一種戊型肝炎病毒樣顆粒疫苗的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疏水性病毒衣殼蛋白的制備方法及其應(yīng)用，特別涉及一種戊型肝 炎病毒樣顆粒疫苗的制備方法及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV)是肝炎病毒科肝病毒屬成員之一，含一 正向單鏈RNA，基因組有3個(gè)重疊開放閱讀框架（ORFs)，包括01^1、01^2、01^3。病毒分為4 種基因型，基因 I型和基因 II型病毒主要從人體分離，基因 III型、基因 IV型病毒主要來(lái) 源于豬、雞、兔、犬等動(dòng)物，甚至有基因 V型病毒發(fā)現(xiàn)?；?I型病毒主要在中國(guó)以及東南亞 流行，HEV是急性肝炎的主要病原，引起中度、嚴(yán)重肝炎，嚴(yán)重程度隨年齡增加。
[0003] HEV在許多發(fā)展中國(guó)家流行，特別是南亞、東南亞、北非、中東地區(qū)，流行病學(xué)調(diào)查 全球有1/3人感染。HEV通過(guò)飲用污染水源的糞口途徑傳播。普通人感染的死亡率1-15%， 但對(duì)懷孕婦女引起致死急性感染，死亡率高達(dá)30%，感染存活的懷孕婦女發(fā)生高概率流產(chǎn)、 早產(chǎn)。對(duì)慢性肝炎病人，HEV二次感染導(dǎo)致嚴(yán)重后果。所以HEV是嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生的疾 病，快速的診斷和預(yù)防HEV是非常有必要的。
[0004] 人的戊型肝炎盡管在普通人群中發(fā)病率小于1%，但在發(fā)展中國(guó)家或衛(wèi)生條件不 好的地區(qū)，因?yàn)槲廴镜乃创笠?guī)模急性戊型肝炎經(jīng)常發(fā)生，發(fā)達(dá)國(guó)家也有食品污染散發(fā)流 行。截至目前，已經(jīng)鑒定和確定4個(gè)基因型HEV病毒，基因 I型、基因 II型病毒只在人群傳 播，而基因 III型、基因 IV型病毒在動(dòng)物之間傳播，甚至發(fā)現(xiàn)了在野豬和大鼠中流行基因 V 型、基因 VI型戊型肝炎病毒。所有已經(jīng)辨明的豬戊型肝炎病毒屬于基因 III型或基因 IV 型病毒，可跨種屬間的屏障傳播，其他動(dòng)物犬、兔的HEV也能感染豬。人的動(dòng)物源性戊型肝 炎病毒感染經(jīng)常多發(fā)生于消費(fèi)了污染的豬肝、豬肉、鹿肉或其他污染傳染性HEV的肉制品 或水。
[0005] 雞戊型肝炎病毒引起肝炎脾腫大綜合癥（hepatitis splenomegaly syndrome (HS syndrome))，引起30-72周的蛋雞卵巢萎縮，肝脾腫大、腹腔大量紅色積液。禽HEV的基因 組基因測(cè)序顯示禽HEV基因組結(jié)構(gòu)和哺乳動(dòng)物相似，核苷酸序列有50%的同源性，與人HEV 和豬HEV基因結(jié)構(gòu)和功能相似。禽HEV的衣殼蛋白和哺乳動(dòng)物有共同的抗原性和抗原表位。 美州的禽HEV、歐洲禽HEV、東南亞分離的禽HEV的核苷酸同源性達(dá)80 %，應(yīng)屬于肝炎病毒不 同的屬，其他人、豬、犬HEV為肝炎病毒科不同肝炎病毒屬。
[0006] 60周齡的SPF雞靜脈注射5X 104 5 50 %禽感染劑量，引起HS綜合癥，有淋巴 細(xì)胞lymphocytic periphlebitis和phlebitis為特征的肝損傷，約有25 %感染的雞 有subcapsular出血或肝右中葉肥大現(xiàn)象，衆(zhòng)肝酶乳糖脫氫酶輕微上升（the plasma liverenzyme lactate dehydrogenase)。禽HEV的致病性的發(fā)現(xiàn)給HEV致病和免疫的研宄 提供了小個(gè)體動(dòng)物模型，同時(shí)也為HEV疫苗的評(píng)估和研宄提供了平臺(tái)，特別是疫苗對(duì)HS綜 合癥的防控效果。
[0007] 一般地，健康雞感染HEV有抗體產(chǎn)生，顯示為亞臨床癥狀。從HS的雞和健康雞的 分離的病毒核苷酸的同源性為91%，其致病性不同，因此疫苗對(duì)不同HEV的毒株的保護(hù)性 不同，實(shí)例強(qiáng)調(diào)了對(duì)禽不同致病性的毒株的保護(hù)效果。
[0008] 禽戊型肝炎病毒在雞群中流行，引起肝炎型脾腫大綜合癥，在澳大利亞、西班牙、 美國(guó)、中國(guó)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)鑒別了至少3個(gè)基因型HEV，和人、豬源的HEV核苷酸同源性50-60%。 除此之外，大鼠、獴、鹿、兔、魚都發(fā)現(xiàn)有HEV，哺乳類HEV只有1個(gè)血清型。
[0009] 減毒或滅活的疫苗因?yàn)闊o(wú)適合的細(xì)胞系統(tǒng)未能開發(fā)，只有中國(guó)開發(fā)注冊(cè)了一大腸 桿菌表達(dá)的HEV病毒樣顆粒疫苗，但表達(dá)的病毒樣顆粒制造工藝復(fù)雜，表達(dá)的蛋白為包涵 體，需要復(fù)雜的變復(fù)性過(guò)程才能組裝成病毒樣顆粒。在HEV蛋白中，ORFl編碼非結(jié)構(gòu)蛋白， 在免疫中不形成中和抗體，0RF3編碼一種功能不清的非結(jié)構(gòu)蛋白，短期形成抗體，但無(wú)中和 作用。0RF2編碼72kD衣殼蛋白，有660個(gè)氨基酸組成，其中的組成片段具有免疫原性且在 各基因型戊型肝炎病毒高度保守。衣殼蛋白的抗體體外中和HEV，保護(hù)非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物猿猴 免受感染，且長(zhǎng)期保護(hù)。0RF2全長(zhǎng)衣殼蛋白（72kDa)不適宜作為疫苗抗原，因?yàn)槠溲谏w主 要免疫表位，有一定的疏水性性質(zhì)。截?cái)嗟囊職さ鞍?5kDa是一種較為穩(wěn)定、安全且具有免 疫原性的疫苗抗原。由于HEV缺乏有效的組織培養(yǎng)體系，對(duì)于HE滅活及減毒活疫苗的研制 造成了難度，目前HE疫苗研宄主要集中于HE基因工程疫苗的研制。0RF2含有重要的中和 抗原表位，目前已有0RF2許多片段在不同表達(dá)系統(tǒng)中成功地進(jìn)行了表達(dá)，如原核、昆蟲、酵 母、植物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)，且表達(dá)產(chǎn)物均具有一定的免疫原性。
[0010] HEV重組的衣殼蛋白在人、非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物、雞上可誘導(dǎo)HEV中和抗體，其中截?cái)?的衣殼蛋白，含HEV的免疫表位并形成病毒樣顆粒，增強(qiáng)疫苗免疫效果，并對(duì)異源HEV病毒 攻擊產(chǎn)生交叉保護(hù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 戊型肝炎病毒由于缺乏適宜的疫苗細(xì)胞基質(zhì)，用細(xì)胞培養(yǎng)的方法不能達(dá)到生物制 品用抗原或疫苗的要求，現(xiàn)多采用基因工程方法制備，一般采用真核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，如昆 蟲、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母。用真核系統(tǒng)表達(dá)、提取、純化的步驟多，收率低，儀器和廠房的成本 費(fèi)用昂貴且要求高。全長(zhǎng)衣殼蛋白（72kDa)不適宜作為HEV病毒樣顆粒疫苗抗原，因?yàn)槠?掩蓋主要免疫表位，有一定的疏水性性質(zhì)。截?cái)嗟囊職さ鞍?5kDa是一種較為穩(wěn)定、安全且 具有免疫原性的疫苗抗原。
[0012] 針對(duì)以上問題，本發(fā)明公開了一種制備戊型肝炎病毒樣顆粒疫苗的方法，其特征 在于，包括以下步驟：
[0013] (1)合成野生型戊型肝炎病毒全長(zhǎng)0RF2基因，基因合成后，插入克隆質(zhì)粒 pGEM-T ；
[0014] (2)合成戊型肝炎病毒截?cái)嗟腁0RF2基因
[0015] 使用大腸桿菌喜好的密碼子，設(shè)計(jì)編碼戊型肝炎病毒112-660位氨基酸的截?cái)嗟?Λ 0RF2基因，然后以野生型戊型肝炎病毒全長(zhǎng)0RF2基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)引物合成Λ 0RF2基 因，合成的A0RF2基因產(chǎn)物與同樣酶切的pMAL_p4x表達(dá)質(zhì)粒片段連接；
[0016] (3)戊型肝炎病毒截?cái)嗟腁0RF2基因在大腸桿菌中的表達(dá)
[0017] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序，得到pMAL_p4X MBP- Δ 0RF2重組質(zhì) 粒；重組質(zhì)粒pMAL-p4xMBP-A〇RF2接種LB培養(yǎng)基，按1 : 200~I : 1000(V/V)轉(zhuǎn)接到 含有18L LB培養(yǎng)基的20L的發(fā)酵罐中，以250rpm轉(zhuǎn)速37°C培養(yǎng)4~6h，菌液0D600達(dá)到 0· 6~0· 8時(shí)，按濃度0· 5~0· 7mmol/L加入IPTG誘導(dǎo)4h，4000rpm離心25min，獲得濕重 為110~120g/L的菌體培養(yǎng)物；
[0018] (4)戊型肝炎病毒截?cái)嗟囊職さ鞍爪?0RF2的提取和純化
[0019] a裂解劑篩選和細(xì)菌膜蛋白提取
[0020] 將步驟（3)得到的菌體培養(yǎng)物融化，重懸于層析緩沖液，用超聲儀在冰浴中破碎 細(xì)胞壁，超聲液75, 000g、4-8°C離心1小時(shí)分離上清和沉淀，沉淀用溶解液溶解，加入裂解 劑在4°C攪拌2h提取大腸桿菌膜蛋白，測(cè)定提取物的活性，以確定總蛋白和裂解劑的比例， 提取物以100, OOOg超速離心1小時(shí)，獲得可溶性上清，再用層析緩沖液稀釋至最終裂解物 的濃度為〇. 5-1. 0% (w/v)以便于后續(xù)純化；
[0021] 其中，所述的層析緩沖液含有20mM NaH2PO4, IOOmM NaCl，l μΜ蛋白酶抑制劑 E-64、0.3mM三羧甲基磷酸，pH 7.5,；
[0022] 所述的溶解液含有 20mM Tris-HCl，300mMNaCl，Im