腫瘤酶激活的量子點探針及其制備方法與用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種腫瘤診斷檢測前體探針及其制備方法與用途，且更具體而言，涉 及一種腫瘤酶激活的量子點探針及其制備方法與用途。本發(fā)明的腫瘤酶激活的量子點探針 是一種可有效診斷檢測腫瘤的探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤作為全球較大的公共衛(wèi)生問題之一，嚴(yán)重危害著人類的健康。據(jù)報道，在我 國，癌癥的發(fā)病率逐年升高,死亡率高達(dá)87%，已成為中國城市和農(nóng)村居民的第一位死因。相 比之下，早期癌癥患者的治療康健程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于晚期患者。如果可以對腫瘤進(jìn)行早期診斷 檢測并明確定位治療，最終將大大提高腫瘤患者的生存率，因此早發(fā)現(xiàn)早治療成為治療癌 癥的有效方式，鑒于此，研究開發(fā)有效的腫瘤診斷檢測探針迫在眉睫。
[0003] 近年來，具有獨特?zé)晒馓匦缘牧孔狱c在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因 組學(xué)、生物分子相互作用等研究領(lǐng)域中已得到廣泛應(yīng)用，尤其是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，量子點 可以作為一種標(biāo)記物應(yīng)用于腫瘤研究，前景十分廣闊。量子點（Quantum Dots，QDs)又稱為 半導(dǎo)體納米晶（Nanocrystals，NCs)或半導(dǎo)體納米粒子（Nanoparticles，NPs)，是一種主要 由II -VI族或III - V族和IV族元素組成，其半徑小于或接近于激子玻爾半徑的半導(dǎo)體納米 晶粒。
[0004] 量子點的發(fā)射波長可以通過控制其粒徑的大小進(jìn)行調(diào)控，其激發(fā)光譜寬而且連續(xù) 分布，而發(fā)射光譜窄。傳統(tǒng)的有機染料則是激發(fā)光譜窄而發(fā)射光譜寬?；诹孔狱c的這種 光學(xué)特性，我們可以在連續(xù)的激發(fā)光譜中選取適宜的激發(fā)波長降低背景熒光對檢測信號的 干擾。量子點的斯托克斯位移較大，能夠有效避免發(fā)射譜與激發(fā)譜的重疊，提高檢測的靈敏 度，相比之下有機熒光染料的斯托克斯位移小，通常會被組織自發(fā)熒光所淹沒。量子點作為 多電子體系，其發(fā)光強度是有機熒光染料的若干倍。在生物體內(nèi)有機熒光染料的發(fā)光強度 由于散射等原因而衰減，相比之下，量子點更適合作為生物體內(nèi)的熒光探針。有機熒光染 料的熒光信號會隨著照射時間延長很快發(fā)生褪色，而量子點則可以持續(xù)相對較長時間不褪 色，其熒光壽命和耐光漂白的穩(wěn)定性均為有機熒光染料的百倍之上，這一特征對于標(biāo)記生 物體內(nèi)目標(biāo)的研究是十分重要的。
[0005] 量子點在生物體內(nèi)表現(xiàn)出來的各種優(yōu)良特性使其成為一種極具潛力的熒光探針， 可以對腫瘤組織進(jìn)行準(zhǔn)確的定位標(biāo)記。量子點在生物體內(nèi)對腫瘤的靶向成像有兩種方式： 被動靶向和主動靶向。被動靶向是指由于豐富的腫瘤新生血管，較寬的血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙 以及不完整的基底膜的存在，納米粒子因此從這些腫瘤新生血管中滲透進(jìn)腫瘤組織內(nèi)，而 腫瘤組織中又缺乏有效的淋巴引流系統(tǒng)，造成納米粒子通過腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng) 優(yōu)先聚集在體內(nèi)腫瘤部位，進(jìn)而實現(xiàn)被動靶向。主動靶向是指通過腫瘤微環(huán)境中相關(guān)配 體-受體或抗體-抗原等特異性結(jié)合的靶向作用性，最終實現(xiàn)主動靶向，目前量子點對腫瘤 主動靶向成像主要有肽段耦聯(lián)制成的量子點探針和抗體耦聯(lián)制成的量子點探針。
[0006] 綜合腫瘤微環(huán)境中生成因子特異性表達(dá)、腫瘤血管的生成特點以及腫瘤部位低 氧、低pH等特點，Akerman等將可特異性標(biāo)記肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤組織血管淋巴管和腫瘤 細(xì)胞的三種不同肽段分別添加到CdTe/ZnS量子點表面，尾靜脈注射后成功實現(xiàn)了對腫瘤 組織的標(biāo)記。Steven等將PEG修飾后的量子點注入種植C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的大鼠體內(nèi)， 于24h后切片觀察含量子點的巨噬細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞聚集在神經(jīng)膠質(zhì)瘤，同時部分量子 點被巨噬細(xì)胞帶到了肝、腎及淋巴組織中。利用整合素 integrin α V β 3可與精氨酸-甘氨 酸-天冬氨酸短肽（RGD)特異性結(jié)合的原理，Cai等將連有RGD肽段的量子點應(yīng)用于腫瘤新 生血管成像，注射后隨時間推進(jìn)熒光信號逐漸增強，切片結(jié)果顯示量子點熒光主要分布于 腫瘤組織新生血管上。
[0007] 隨著分子生物學(xué)以及分子遺傳學(xué)等交叉學(xué)科的迅速發(fā)展，目前有關(guān)腫瘤的研究已 經(jīng)深入到分子和基因水平。研究者們已經(jīng)認(rèn)識到腫瘤的進(jìn)展是一個多因素參與、多步驟漸 進(jìn)的過程。而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，特異性分子標(biāo)志物是區(qū)別于其他組織部位的明顯存在， 因此能夠?qū)⒛[瘤酶應(yīng)用于腫瘤篩查中已成為當(dāng)前研究熱點。相關(guān)研究證實，腫瘤酶，包括 ΜΜΡ-2及l(fā)egumain，在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢 癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、淋巴癌、黑色素瘤。其在腫瘤中通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)腫瘤部 位新生血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞間的粘附性能等機制，促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲或轉(zhuǎn)移。因此，腫 瘤酶的活性增強及表達(dá)量增多在多種惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后中起到了至關(guān)重要的作 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，發(fā)明人致力于研究通過對量子點采用修飾技術(shù)從 而得到的一種腫瘤酶激活的量子點探針在腫瘤診斷檢測中的應(yīng)用，此量子點探針兼?zhèn)湓谡?常組織中的隱形性與在腫瘤部位的腫瘤酶敏感性的雙重性能。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，量子點經(jīng)巰 基化線性分子修飾后，生理條件下比較穩(wěn)定，并可大大降低量子點的毒性，增加作用位點。 同時功能肽的應(yīng)用可實現(xiàn)穿膜和腫瘤靶向的雙重作用，淬滅劑的引入使此前體探針在正常 組織中處于熒光淬滅狀態(tài)，而在腫瘤部位熒光恢復(fù)，降低量子點在其他組織器官中聚集造 成的影響，最終實現(xiàn)腫瘤診斷檢測功能。本申請的腫瘤酶激活的量子點探針不僅實現(xiàn)了特 異性診斷檢測腫瘤功能，而且兼?zhèn)湔＝M織中隱形性與腫瘤部位中酶敏感性的雙重性能， 為提高腫瘤的準(zhǔn)確診斷檢測找到了新方向。
[0009] 本發(fā)明的一個目的是提供一種腫瘤酶激活的量子點探針。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備所述腫瘤酶激活的量子點探針的方法。
[0011] 本發(fā)明的再一個目的是提供所述腫瘤酶激活的量子點探針在制備腫瘤診斷檢測 試劑中的用途。
[0012] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種功能肽。所述功能肽可以作為上述腫瘤酶激活 的量子點探針的一部分，腫瘤酶激活量子點探針的過程即通過腫瘤酶與功能肽相互作用完 成。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種腫瘤酶激活的量子點探針，所述腫瘤酶激活 的量子點探針為經(jīng)修飾含有功能肽的量子點探針，其中，所述功能肽的一端連接有淬滅劑， 以及所述腫瘤酶能夠特異性識別并切斷所述功能肽以使量子點發(fā)光。
[0014] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述功能肽的長度為19-33個氨基酸。
[0015] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，在所述功能肽N端氨基酸的氨基處引入N-羥基琥珀酰亞胺 酯活化的淬滅劑，包括BHQ-3羧酸，琥拍酰亞胺酯（BHQ-3Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester)，及 QSY-21 羧酸，玻拍醜亞胺酯（QSY21Carboxylic Acid，Succinimidyl Ester)。
[0016] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述功能肽包含腫瘤酶底物肽和穿膜肽，二者共同實現(xiàn)靶向和 穿膜的雙重作用。其中，所述腫瘤酶底物肽含有特異性腫瘤酶酶切位點，在腫瘤部位的腫瘤 酶的作用下可被特異性識別并切斷。其中，所述穿膜肽可以在腫瘤酶激活的量子點探針體 系中發(fā)揮雙重作用：①作為穿膜肽，幫助探針進(jìn)入細(xì)胞；②作為陽離子肽，與帶負(fù)電的修飾 后量子點自組裝形成探針。因此，本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述腫瘤酶激活的量子點探針可以是 通過使經(jīng)修飾后帶負(fù)電的量子點與帶正電的連接有淬滅劑的功能肽自組裝連接而成。本發(fā) 明中，優(yōu)選地，所述淬滅劑是偶聯(lián)在所述腫瘤酶底物肽上。本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述腫瘤酶底 物肽位于所述功能肽的N端，所述穿膜肽位于所述功能肽在C端。
[0017] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述功能肽的長度為19-33個氨基酸。
[0018] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述腫瘤酶可以是天冬酰氨內(nèi)肽酶Iegumain或基質(zhì)金屬蛋白 酶-2(matrix metalloproteinases-2, MMP-2)〇
[0019] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，例如，所述腫瘤酶底物肽的氨基酸序列可為Iegumain酶切特 異性序列PTN，或者M(jìn)MP-2酶切特異性序列PLGVR或PLGLAG，或者為含有上述序列的氨基酸 序列。
[0020] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述穿膜肽的氨基酸序列可為富含精氨酸或賴氨酸的氨基酸 序列，序列長度為3-20個氨基酸，優(yōu)選為8-16個。
[0021] 本發(fā)明中，更優(yōu)選地，所述穿膜肽氨基酸序列為VSRRRRRRGGRRRR。
[0022] 本發(fā)明中，更優(yōu)選地，可在所述功能肽的氨基末端引入含有ε -氨基的氨基酸，例 如，賴氨酸。本發(fā)明中，更優(yōu)選地，可在含有ε-氨基的氨基酸與腫瘤酶底物肽之間和/或 在腫瘤酶底物肽與穿膜肽之間設(shè)置保護(hù)所述特異性腫瘤酶酶切位點的氨基酸。更優(yōu)選地， 所述保護(hù)所述特異性腫瘤酶酶切位點的氨基酸的數(shù)量可為1-6個。
[0023] 本發(fā)明中，最優(yōu)選地，就腫瘤酶激活的量子點探針而言，當(dāng)所述腫瘤酶是 Iegumain時，所述功能肽的序列為KPTNGGGVSRRRRRRGGRRRR (SEQ ID NO: 1);當(dāng)所述腫 瘤酶是MMP-2時，所述功能肽的序列為KGGPLGVRGGVSRRRRRRGGRRRR (SEQ ID NO: 2 )或 KGGPLGLAGGGVSRRRRRRGGRRRR (SEQ ID N0:3)〇
[0024] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述腫瘤酶激活的量子點探針中，所述量子點可以是碲化鎘 (CdTe)量子點。
[0025] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述腫瘤酶激活的量子點探針中，所述量子點可以是通過水相 方法合成的。
[0026] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，在所述腫瘤酶激活的量子點探針中，所述量子點可以是經(jīng)巰基 化線性大分子修飾的，例如，經(jīng)巰基化低分子量肝素修飾的。更優(yōu)選地，所述低分子量肝素 的分子量可為3500-5500。
[0027] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述腫瘤酶激活的量子點探針的發(fā)射波長為600nm以上，更優(yōu) 選為 600nm-900nm。
[0028] 本發(fā)明中，所述腫瘤酶激活的量子點探針在正常組織中處于熒光淬滅狀態(tài)，而在 腫瘤部位熒光恢復(fù)，即此量子點探針兼?zhèn)湓谡＝M織中的隱形性能與在腫瘤部位的腫瘤酶 敏感性的雙重性能，最終實現(xiàn)腫瘤診斷檢測功能。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種制備所述腫瘤酶激活的量子點探針的方 法，包括以下步驟：
[0030] (1)巰基丙酸穩(wěn)定量子點的制備。例如，可以參考文獻(xiàn)：Zou，L，Gu，Z. Y. , Zhang, N. , et al. (2008)Ultrafast synthesis of highly luminescent gree