本申請(qǐng)屬于生物，尤其是涉及一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗及卵黃抗體的制備方法。

背景技術(shù)：

1、鴨疫里默氏桿菌是黃桿菌科里默氏菌屬的一種無(wú)鞭毛、無(wú)芽孢、可形成莢膜的革蘭氏陰性桿狀菌，屬兼性厭氧菌，可在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。鴨疫里默氏桿菌感染櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨等多個(gè)品種鴨，1-5周齡鴨最易感。患病鴨的臨床癥狀首先表現(xiàn)為精神沉郁、采食量減少、流眼淚、打噴嚏、排綠色稀糞，隨后出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)和頭頸震顫等，后期神經(jīng)癥狀的鴨數(shù)量明顯增多?；疾▲喥蕶z后主要表現(xiàn)為臟器的漿膜面有纖維素性滲出，以心臟和肝臟最為明顯。發(fā)病率和死亡率為5-75?%不等，耐過(guò)感染的幸存鴨生長(zhǎng)遲緩，體重明顯小于正常鴨，部分鴨有腦炎后遺癥，成為“僵鴨”或“殘鴨”。鴨疫里默氏桿菌流行范圍廣，感染率和死亡率高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，是危害鴨養(yǎng)殖最常見(jiàn)的疾病之一。

2、由于鴨疫里默氏桿菌耐藥性嚴(yán)重，臨床上用抗生素治療失敗案例逐年增多。同時(shí)，抗生素治療鴨疫里默氏桿菌會(huì)引起食品安全、環(huán)境污染等一系列問(wèn)題。因此，如何開(kāi)發(fā)更有效的減抗、替抗產(chǎn)品用于鴨疫里默氏桿菌的防控是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。卵黃抗體是從蛋雞免疫后生產(chǎn)的高免蛋中提取的一類特異性igy抗體，常用于臨床病毒病、細(xì)菌病的防控，具有價(jià)格便宜、綠色環(huán)保、特異性強(qiáng)、起效迅速等特點(diǎn)。鴨疫里默氏桿菌是革蘭氏陰性菌，菌體含有大量的細(xì)菌內(nèi)毒素，直接做成全菌體滅活疫苗多針免疫蛋雞，極易造成蛋雞的輸卵管受損、產(chǎn)蛋下降，造成鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體開(kāi)發(fā)滯后。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本申請(qǐng)實(shí)施的目的在于提供一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗及卵黃抗體的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的全菌體滅活疫苗副反應(yīng)過(guò)大，效果不佳，持續(xù)時(shí)間短的技術(shù)問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用的技術(shù)方案是：提供一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法，包括以下步驟：

3、（一）、將莢膜多糖溶液和重組pvax1-ompa質(zhì)粒按比例混合，滅活后制得半成品；

4、（二）、將注射用白油、硬脂酸鋁混合，加熱后加入司本80，升溫混合，制得油相；將吐溫80和所述半成品混合，制得水相；將所述油相和水相混合進(jìn)行乳化，制得鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗。

5、在其中一實(shí)施例中，

6、莢膜多糖溶液的制備方法為：將鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，制得發(fā)酵液，將所述發(fā)酵液離心取上清，加入十六烷基三甲基溴化銨溶液后離心棄上清，沉淀用氯化鈉溶液重懸，加入乙醇后離心棄上清，溶解沉淀，得到莢膜多糖溶液。

7、在其中一實(shí)施例中，

8、加入所述十六烷基三甲基溴化銨溶液后的鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵液終濃度為5mm；所述氯化鈉溶液的濃度為0.4?m，所述乙醇的濃度為95?%；所述沉淀用生理鹽水溶解；所述滅活用甲醛溶液。

9、在其中一實(shí)施例中，

10、重組pvax1-ompa質(zhì)粒的制備方法為：

11、（一）、重組pvax1-ompa質(zhì)粒的載體構(gòu)建：全基因合成鴨疫里默氏桿菌的外膜蛋白o(hù)mpa基因，將所述外膜蛋白o(hù)mpa基因與真核表達(dá)載體pvax1通過(guò)酶切連接構(gòu)建重組pvax1-ompa質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α；

12、（二）、重組pvax1-ompa質(zhì)粒大量制備：將所述大腸桿菌dh5α發(fā)酵培養(yǎng)后，離心收集菌體，依次加入鹽酸緩沖液、氫氧化鈉溶液和醋酸溶液，后處理得到純化重組pvax1-ompa質(zhì)粒溶液；去除所述純化重組pvax1-ompa質(zhì)粒溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素，得到大量制備的重組pvax1-ompa質(zhì)粒。

13、在其中一實(shí)施例中，

14、步驟（二）中，所述菌體與鹽酸緩沖液的比例為1?g?:?5?ml，所述鹽酸緩沖液、氫氧化鈉溶液和醋酸溶液的體積比為1?:?2?:?1.5。

15、在其中一實(shí)施例中，

16、鹽酸緩沖液的配方為25?mm?tris-hcl、10?mm?edta、50?mm葡萄糖；所述氫氧化鈉溶液的配方為250?mm?naoh、1%?sds；所述醋酸溶液的配方為3?m醋酸鉀、5?m醋酸。

17、在其中一實(shí)施例中，

18、莢膜多糖溶液中莢膜多糖的終濃度為0.1-0.6?mg/ml，重組pvax1-ompa質(zhì)粒的終濃度為10-100?μg/ml，優(yōu)選的，莢膜多糖的終濃度為0.3?mg/ml，重組pvax1-ompa質(zhì)粒的終濃度為50?μg/ml。

19、在其中一實(shí)施例中，

20、按重量份計(jì)，注射用白油為94份、硬脂酸鋁為2份、司本80為6份，吐溫80為4份、半成品為96份，油相為2份、水相為1份。

21、本申請(qǐng)還提供了一種鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體的制備方法，具體包括以下步驟：采用上述任一實(shí)施例的鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法制得的復(fù)合疫苗對(duì)蛋雞進(jìn)行疫苗免疫，免疫后收集雞蛋，得到高免蛋，對(duì)高免蛋進(jìn)行卵黃分離、辛酸萃取、滅活、過(guò)濾除菌、分裝，制得鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體。

22、在其中一實(shí)施例中，

23、疫苗免疫的次數(shù)為三次，每次間隔為14日，疫苗的注射量為0.5?ml/只。

24、本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗及卵黃抗體的制備方法，復(fù)合疫苗免疫蛋雞后，三免后7日可達(dá)到收蛋要求，其在卵黃抗體產(chǎn)生時(shí)間、抗體產(chǎn)生高度及抗體持續(xù)期方面，均顯著優(yōu)于全菌體滅活疫苗；且三免后2個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)，卵黃抗體效價(jià)仍符合要求，卵黃抗體對(duì)鴨疫里默氏桿菌感染的雛鴨具有良好的臨床保護(hù)效果，可用于鴨疫里默氏桿菌的預(yù)防與治療；本方法還可以降低鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體的制備成本，可減少蛋雞的免疫應(yīng)激，極具推廣與應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于，所述莢膜多糖溶液的制備方法為：將鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，制得發(fā)酵液，將所述發(fā)酵液離心取上清，加入十六烷基三甲基溴化銨溶液后離心棄上清，沉淀用氯化鈉溶液重懸，加入乙醇后離心棄上清，溶解沉淀，得到莢膜多糖溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于，加入所述十六烷基三甲基溴化銨溶液后的鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵液終濃度為5mm；所述氯化鈉溶液的濃度為0.4?m，所述乙醇的濃度為95?%；所述沉淀用生理鹽水溶解；所述滅活用甲醛溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于，所述重組pvax1-ompa質(zhì)粒的制備方法為：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于，步驟（二）中，所述菌體與鹽酸緩沖液的比例為1?g?:?5?ml，所述鹽酸緩沖液、氫氧化鈉溶液和醋酸溶液的體積比為1?:?2?:?1.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于，所述鹽酸緩沖液的配方為25?mm?tris-hcl、10?mm?edta、50?mm葡萄糖；所述氫氧化鈉溶液的配方為250?mm?naoh、1%?sds；所述醋酸溶液的配方為3?m醋酸鉀、5?m醋酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于，所述莢膜多糖溶液中莢膜多糖的終濃度為0.1-0.6?mg/ml，重組pvax1-ompa質(zhì)粒的終濃度為10-100?μg/ml。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于，按重量份計(jì)，注射用白油為94份、硬脂酸鋁為2份、司本80為6份，吐溫80為4份、半成品為96份，油相為2份、水相為1份。

9.一種鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：采用權(quán)利要求1-8任一所述的鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗的制備方法制得的復(fù)合疫苗對(duì)蛋雞進(jìn)行疫苗免疫，免疫后收集雞蛋，得到高免蛋，對(duì)所述高免蛋進(jìn)行提取，制得鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體的制備方法，其特征在于，所述疫苗免疫的次數(shù)為三次，每次間隔為14日，疫苗的注射量為0.5?ml/只。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)公開(kāi)了一種鴨疫里默氏桿菌復(fù)合疫苗及卵黃抗體的制備方法，其屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，將鴨疫里默氏桿菌莢膜多糖與重組PVAX1?OmpA質(zhì)?；旌现苽澍喴呃锬蠗U菌復(fù)合疫苗；復(fù)合疫苗免疫蛋雞后，三免后7日可達(dá)到收蛋要求，其在卵黃抗體產(chǎn)生時(shí)間、抗體產(chǎn)生高度及抗體持續(xù)期方面，均顯著優(yōu)于全菌體滅活疫苗；且三免后2個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)，卵黃抗體效價(jià)仍符合要求，卵黃抗體對(duì)鴨疫里默氏桿菌感染的雛鴨具有良好的臨床保護(hù)效果，可用于鴨疫里默氏桿菌的預(yù)防與治療；本方法還可以降低鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體的制備成本，可減少蛋雞的免疫應(yīng)激，極具推廣與應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：魯愛(ài)玲,曹陽(yáng),辛瑞祥,王輝,王宏華,張勇,王義敏,趙光勛,孫偉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：濰坊華卓生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/22