本發(fā)明涉及全麻機(jī)制的中樞調(diào)控領(lǐng)域，尤其涉及一種全身麻醉覺醒和精神獎(jiǎng)賞副作用的神經(jīng)中樞調(diào)控實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)：

1、丙泊酚是目前為止臨床上使用最廣泛的全身靜脈麻醉藥物之一，符合快速誘導(dǎo)、鎮(zhèn)靜并維持手術(shù)條件、能在體內(nèi)快速代謝以便手術(shù)結(jié)束時(shí)患者可以盡快恢復(fù)意識(shí)即覺醒狀態(tài)，對(duì)維護(hù)患者健康和醫(yī)學(xué)發(fā)展有重大意義。雖然至今丙泊酚的麻醉機(jī)制還未完全明確，但丙泊酚麻醉作用與調(diào)節(jié)精神獎(jiǎng)賞作用的中腦邊緣系統(tǒng)有關(guān)聯(lián)。伏隔核（nac）作為麻醉藥麻醉時(shí)產(chǎn)生腦電爆發(fā)抑制的腦區(qū)之一，也是獎(jiǎng)賞環(huán)路的重要節(jié)點(diǎn)。該腦區(qū)的多巴胺能受體1（d1r）神經(jīng)元是參與nac與vta間投射的重要中間神經(jīng)元。

2、丙泊酚誘發(fā)小鼠產(chǎn)生條件位置偏愛現(xiàn)象（conditioned?place?preference，cpp）。與其他已知的成癮物質(zhì)類似，重復(fù)使用丙泊酚容易出現(xiàn)精神獎(jiǎng)賞，其濫用現(xiàn)象逐年增多。濫用丙泊酚比濫用其他成癮性藥物更易出現(xiàn)使用過量導(dǎo)致死亡。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)濫用丙泊酚致死人群中81%為用藥過量意外死亡。丙泊酚濫用人群中醫(yī)務(wù)人員占86%，而且一項(xiàng)調(diào)查顯示麻醉醫(yī)生濫用藥物致死情況中高達(dá)45%與濫用丙泊酚有關(guān)。本研究組前期研究已通過建立大鼠靜脈自身給藥模型和環(huán)境線索誘導(dǎo)的復(fù)吸模型，在動(dòng)物模型上驗(yàn)證了丙泊酚具有精神獎(jiǎng)賞作用，且發(fā)現(xiàn)與中腦邊緣系統(tǒng)nac?d1r和erk信號(hào)通路以及腹側(cè)被蓋區(qū)（ventraltegmental?area，vta）有關(guān)，拮抗nac?d1r減少大鼠丙泊酚自身給藥行為，但不影響大鼠活動(dòng)和自由攝食的劑量。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)激活nac?d1r神經(jīng)元可以誘導(dǎo)和維持覺醒，與這種神經(jīng)元去抑制中腦da能神經(jīng)元和外側(cè)下丘腦食欲肽神經(jīng)元有關(guān)。去抑制外側(cè)下丘腦食欲肽神經(jīng)元既能促進(jìn)麻醉覺醒也可以減輕痛覺敏感性，使經(jīng)化學(xué)遺傳學(xué)方法激活外側(cè)下丘腦食欲肽神經(jīng)元的小鼠在異氟烷麻醉后的覺醒加快。另外也有研究顯示通過光遺傳學(xué)方法激活vta?da能神經(jīng)元，可以使持續(xù)進(jìn)行異氟烷麻醉的小鼠覺醒。nac是vta?da能神經(jīng)元主要投射腦區(qū)之一，nac?d1r神經(jīng)元是nac投射到vta直接通路的神經(jīng)元，所以nac?d1r神經(jīng)元是參與這兩個(gè)核團(tuán)間相互投射的重要神經(jīng)元。

3、但是，現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于激活nac?d1r神經(jīng)元能否促進(jìn)丙泊酚麻醉覺醒和丙泊酚麻醉過程中抑制nac?d1r神經(jīng)元能否減弱麻醉覺醒后的精神獎(jiǎng)賞作用的研究還處于空白。

4、為此，本發(fā)明提出一種全身麻醉覺醒和精神獎(jiǎng)賞副作用的神經(jīng)中樞調(diào)控實(shí)驗(yàn)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)，而提出的一種全身麻醉覺醒和精神獎(jiǎng)賞副作用的神經(jīng)中樞調(diào)控實(shí)驗(yàn)方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、一種全身麻醉覺醒和精神獎(jiǎng)賞副作用的神經(jīng)中樞調(diào)控實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟：

4、s1：將小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并將小鼠隨機(jī)等分為兩大組，每大組隨機(jī)等分為6小組；

5、s2：伏隔核（nucleus?accumbens，nac）腦區(qū)多巴胺1受體（dopamine?1?receptor，d1r）腺相關(guān)病毒（adeno-associated?virus，aav）載體注射及表達(dá)；

6、s3：載體表達(dá)的離體電生理檢測(cè)，在aav載體表達(dá)好后，進(jìn)行nac腦片膜片鉗驗(yàn)證載體的表達(dá)，檢驗(yàn)給予cno時(shí)轉(zhuǎn)染化學(xué)遺傳載體的nac區(qū)d1r神經(jīng)元電生理活動(dòng)的變化，以及光刺激時(shí)轉(zhuǎn)染光遺傳學(xué)載體的nac區(qū)d1r神經(jīng)元電生理活動(dòng)的改變；

7、s4：?jiǎn)未伪捶勇樽硇∈竽Ｐ偷慕?，建立單次丙泊酚麻醉小鼠模型?/p>

8、s5：長(zhǎng)時(shí)激活nac?d1r神經(jīng)元調(diào)控丙泊酚麻醉覺醒；

9、s6：短時(shí)激活nac?d1r神經(jīng)元調(diào)控丙泊酚麻醉覺醒；

10、s7：建立小鼠cpp模型；

11、s8：長(zhǎng)時(shí)抑制nac?d1r神經(jīng)元調(diào)控丙泊酚麻醉覺醒后精神獎(jiǎng)賞副作用；

12、s9：短時(shí)抑制nac?d1r神經(jīng)元調(diào)控丙泊酚麻醉覺醒后精神獎(jiǎng)賞副作用。

13、優(yōu)選地：所述s1步驟中，十二組分別為：

14、veh?che?a組，其為化學(xué)遺傳學(xué)空載對(duì)照組，其處理?xiàng)l件為dio-eyfp?+脂肪乳+生理鹽水；

15、pro?a?l組，其為l丙泊酚麻醉組，其處理?xiàng)l件為dio-eyfp?+丙泊酚+生理鹽水；

16、pro?a?l+?che組，其為長(zhǎng)期激活覺醒組，其處理?xiàng)l件為dio-hm3d+丙泊酚+cno；

17、veh?opt?a組，其為光遺傳學(xué)空載對(duì)照組，其處理?xiàng)l件為dio-mcherry?+脂肪乳+無光照；

18、pro?a?s組，其為s丙泊酚麻醉組，其處理?xiàng)l件為dio-mcherry?+丙泊酚+無光照；

19、pro?a?s+?opt組，其為短期激活覺醒組，其處理?xiàng)l件為dio-hchr2+丙泊酚+光激活；

20、veh?che?c組，其為化學(xué)遺傳學(xué)空載對(duì)照組，其處理?xiàng)l件為dio-eyfp?+脂肪乳+生理鹽水；

21、pro?c?l組，其為l丙泊酚cpp組，其處理?xiàng)l件為dio-eyfp?+丙泊酚+生理鹽水；

22、pro?c?l+?che組，其為長(zhǎng)期抑制cpp組，其處理?xiàng)l件為dio-hm4d+丙泊酚+cno；

23、veh?opt?c組，其為光遺傳學(xué)空載對(duì)照組，其處理?xiàng)l件為dio-mcherry?+脂肪乳+無光照；

24、pro?c?s組，其為s丙泊酚cpp組，其處理?xiàng)l件為dio-mcherry?+丙泊酚+無光照；

25、pro?c?s+?opt組?，其為短期抑制cpp組，其處理?xiàng)l件為dio-enphr3.0?+丙泊酚+光抑制。

26、優(yōu)選地：所述s2步驟的具體步驟為：

27、s21：將小鼠置于腦立體定位儀上，進(jìn)行異氟烷氣體麻醉，保溫毯維持體溫，剃毛、消毒；

28、s22：切開顱頂皮膚暴露顱骨，以前囟bregma作為立體定位的原點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)門齒高度使后囟lambda與bregma水平；

29、s23：通過左右調(diào)平使矢狀縫兩側(cè)等距離的位點(diǎn)處于同一水平面；

30、s24：在nac腦立體的雙側(cè)分別注射對(duì)應(yīng)組別載體200?nl，留針10?min，nac腦立體定位坐標(biāo)為：ap?+1.4?mm，ml?±1.3mm，dv?-4.2mm；

31、s25：其中，veh?opt?a組、pro?a?s組、pro?a?s+?opt組以及veh?opt?c組、pro?c?s、pro?c?s+?opt組，在比注射深度淺0.5?mm處置入光纖，同時(shí)埋植兩個(gè)固定顱釘，牙科水泥覆蓋固定，未留置光纖組小鼠縫合皮膚；

32、s26：?jiǎn)位\飼養(yǎng)，轉(zhuǎn)染表達(dá)三周。

33、優(yōu)選地：所述s3步驟，其包括以下步驟：

34、s31：制備膜片鉗電極，記錄電極阻抗位于6～8mω；

35、s32：取每組的部分小鼠，麻醉后冰浴上快速取腦；震蕩切取并孵育nac腦組織切片，取出浸泡于0～4℃冰水混合狀態(tài)的nmdg液中進(jìn)行預(yù)冷的腦組織，震蕩切片的速度為0.1mm/s；

36、s33：用強(qiáng)力膠和瓊脂將腦片固定于震動(dòng)切片機(jī)的圓形底盤上，往切片機(jī)盒內(nèi)倒入冰水混合狀態(tài)的nmdg液超過腦組織；

37、s34：持續(xù)通入95%?o2+?5%?co2的混合氣體；

38、s35：切取300μm厚的冠狀腦片，選取含nac的腦片4—5張；然后在32?℃恒溫水浴鍋中裝有充分預(yù)充混合氣的nmdg液的第一個(gè)燒杯內(nèi)孵育10?min；

39、s36：室溫下裝有充分預(yù)充混合氣體的hepe液的第二個(gè)燒杯內(nèi)孵育60?min以上；啟動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)并放置腦片，將孵育好的腦片移入充滿acsf液的電生理記錄槽中，并在液面表面持續(xù)以2～4?ml/min的速度灌流預(yù)充混合氣體的33℃?acsf液，并u型金屬框尼龍細(xì)絲網(wǎng)輕壓腦片；

40、s37:5?min后吸掉腦片表面的組織碎塊和記錄槽內(nèi)的雜質(zhì)開始記錄，在低倍鏡下找到nac區(qū)域，發(fā)現(xiàn)表達(dá)腺苷探針的熒光細(xì)胞，轉(zhuǎn)換到高倍鏡進(jìn)行觀察，調(diào)整玻璃電極與記錄槽的液面接觸后，微調(diào)物鏡高度，使電極尖端能清楚顯示，選取輪廓完整、立體感強(qiáng)、細(xì)胞膜較清晰并富有彈性的熒光細(xì)胞；

41、s38：玻璃電極入液，與細(xì)胞膜進(jìn)行封接，破膜，在形成全細(xì)胞膜片鉗記錄模式后，維持5～10?min，待細(xì)胞內(nèi)外液交換穩(wěn)定后，在電壓鉗下進(jìn)行電生理信號(hào)記錄，觀察給予cno或光刺激時(shí)的信號(hào)改變，并使用patchmaster進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

42、優(yōu)選地：所述s4步驟中，小鼠轉(zhuǎn)染表達(dá)好載體后，按組別給予140?mg·kg-1，10ml·kg-1?i.p.的丙泊酚，即刻進(jìn)行l(wèi)orr評(píng)分，間隔15?s評(píng)分一次，并記錄開始注射丙泊酚的時(shí)間和覺醒時(shí)間，lorr評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：

43、0分，正常翻正；

44、1分，2?s內(nèi)翻正；

45、2分，2-10?s內(nèi)翻正；

46、3分，10?s內(nèi)沒有翻正。

47、優(yōu)選地：所述s5步驟包括以下步驟：

48、s51：veh?che?a組、pro?a?l組、pro?a?l+?che組，提前30?min分別給予10?ml·kg-1?i.p.的生理鹽水和1?mg·kg-1?i.p.的n-氧化氯氮平；

49、s52：然后分別給予10?ml·kg-1?i.p.的脂肪乳、丙泊酚、丙泊酚；

50、s53：隨后立即進(jìn)行l(wèi)orr評(píng)分。

51、優(yōu)選地：所述s6步驟中，其包括以下步驟：

52、s61：veh?opt?a組、pro?a?s組、pro?a?s+?opt組的小鼠nac區(qū)置入光纖并轉(zhuǎn)染表達(dá)好載體，分別給予脂肪乳、丙泊酚、丙泊酚，然后立即進(jìn)行l(wèi)orr評(píng)分；

53、s62：在麻醉平穩(wěn)后自然覺醒前，即蘇醒期開始時(shí)，三個(gè)組分別給予無光照、無光照、473?nm藍(lán)光刺激，藍(lán)光參數(shù)為：5ms，20hz，16?s。

54、優(yōu)選地：所述s7步驟中，每次進(jìn)行cpp操作前，提前1?h把小鼠連同飼養(yǎng)籠放置于cpp測(cè)試間，并在行為學(xué)進(jìn)行時(shí)，保證打開飼養(yǎng)籠蓋連同把小鼠置于cpp箱內(nèi)的時(shí)間少于60s，每次實(shí)驗(yàn)操作時(shí)都蓋好頂部的通氣孔隔聲板，每只小鼠適應(yīng)或測(cè)試完畢后，用抹布蘸水清潔箱內(nèi)底部和側(cè)壁并更換觸覺墊板下的墊紙；

55、其具體包括以下步驟：

56、s71：第1?d進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練：將小鼠放入開啟隔板的兩箱體中間，任其自由探索15min即900?s，記錄其分別在左右兩側(cè)箱體中的停留時(shí)間，作為基礎(chǔ)偏愛值，剔除在一側(cè)箱體停留時(shí)間＞65%總時(shí)間即＞585?s或＜35%總時(shí)間即＜315?s的動(dòng)物；

57、s72：第2?d至第9?d進(jìn)行條件性訓(xùn)練：第2?d下午、第4?d上午、第6?d下午、第8?d上午給小鼠注射生理鹽水，放入任意一側(cè)箱體，進(jìn)行非條件關(guān)聯(lián)；第3?d上午、第5?d下午、第7d上午、第9?d下午給小鼠注射丙泊酚，即刻進(jìn)行l(wèi)orr評(píng)分，麻醉平穩(wěn)或10?min后進(jìn)行干預(yù)，將小鼠放入另一側(cè)伴藥箱，使小鼠覺醒過程在伴藥箱中進(jìn)行，進(jìn)行條件關(guān)聯(lián)；直至翻正反射恢復(fù)后，繼續(xù)在伴藥箱中停留30?min；

58、s73：第10?d進(jìn)行cpp測(cè)試：將小鼠再次放入開啟隔板的兩箱體中間，任其探索整個(gè)箱體60?min，比較各組動(dòng)物對(duì)條件關(guān)聯(lián)伴藥箱的偏愛程度。

59、優(yōu)選地：所述s8步驟中，其包括以下步驟：

60、s81：veh?che?c組、pro?c?l組、pro?c?l+?che組小鼠完成cpp條件性訓(xùn)練期，每次進(jìn)入伴藥箱前分別給予脂肪乳、丙泊酚、丙泊酚后，即刻進(jìn)行l(wèi)orr評(píng)分；

61、s82：麻醉平穩(wěn)后將小鼠放入cpp伴藥箱，使小鼠覺醒過程在伴藥箱中進(jìn)行，直至翻正反射恢復(fù)后，繼續(xù)在伴藥箱中停留30?min；

62、s83：cpp測(cè)試，測(cè)試前30?min?，分別給予三組小鼠生理鹽水、生理鹽水、cno，分析化學(xué)遺傳學(xué)抑制nac?d1r神經(jīng)元對(duì)丙泊酚麻醉覺醒后精神獎(jiǎng)賞副作用的改變。

63、優(yōu)選地：所述s9步驟，其包括以下步驟：

64、s91：nac區(qū)已置入光纖的veh?opt?c組、pro?c?s組、pro?c?s+?opt組小鼠，在cpp條件性訓(xùn)練期，每次各組分別給予脂肪乳、丙泊酚、丙泊酚后，即刻進(jìn)行l(wèi)orr評(píng)分；

65、s92：麻醉平穩(wěn)后，將小鼠放入cpp伴藥箱，小鼠覺醒過程在伴藥箱中進(jìn)行，至翻正反射恢復(fù)后，繼續(xù)在伴藥箱中停留30?min；

66、s93：cpp測(cè)試，測(cè)試時(shí)這三個(gè)組先分別進(jìn)行無光照、無光照、589?nm黃光刺激，黃光參數(shù)為：5ms，20hz，10?s開/30?s關(guān)，持續(xù)30?min；

67、s94：確定在丙泊酚麻醉過程中光遺傳學(xué)抑制nac?d1r神經(jīng)元引起覺醒后精神獎(jiǎng)賞副作用的變化。

68、本發(fā)明的有益效果為：

69、1.本發(fā)明為優(yōu)化臨床麻醉提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在麻醉過程平穩(wěn)后適量抑制nac?d1r神經(jīng)元，不僅能使麻醉過程更加平穩(wěn)，而且在手術(shù)過程將臨近結(jié)束、需要減輕麻醉狀態(tài)并促進(jìn)患者覺醒時(shí)，適當(dāng)短時(shí)興奮此類神經(jīng)元，也能促進(jìn)患者的覺醒；因而，通過雙向調(diào)控伏隔核多巴胺1受體神經(jīng)元調(diào)節(jié)丙泊酚麻醉覺醒和精神獎(jiǎng)賞副作用，可能可以優(yōu)化丙泊酚麻醉管理過程，達(dá)到既能在需要時(shí)促進(jìn)覺醒，同時(shí)也能減少覺醒后的精神獎(jiǎng)賞副作用，有利于麻醉后機(jī)體機(jī)能的快速恢復(fù)。