一種靶向傳遞小干擾rna的超分子組裝體及制備方法
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及靶向基因傳遞技術領域，特別是一種靶向傳遞小干擾RNA的超分子組裝體及制備方法。
【【背景技術】】
[0002]當今社會由于霧霾、環(huán)境污染、電離輻射、食品安全以及遺傳等因素的影響，癌癥的發(fā)病率正在逐年上升，嚴重威脅到了人類的健康。為此，手術治療、化學治療和放射治療作為臨床治療癌癥的主要手段得以廣泛應用。然而，這些療法由于治療效果不佳、易復發(fā)以及嚴重的毒副作用等使得癌癥至今無法被人類所攻克。因此，化學家、材料學家和生物醫(yī)學工作者開發(fā)了各種藥物傳遞體系如脂質體、無機納米粒子、囊泡以及碳納米材料等用以增強藥物傳遞體系的生物兼容性和靶向性，以期待增強治療效果并降低毒副作用。然而，這些療法都是治標不治本的，要想徹底根治癌癥，就要從癌癥發(fā)病的源頭出發(fā)對其加以遏制。近幾年出現(xiàn)的基因治療為攻克癌癥打開了一扇大門。其原理是將具有生物功能的核酸(如質粒和線性雙鏈DNA，或者小干擾RNA(siRNA)等)轉移或運送到癌細胞中，修復損傷的基因或者抑制細胞內(nèi)異?；虻谋磉_，繼而誘導不凋亡的癌細胞發(fā)生凋亡，從而達到治愈癌癥的目的。然而基因轉染的低效率成為了制約該方法廣泛應用的瓶頸。由于潛在的安全性問題以及昂貴的成本，病毒載體并沒有得到廣泛的發(fā)展，因此設計與構筑具有生物兼容性和可控釋放功能并且具備高的基因轉染效率的靶向基因傳遞體系成為了前沿的研宄熱點。此夕卜，非共價相互作用載體由于其優(yōu)良的緩釋效果、較強的鍵合能力以及較低的毒副作用等優(yōu)點，在新近出現(xiàn)的藥物/基因載體上廣為應用。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003]本發(fā)明的目的是針對上述技術分析和存在問題，提供一種靶向傳遞小干擾RNA的超分子組裝體及制備方法，該超分子組裝體能夠有效沉默癌細胞內(nèi)特定內(nèi)源和外源基因的表達，且其毒副作用很低，制備方法簡單且產(chǎn)率較高，適于放大合成和實際生產(chǎn)應用。
[0004]本發(fā)明的技術方案:
[0005]一種靶向傳遞小干擾RNA的超分子組裝體，為基于β -環(huán)糊精修飾透明質酸、金剛烷多胺化合物、葫蘆脲[6]以及小干擾RNA合成的四元超分子組裝體，其中環(huán)糊精修飾透明質酸分子式為(C14H21NO11)98(C58H95N3O44)17,平均一條高分子鏈上修飾17個環(huán)糊精單元，金剛烷多胺化合物化學分子式為C32H56Br4N6O4J*四元超分子組裝體以β -環(huán)糊精與金剛烷以及金剛烷多胺鏈與葫蘆脲[6]間強的非共價相互作用，和金剛烷多胺鏈與小干擾RNA間靜電相互作用為基礎，形成以親水的透明質酸為外殼的超分子納米粒子，納米粒子粒徑為30_40nm。
[0006]一種所述靶向傳遞小干擾RNA的超分子組裝體的制備方法，步驟如下:
[0007](I) β -環(huán)糊精修飾透明質酸的制備
[0008]將分子量為46000的透明質酸鈉溶于pH為7.2、濃度為lmmol/L的磷酸緩沖溶液中，再加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，攪拌反應30分鐘，得到反應液；將6-去氧-6-乙二胺-β -環(huán)糊精溶于pH為7.2的磷酸緩沖溶液中，6-去氧-6-乙二胺-β -環(huán)糊精與磷酸緩沖溶液的用量比為0.lmol/L,再加入到上述反應液中，在25 °C條件下攪拌24小時，然后裝入截留范圍為8000-14000的透析袋中連續(xù)透析5天，將所得溶液凍干，制得β -環(huán)糊精修飾透明質酸；
[0009](2)金剛烷多胺化合物的制備
[0010]I)將二疊氮甲基苯酚化合物(化合物I)、金剛烷溴甲基酮和無水碳酸鉀在丙酮中混合，加熱至56°C回流攪拌反應10-12h，然后過濾，將濾液旋干，加入體積比為1:1的三氯甲烷和水混合液進行萃取，有機相用無水氯化鎂干燥，減壓蒸餾除去溶劑得到粗品，然后以石油醚和乙酸乙酯混合液為展開劑，該混合液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為8:1，用200-300目硅膠柱進行分離，制得二疊氮甲基苯基金剛烷化合物(化合物2)的純品；
[0011]2)將二疊氮甲基苯基金剛烷化合物(化合物2)和三苯基膦溶于無水四氫呋喃中，在室溫條件下攪拌12小時，然后減壓蒸餾除去溶劑，將所得固體溶于乙酸乙酯中，加入濃度為36.5被％的鹽酸后得到白色沉淀，收集沉淀并用乙酸乙酯洗滌，得到二胺甲基苯基金剛烷化合物(化合物3)的純品；
[0012]3)將二胺甲基苯基金剛烷化合物(化合物3)、氯甲酸芐酯保護的五氟苯酚多胺化合物(化合物4)和三乙胺溶于二氯甲烷中，室溫下攪拌反應20小時，減壓蒸餾除去溶劑，加入體積比為1:1的二氯甲烷和水混合液進行萃取，有機相用無水硫酸鎂干燥，然后減壓蒸餾除去溶劑得到粗品，以乙酸乙酯和石油醚混合液為展開劑，該混合液中石油醚和乙酸乙酯的容積比依次為1:2變至4:1變至6:1最后為純乙酸乙酯，用200-300目硅膠柱進行分離，制得氯甲酸芐酯保護的金剛烷多胺化合物(化合物5)的純品；
[0013]4)將氯甲酸芐酯保護的金剛烷多胺化合物(化合物5)溶于氫溴酸與乙酸的混合溶液中，氫溴酸在與乙酸的混合溶液中的濃度為33wt%，室溫攪拌反應10小時，加入過量的乙醚產(chǎn)生白色沉淀，離心并用乙醚進行洗滌即可制得金剛烷多胺化合物的純品；
[0014](3)靶向傳遞小干擾RNA的超分子組裝體的制備
[0015]將β -環(huán)糊精修飾透明質酸、金剛烷多胺化合物和葫蘆脲[6]混合并溶于水中，進行超聲溶解，然后加入濃度為20 μ mo I/L的小干擾RNA的水溶液，用200 μ L移液槍反復吹打20次，制得靶向傳遞小干擾RNA的四元超分子組裝體。
[0016]所述步驟(I)中透明質酸鈉與磷酸緩沖溶液的用量比為0.073mmol/L，透明質酸鈉、1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基硫代琥珀酰亞胺和6-去氧-6-乙二胺-β -環(huán)糊精的摩爾比為0.0044:1.75:1.75:1ο
[0017]所述步驟⑵的I)中二疊氮甲基苯酚化合物(化合物I)與丙酮的用量比為0.026mol/L，二疊氮甲基苯酚化合物(化合物I)與金剛烷溴甲基酮和無水碳酸鉀的摩爾比是 1:0.74:3。
[0018]所述步驟⑵的2)中二疊氮甲基苯基金剛烷化合物(化合物2)與無水四氫呋喃的用量比為0.097mol/L，二疊氮甲基苯基金剛烷化合物(化合物2)與三苯基膦的摩爾比為1:3，無水四氫呋喃與濃度為36.5wt%的鹽酸的體積比為40:1。
[0019]所述步驟(2)的3)中二胺甲基苯基金剛烷化合物(化合物3)與二氯甲烷的用量比為0.015mol/L，二胺甲基苯基金剛烷化合物(化合物3)與氯甲酸芐酯保護的五氟苯酚多胺化合物(化合物4)和三乙胺的摩爾比為1:2.5:4。
[0020]所述步驟(2)的4)中氯甲酸芐酯保護的金剛烷多胺化合物(化合物5)與氫溴酸-乙酸的混合溶液的用量比為0.04mol/Lo
[0021]所述步驟(3)中β -環(huán)糊精修飾透明質酸與水的用量比為2.0X 10_4mol/L，β -環(huán)糊精修飾透明質酸、金剛烷多胺化合物和葫蘆脲[6]的摩爾比為1:17:34，β-環(huán)糊精修飾透明質酸/金剛烷多胺化合物/葫蘆脲[6]混合溶液與小干擾RNA水溶液的體積比為1:1。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點是:該靶向傳遞小干擾RNA的四元超分子組裝體，葫蘆脲[6]與多胺鏈的鍵合使得多胺鏈的氮原子PKa值發(fā)生改變，使得多胺鏈的電正性大大增強，能夠強烈地與帶負電的小干擾RNA進行鍵合，避免小干擾RNA由于水解和與RNA分解酶作用而分解失活；此外，該四元超分子組裝體的透明質酸外殼能夠與癌細胞表面過量表達的透明質酸受體進行特異性鍵合作用，然后四元超分子組裝體通過細胞的內(nèi)吞作用特異性地進入到癌細胞當中，再通過癌細胞內(nèi)過量表達的透明質酸酶的水解作用使得四元組裝體能夠得到有效降解從而使小干擾RNA得到釋放，大大提高了細胞的基因轉染效率，使得細胞內(nèi)內(nèi)源和外源性的特定基因得到有效沉默；該組裝體靶向性好，細胞毒副作用很低，轉染效率較高，制備方法較為方便，在未來癌癥的基因療法上具有較好的應用前景。
【【附圖說明】】
[0023]圖1為金剛烷多胺化合物的合成路線圖。
[0024]圖2為該四元超分子組裝體的構筑路線示意圖。
[0025]圖3為該四元超分子組裝體的透射電子顯微鏡圖。
[0026]圖4為該四元超分子組裝體與小干擾RNA鍵合的電泳圖。
[0027]圖5為