)胞的宿主生物體中。

34、在殺傷腫瘤細(xì)胞的方法的實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括同時(shí)或依序施用升高共用γ鏈細(xì)胞因子的一種或多種方法。在實(shí)施方案中，施用升高共用γ鏈細(xì)胞因子的一種或多種方法包括在引入修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞之前和/或之后同時(shí)或依序施用有效增加引入的修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞的增殖、細(xì)胞毒性活性、持久性或其組合的一定量的共用γ鏈細(xì)胞因子。在實(shí)施方案中，升高共用γ鏈細(xì)胞因子的一種或多種方法包括在引入修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞之前的淋巴細(xì)胞耗竭(lymphodepletion)。在實(shí)施方案中，升高共用γ鏈細(xì)胞因子的一種或多種方法包括從引入的修飾的免疫細(xì)胞或γδt細(xì)胞分泌一種或多種共用γ鏈細(xì)胞因子。

35、在本文的抑制表現(xiàn)出psma細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞生長(zhǎng)的方法或殺傷表現(xiàn)出psma細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的方法的實(shí)施方案中，與對(duì)照生物體相比，所述方法減少了宿主生物體的體內(nèi)腫瘤負(fù)擔(dān)和/或增加了宿主生物體的平均存活時(shí)間，其中對(duì)照生物體未用親和結(jié)合實(shí)體、修飾的免疫細(xì)胞、γδt細(xì)胞、adc或藥物組合物治療。在實(shí)施方案中，宿主生物體是人。在實(shí)施方案中，所述方法是治療有需要的受試者中的癌癥的方法。

36、根據(jù)一方面，提供了前述親和結(jié)合實(shí)體、修飾的免疫細(xì)胞、γδt細(xì)胞、adc或藥物組合物中的任一種在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。

37、在一方面，提供了一種減少或抑制向有需要的受試者施用的免疫細(xì)胞的移植物抗宿主反應(yīng)的方法，其包括施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的γδt細(xì)胞。在實(shí)施方案中，γδt細(xì)胞可包含與cd70和psma結(jié)合的雙重car，或方法可進(jìn)一步包括同時(shí)或依序共同施用根據(jù)本發(fā)明的γδt細(xì)胞與包含與psma結(jié)合的car和與cd70結(jié)合的car的免疫細(xì)胞(例如，t細(xì)胞或nk細(xì)胞)。

38、以引用的方式并入

39、本說(shuō)明書所提及的所有公布、專利和專利申請(qǐng)以引用的方式并入本文中，其程度就如同每個(gè)獨(dú)立的公布、專利或?qū)＠暾?qǐng)被具體地且單獨(dú)地指出以引用的方式并入那樣。