一種抗肝纖維化基因藥物rAAV8-KAL的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及分子藥物學(xué)，具體地說涉及重組腺相關(guān)病毒載體攜帶Kallistatin基因在抗肝纖維化中的的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
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[0002]肝纖維化是各類慢性肝病進一步發(fā)展、惡化的重要環(huán)節(jié)，若能在肝纖維化階段消除致病因素并給予適當(dāng)治療，對于我國這一肝病大國意義十分重大。肝臟在纖維化過程中，普遍存在缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激、門脈高壓和血管增生等癥狀，因此，有效的抗纖維化藥物應(yīng)將針對多靶點、多途徑作為其主要研宄方向。目前此類藥物大多為重組蛋白，需反復(fù)給藥，麻煩不便。臨床醫(yī)學(xué)研宄表明，持續(xù)穩(wěn)定劑量給藥比間斷性峰值給藥更為有效、副作用更低，而新興的基因藥物治療技術(shù)恰能實現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的給藥途徑。
[0003]Kallistatin是一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，具有抗炎癥、抗氧化、舒張血管、抗血管生成、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能，對肝纖維化進程涉及到的各種癥狀起到一對一的抑制作用；重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)以其高穩(wěn)定性，低致病性、低免疫原性、宿主范圍廣、分裂或非分裂細胞都能感染，以及持久表達目的基因等多方面優(yōu)勢，被認為是最有希望的臨床基因藥物治療載體，尤其是在纖維化的肝臟中，粒徑僅為20nm的rAAV能更加有效穿越肝竇內(nèi)皮層進而轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或肝星狀細胞，是一種比較理想的肝纖維化基因藥物治療載體，在AAV的眾多血清型中，8型AAV載體是目前對肝靶向性最好的一種rAAV載體，可以將Kallistatin以持續(xù)穩(wěn)定劑量運輸?shù)礁闻K中。
[0004]本實驗室將rAAV8_kal I i statin基因藥物，經(jīng)尾靜脈注射到四氯化碳CC14誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠體內(nèi)，并觀察32天，發(fā)現(xiàn)rAAV8-Kal不僅對肝纖維化有顯著療效，且能在整個觀察期內(nèi)維持穩(wěn)定水平表達。本實驗涉及的rAAV8-kallistatin基因藥物能夠有效治療肝纖維化的研宄成果，迄今尚未見有國內(nèi)外的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療肝纖維化的基因藥物，以解決現(xiàn)有治療肝纖維化藥物靶點單一、需長期反復(fù)給藥等問題。
[0006]本發(fā)明的基因治療藥物，由8型rAAV介導(dǎo)Kallistatin基因的表達，其具體特征是:病毒載體為8型rAAV;抗纖維化治療基因為Kallistatin;基因表達框依次含有 CMV/CAG 雞 β-actin 啟動子、Kallistatin 基因、WPRE(Woodchuck hepatitisPost-transcript1nal Regulatory Element)增強子、polyA 尾巴，基因表達框兩端為AAV2ITR(inverted terminal repeat sequence)。
[0007]不同血清型的AAV序列雖具有較高同源性，但每個AAV型都具有不同的衣殼，而衣殼則是決定AAV趨性和轉(zhuǎn)導(dǎo)特點的主要因素。本發(fā)明以rAAV2質(zhì)粒為基因表達質(zhì)粒，分別采用rAAV2、8輔助質(zhì)粒進行包裝，得到兩種血清型的rAAV病毒。通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，rAAV2/8在肝纖維化治療中效果更佳。
[0008]本發(fā)明所述基因藥物采用三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法制備，即采用磷酸鈣法將表達質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293細胞，并于60-72小時后收獲重組病毒，經(jīng)層析純化后備用。
[0009]本發(fā)明提供了 rAAV8-KAL在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供了以rAAV8-KAL為有效成分與藥學(xué)上可接受的一種或多種載體組成的藥物組合物。
[0011]本發(fā)明還提供了所述組合物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的基因藥物優(yōu)先選用靜脈注射的給藥方式。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:提供了一種針對多靶點通過多途徑的肝纖維化基因治療藥物，所述基因藥物不僅能夠有效治療肝纖維化，且無需重復(fù)給藥，能在體內(nèi)長時間維持穩(wěn)定表達水平。
【附圖說明】
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[0014]下面參照附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。
[0015]圖1-各組小鼠肝臟外觀
[0016]其中:a為正常組；b為造模剛完成；c為模型組；d為rAAV2_Kal治療組；e為rAAV8-Kal 治療組。
[0017]圖2-各組小鼠肝臟HE染色(X 100)
[0018]圖3-各組小鼠肝臟苦味酸天狼猩紅染色(X 100)
[0019]圖4-各組小鼠肝功能指標(biāo)(ALT、AST、TBIL)檢測結(jié)果
[0020]其中:N為正常組；M為模型組；2K為rAAV2-Kal治療組；8K為rAAV8_Kal治療組(VSM 組:*ρ〈0.05，**ρ〈0.01)。
[0021]圖5-各組小鼠血清中HA、LN、C-1I1、C-1V水平檢測結(jié)果
[0022]圖6-各組小鼠肝組織氧化指標(biāo)(MDA、S0D)檢測結(jié)果
[0023]圖7-各組小鼠肝組織羥脯氨酸含量(Hyp)檢測結(jié)果
[0024]圖8-各組小鼠血清中kallistatin表達的經(jīng)時關(guān)系
[0025]圖9-各組小鼠肝組織中kallistatin含量
【具體實施方式】
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[0026]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不以此限制本發(fā)明。
[0027]《實施例1》rAAV8_kallistatin基因藥物的制備
[0028]Kallistatin 質(zhì)粒表達框組成依次為:CMV/CAG 雞 β-actin 啟動子、KallistatincDNA、WPRE增強子、polyA尾巴，基因表達框兩端為AAV2ITR。采用磷酸鈣無輔助病毒質(zhì)粒法制備重組病毒:將Kallistatin表達質(zhì)粒，腺病毒輔助質(zhì)粒與rAAV8輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞，60-72小時后收獲細胞，用去氧膽酸鈉(0.5% )和benzonase (30u/ml)裂解，離心(3000g 30min)去細胞碎片，氯化銫密度梯度離心，即得重組病毒rAAV8_KalIistatin，并用色譜層析法純化。
[0029]《實施例2》小鼠肝纖維化模型的構(gòu)建
[0030]小鼠以lmL/100g體重腹腔注射四氯化碳CC14，前三次為15%，中間十次為25%，后三次為30%，隔兩天一次，共16次，46天造模完成，得到肝纖維化小鼠模型。
[0031]《實施例3》實驗組別及處理
[0032]雄性KM小鼠12只，體重約25g，實驗室飼養(yǎng)一周后，隨即分為4組，每組3只，所有小白鼠均用足量的鼠糧和水飼養(yǎng)。正常組:小鼠正常飼養(yǎng)，不做任何處理；模型組:小鼠按肝纖維化模型構(gòu)建方法建模，不給藥；ssrAAV2-Kal治療組；造模完成后通過尾靜脈注射ssrAAV2-Kal，1*1012VG/只，一次性給藥；ssrAAV8_Kal治療組:造模完成后通過尾靜脈注射ssrAAV8-Kal, 1*1012VG/ 只，一次性給藥。
[0033]《實施例4》小鼠血清樣品的制備及保存
[0034]在第零天，ssrAAV2、8_kallistatin給藥后的第一、三、五、七、十四、二十八、二十一■、五十八天，小鼠斷尾取血150 μ L左右，尚心得血清，于-80°C保存。
[0035]《實施例5》ssrAAV2、8_kallistatin抗纖維化作用研宄
[0036]治療期結(jié)束后，分別通過肝臟外觀、肝臟病理切片染色、肝功能指標(biāo)(ALT、AST、TBIL)、纖維化血清指標(biāo)(HA、LA、C II1、C IV )及肝組織指標(biāo)(SOD、MDA、Hyp)幾個方面，綜合評價ssrAAV2、8-Kal兩種基因藥物對小鼠肝纖維化的療效。
[0037]《實施例6》各實驗組小鼠肝臟外觀
[0038]正常組小鼠肝臟整體呈暗紅色，表面光滑且有明顯光澤，邊緣銳利整齊，質(zhì)地軟而有彈性；造模剛完成的小鼠肝臟明顯發(fā)黃，表面粗糙且布滿顆粒，邊緣鈍化，質(zhì)地較硬且沒有彈性，個別小鼠肝臟于隔膜和周圍器官粘連嚴重，整個肝臟趨向于肝硬化；一個月后的模型組小鼠肝臟仍發(fā)黃，表面有粗糙顆粒，邊緣也比較鈍，但不及剛造模完成時明顯；ssrAAV2-Kal治療組較模型組有所好轉(zhuǎn)，肝臟恢復(fù)些許紅潤顏色且變得有光澤，表面稍有粗糙顆粒，邊緣比較銳利，質(zhì)地也比模型組軟且有彈性；ssrAAV8-Kal治療組小鼠肝臟已恢復(fù)正常暗紅色，表面光滑有光澤，邊緣銳利整齊，質(zhì)地軟且有彈性，已十分接近正常組(圖1)。
[0039]《實施例7》各組小鼠肝臟HE染色
[0040]正常組小鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，形態(tài)正常，分布規(guī)律；造模剛完成的小鼠肝組織幾乎沒有一個完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，細胞排列混亂，肝細胞腫脹，體積變大，細胞空泡和壞死，伴隨有大片炎性細胞浸潤，體現(xiàn)出嚴重損傷性病理改變；一個月后的模型組小鼠稍有恢復(fù)