本發(fā)明屬于納米醫(yī)學(xué)，具體涉及一種用于卵巢癌免疫治療的腫瘤微環(huán)境(tme)響應(yīng)型dna納米機(jī)器，包括其制備方法和在卵巢癌治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性疾病，是世界各國居民的主要死因之一。到2040年，預(yù)計(jì)全球?qū)l(fā)生2840萬例新癌癥病例，比2020年的1930萬例增加47％。盡管手術(shù)和鉑類藥物化療作為標(biāo)準(zhǔn)的治療方案已經(jīng)應(yīng)用了幾十年，但腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率仍然很高，尤其是鉑類藥物化療耐受的患者。

2、近年來，腫瘤免疫治療以刺激腫瘤細(xì)胞的內(nèi)源性免疫響應(yīng)為基礎(chǔ)，已經(jīng)逐漸成為抗癌治療的前沿療法。其中，免疫檢查點(diǎn)阻斷療法已經(jīng)在一些惡性腫瘤的治療中取得了重大進(jìn)展。免疫檢查點(diǎn)(immune?checkpoint，ic)是指在免疫細(xì)胞上表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫激活程度的一系列分子。正常情況下，免疫檢查點(diǎn)的調(diào)節(jié)功能可以使機(jī)體免受自身免疫的攻擊和炎癥響應(yīng)的損害。細(xì)胞惡變后可通過上調(diào)ic的表達(dá),并與t細(xì)胞上相應(yīng)的位點(diǎn)結(jié)合可明顯抑制t細(xì)胞的殺傷活性，從而逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視與殺傷,以維持自身的存活。常見的免疫檢查點(diǎn)有程序性死亡受體及其配體、細(xì)胞溶解性t淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4、b/t淋巴細(xì)胞衰減子、淋巴細(xì)胞活化基因3、t細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白、腺苷a2a受體等。其中pd-1/pd-l1是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的免疫檢查點(diǎn)。

3、目前，治療性pd-l1抗體、和pd-1抗體已經(jīng)被大量開發(fā)出來，用于治療多種癌癥類型，包括黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、經(jīng)典霍奇金淋巴瘤等，通過抗體阻斷pd-l1/pd-1信號(hào)通路，可以重新激活腫瘤微環(huán)境(tumormicroenvironment，tme)中失活的免疫細(xì)胞，消除癌細(xì)胞，使失衡的抗腫瘤免疫系統(tǒng)趨于正?；?，這種治療策略在臨床試驗(yàn)和治療中顯示了積極的結(jié)果。

4、雖然pd-1/pd-l1抑制療法在腫瘤應(yīng)答后的療效顯著，但僅對黑色素瘤等少數(shù)腫瘤的orr(客觀緩解率)較高，其對所有癌癥的平均orr不足30％，尤其在婦科腫瘤中死亡率最高的卵巢癌中，只有約10％～20％的患者有免疫應(yīng)答。因此，亟需一種可以提升免疫檢查點(diǎn)阻斷療法的應(yīng)答率和總體療效的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種通過構(gòu)建免疫檢查點(diǎn)抑制、抗血管治療、外泌體阻斷三種抗腫瘤手段和腫瘤微環(huán)境靶向性于一體的dna納米機(jī)器。

2、本發(fā)明提供了一種dna納米機(jī)器，具體由兩大部分組成：一是靶向納米載體，二是內(nèi)部負(fù)載的藥物分子；所述靶向納米載體，是利用dna折紙術(shù)構(gòu)建tme響應(yīng)型納米載體；所述內(nèi)部負(fù)載的藥物分子，是三重聯(lián)合抗瘤作用分子。

3、第一步，先合成二維的dna平面折紙結(jié)構(gòu)(簡稱dna?tile)。

4、進(jìn)一步，n-deacetylatedbms-202與羧基修飾的ssdna脫水縮合得到bms-202-dna偶聯(lián)物，氨基化的anti-vegfr2與羧基修飾的ssdna脫水縮合得到anti-vegfr2-dna偶聯(lián)物。

5、進(jìn)一步，檢測bms-202-dna偶聯(lián)物與anti-vegfr2-dna偶聯(lián)物的濃度并提純：使用分光光度計(jì)分別檢測bms-202-dna偶聯(lián)物與anti-vegfr2-dna偶聯(lián)物的濃度；使用瓊脂糖凝膠電泳分別對bms-202-dna偶聯(lián)物與anti-vegfr2-dna偶聯(lián)物的分離并提純。

6、設(shè)計(jì)可靶向rab27a基因的shrna模板(t-shrna_rab27a)：5’-gctgccaatgggacaaacata-3’(人，seq?id?no：1)，5’-gcttctgttcgacctgacaaa-3’(小鼠，seqid?no：2)。

7、進(jìn)一步，將bms-202、shrna_rab27a的模板(templateofshrna_rab27a，簡稱t-shrna_rab27a)和anti-vegfr2特異性裝配在dna?tile上。

8、進(jìn)一步，再通過dna?tile兩側(cè)修飾的dna“鎖鏈”的自組裝作用將dna?tile折疊。

9、隨后用cy5熒光分子修飾“上鎖”的dna納米結(jié)構(gòu)，再將其與skov-3細(xì)胞共孵育1h、3h、6h、12h。

10、第二步，通過有機(jī)合成方法將兩段ssdna用ros響應(yīng)性基團(tuán)酮縮硫醇進(jìn)行偶聯(lián)——ros-respondingdna。

11、進(jìn)一步，在納米載體“鎖鏈”dna的設(shè)計(jì)上，采用“雙鎖”設(shè)計(jì)——ros_rdna。

12、第三步，從三個(gè)方面設(shè)計(jì)三重聯(lián)合抗瘤作用體系。

13、優(yōu)選的，bms-202作為本發(fā)明中的pd-l1抑制劑。

14、優(yōu)選的，雷莫蘆單抗(后文簡稱anti-vegfr2)作為vegf/vegfr2通路抑制劑。

15、優(yōu)選的，rab27a基因的shrna(shrna_rab27a)作為卵巢癌細(xì)胞外泌體生成的抑制劑。

16、本發(fā)明還提供了一種腫瘤細(xì)胞球模型(mcs)的制備方法，包括：

17、選取人卵巢癌細(xì)胞(skov-3)構(gòu)造體外三維細(xì)胞模型，細(xì)胞在第1天形成聚集體，邊緣粗糙，第3天左右，隨著細(xì)胞聚集體生長，邊緣趨于平滑，細(xì)胞聚集體生長地更為致密。第5～7天，大多數(shù)細(xì)胞聚集體生長為直徑為200～300μm的mcss，邊緣平滑，擁有致密的細(xì)胞生長層及大量的細(xì)胞外基質(zhì)存在。選用直徑200μm左右的mcs。

18、本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

技術(shù)特征：

1.一種用于卵巢癌免疫治療的腫瘤微環(huán)境(tme)響應(yīng)型dna納米機(jī)器，其特征在于，所述dna納米機(jī)器由靶向納米載體和內(nèi)部負(fù)載的藥物分子組成，所述靶向納米載體利用dna折紙術(shù)構(gòu)建，具有tme響應(yīng)性，能夠在腫瘤組織中特異性釋放藥物，所述內(nèi)部負(fù)載的藥物分子包括pd-l1抑制劑、vegf/vegfr2通路抑制劑和外泌體生成路徑抑制分子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的dna納米機(jī)器，其特征在于，所述靶向納米載體通過以下步驟構(gòu)建：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的dna納米機(jī)器，其特征在于，所述pd-l1抑制劑為bms-202。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的dna納米機(jī)器，其特征在于，所述vegf/vegfr2通路抑制劑為雷莫蘆單抗(anti-vegfr2)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的dna納米機(jī)器，其特征在于，所述外泌體生成路徑抑制分子為rab27a基因的shrna(shrna_rab27a)。

6.一種制備權(quán)利要求1所述的dna納米機(jī)器的方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.一種權(quán)利要求1所述的dna納米機(jī)器在卵巢癌治療中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述dna納米機(jī)器在腫瘤組織中特異性釋放藥物的機(jī)制為：在腫瘤微環(huán)境中，ros和核仁素作為“鑰匙”觸發(fā)dna納米機(jī)器的“雙鎖”結(jié)構(gòu)，釋放內(nèi)部負(fù)載的藥物分子。

9.一種權(quán)利要求1所述的dna納米機(jī)器在其他癌癥治療中的應(yīng)用，其特征在于，所述其他癌癥包括但不限于乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、甲狀腺乳頭狀癌和睪丸癌。

10.一種權(quán)利要求1所述的dna納米機(jī)器在制備抗腫瘤藥物靶向輸送系統(tǒng)中的應(yīng)用，其特征在于，所述抗腫瘤藥物包括但不限于化療藥物、免疫檢查點(diǎn)抑制劑和抗血管生成藥物。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明建立了一種新型的TME響應(yīng)型DNA納米機(jī)器，用于PD?L1抑制劑及聯(lián)合藥物的靶向遞送，旨在解決卵巢癌免疫檢查點(diǎn)阻斷療法靶向性低且療效差的問題；同時(shí)，還建立了一種腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性DNA納米機(jī)器用于納米藥物遞送，針對卵巢癌免疫檢查點(diǎn)抑制劑靶向性低、治療失效的問題，構(gòu)建了通用型靶向腫瘤微環(huán)境的抗癌DNA納米機(jī)器。

技術(shù)研發(fā)人員：李龍杰,鄭子陽,張薛皓,肖先金,萬凱旋,王麗梅,王宏勛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢輕工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15