用于治療用途的抗-bag3抗體的制作方法
【專利說明】用于治療用途的抗-BAG3抗體
[0001] 描述
[0002] 本發(fā)明涉及抗-BAG3抗體作為藥物，特別是用于在治療胰腺腫瘤或免疫、炎性、贅 生性（neoplastic)和/或退行性質的其他病理學中使用的藥物的用途。 現有技術
[0003] BAG3蛋白是74kDa胞質蛋白，其屬于共伴侶蛋白家族，所述共伴侶蛋白家族與蛋 白HSP70(熱休克蛋白）的ATP酶域通過稱為BAG域（氨基酸110-124)的結構域相互作 用。此外，BAG3蛋白包含Wff結構域（Trp-Trp)、富含脯氨酸區(qū)域（PXXP)、和兩個保守的基 序IPV(Ile-Pro-Val)，其可介導與其他蛋白的結合。由于BAG3蛋白作為適配體（adapter) 的性質，可歸因于許多功能域的存在，因此此類蛋白可與不同的蛋白相互作用。
[0004] 在人類中，bag3基因表達對于包括肌細胞的數種正常細胞而言是組成型的，然而 其突變與骨骼肌和心肌的疾病相關。此外，BAG3蛋白表達于許多類型的原發(fā)性腫瘤或腫瘤 細胞系（淋巴或骨髓性白血病、神經母細胞瘤、胰腺癌、甲狀腺癌、乳腺癌和前列腺癌、黑素 瘤、骨肉瘤、成膠質細胞瘤和腎腫瘤、結腸腫瘤、和卵巢腫瘤）。
[0005] 在正常的細胞類型，諸如白細胞、上皮細胞和神經膠質細胞和視網膜的細胞中， bag3基因表達可通過應激物，諸如氧化劑、高溫、缺乏血清、重金屬、HIV-I感染等來誘導。 這些發(fā)現表明，bag3基因表達調控是細胞應激反應中的重要組成部分，并與響應轉錄因子 HSFl (熱休克轉錄因子）的元件的存在相關，所述元件在bag3基因啟動子中以各種形式的 細胞應激被激活（Franceschelli S.，等人 J Cell Physiol 215(2008)575-577)。
[0006] 此外，由于許多蛋白-蛋白相互作用域在其結構中的存在，BAG3蛋白在不同類型 的細胞中與不同的分子伴侶相互作用，影響細胞存活。（A. Rosati等人Cell Death Dis. (2011)2:el41)。在骨肉瘤和黑色素瘤細胞中鑒定了報道的與BAG3抗細胞凋亡活性有關的 第一機制，其中觀察到BAG3蛋白調節(jié)轉錄因子NF-kB的活化和細胞存活（Ammirante M.等 人，Proc Natl Acad Sci USA 107(2010)7497-7502)。已在成膠質細胞瘤細胞中描述了不 同的分子機制，其中BAG3蛋白以積極的方式與HSP70蛋白合作，以維持細胞溶質中的BAX 蛋白并阻止其易位進入線粒體（Festa M.等人，AmJ Patholl78 (2011) 2504-25)。最后，已 示出了，BAG3在某些腫瘤中調控調節(jié)細胞粘附的蛋白。
[0007] 細胞質BAG3蛋白的存在已在許多不同的細胞系統中被描述，并且不但與各種腫 瘤關聯，而且與細胞存活通常有關的病理學關聯。
[0008] 此外，專利申請?zhí)朩02011/067377描述了外分泌至細胞作為血清中的生化標志物 的可溶性BAG3蛋白，其對于某些病理學狀況，諸如心臟的病理學和胰腺腫瘤的診斷是高度 特異性的。特別是，已經證實了，在患有胰腺癌的患者中（細胞外）可溶性BAG3的濃度通 常大于l〇ng/ml。
[0009] 此外，最近已報道了 BAG3蛋白表達于患有胰腺導管腺癌（PDAC)的346/346患者 中，并由胰腺腫瘤的細胞所釋放，但此蛋白不表達于周圍的非贅生性組織或正常胰腺中；同 樣地，已報道了 BAG3表達的水平與患者存活相關。研宄的結果證明了，應用BAG3mRNA的特 異性siRNA分子可沉默bag3基因表達并誘導細胞死亡，證實了 BAG3蛋白對于胰腺腫瘤細 胞而言是重要的存活因子，且證實了當與慶大霉素結合時，其下調，可有助于根除腫瘤細胞 (Rosati 等人，Am J Pathol. 2012Nov ; 181 (5) : 1524-9) 〇
[0010] 如已知的，用于腫瘤病理學的常規(guī)化療治療，以及用皮質類固醇或NSAID(非甾體 抗炎藥）對炎性和免疫疾病的治療，帶來與副作用相關的許多缺點，并且目前，不是治療此 類病理學的決定性方法。
[0011] 因此，存在對新的及改進的治療處理的明顯需要，與用于治療本發(fā)明中描述的炎 性、免疫、和贅生性性質的疾病的常規(guī)、公知的療法比較，其具有高度特異性及具有很少或 無副作用的優(yōu)勢。
[0012] 發(fā)明描述
[0013] 令人驚訝地，已首次證實了，通過使用抗BAG3單克隆抗體抑制可溶性（即細胞外） BAG3蛋白，損害胰腺腫瘤細胞的發(fā)展?？笲AG3抗體代表用于治療胰腺腫瘤的新的和改進的 治療工具。此外，還已令人驚訝地發(fā)現了，上述的BAG3蛋白參與巨噬細胞的活化。
[0014] 因此，用專利申請?zhí)朩003/055908中描述的能特異性抑制可溶性BAG3蛋白（即細 胞外）對認為是靶細胞的巨噬細胞的活性的抗BAG3抗體的任一種的治療，證明了在特征為 巨噬細胞的活化的這些病理學，諸如贅生性疾病和炎性、免疫、或退行性性質的疾病的治療 中特別有效。事實上，當由細胞分泌時，針對BAG3的這些特異性抗體可以以高度選擇性和 靶向的方式結合并阻斷與BAG3蛋白相關的病理學效應。
[0015] 特別是，抗BAG3抗體在這個進程中的應用具有對特征為過表達和釋放BAG3蛋白 的選擇的病理學狀態(tài)是更特異的，及還在副作用方面更少的損害的令人驚奇的優(yōu)勢。
[0016] 術語"可溶性BAG3蛋白"應理解為細胞外BAG3蛋白，即外部分泌至細胞的蛋白。
[0017] 因此，本發(fā)明的目的之一是抗BAG3抗體作為藥物的用途。
[0018] 根據本發(fā)明可用的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且優(yōu)選地是單克隆抗 體。
[0019] 仍然更優(yōu)選地，所述單克隆抗體可選自以下：鼠抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組 抗體、綴合的抗體、ScFv片段（雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體（tetrabody))、Fab片段、和 片段 F(ab'）2。
[0020] 術語"多克隆抗體"是指由于由不同的漿細胞產生而是遺傳上不同的并識別相同 抗原的不同表位的抗體的混合物。
[0021] 術語"單克隆抗體"是指由于由僅來自一種類型的免疫細胞（即細胞克隆）的細 胞系產生的而全部是相同的一組抗體。
[0022] 術語"人源化抗體"是指其高變區(qū)已替換為非人單克隆抗體的同源區(qū)的人類起源 的抗體。
[0023] 術語"嵌合抗體"是指包含源自不同抗體的部分的抗體。
[0024] 術語"重組抗體"是指使用重組DNA方法獲得的抗體。
[0025] 術語"綴合的抗體"是指綴合了藥物、毒素、放射性物質或其他劑的抗體。
[0026] 術語"scFv片段"（單鏈可變片段）是指僅能夠與相關的抗原結合的免疫球蛋白 片段。ScFv片段還可使用肽接頭合成為二聚體（雙鏈抗體），三聚體（三鏈抗體）和四聚 體（四鏈抗體）。
[0027] 術語"Fab片段"（抗原結合片段）和"Fab2片段"是指由連接至相鄰重鏈的Fe片 段的輕鏈組成的免疫球蛋白片段，且此類片段是單價抗體。當Fab部分成對時，片段稱為 Fab2〇
[0028] 術語"雜交瘤"是指產生單克隆抗體的細胞。
[0029] 在實施例中使用的單克隆抗體通過使用本領域技術人員已知的任何方法針對四 種不同的BAG3蛋白肽免疫接種小鼠來獲得。由于其是BAG3蛋白特異的并且不與任何其他 蛋白包括BAG蛋白共享，因此選擇此類肽。
[0030] 四種肽的序列包括在BAG3氨基酸序列中（RefSeq:NP_004272 ;基因ID 9531)并 選自以下：
[0031] SEQ ID NO 1:DRDPLPPGWEIKIDPQ ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 18-33);
[0032] SEQ ID NO 2:SSPKSVATEERAAPS ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 385-399);
[0033] SEQ ID NO 3:DKGKKNAGNAEDPHT ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 533-547);
[0034] SEQ ID NO 4:NPSSMTDTPGNPAAP ;(包括 BAG3 蛋白氨基酸 561-575)。
[0035] 優(yōu)選地，使用以下圖譜構建體，所述抗體可通過多重抗原肽的方法（MAP) 來獲得（Keah HH 等人，J P印t Res(1988) ;51:2.Tam JP;Proc Natl acad Sci USA (1988) ,85:5409。Ota S,等人，Cancer Res (2002) ,62:1471):
[0036] -MAP-BAG3-l:nh2-DRDPLPPGWEIKIDPQ-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:1);
[0037] -MAP-BAG3-2:nh2-SSPKSVATEERAAPS-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:2);
[0038] -MAP-BAG3-3:nh2-DKGKKNAGNAEDPHT-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:3);
[0039] -MAP-BAG3-4:nh2-NPSSMTDTPGNPAAP-MAP (其包含序列 SEQ ID N0:4);
[0040] 根據本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，所述多克隆抗-BAG3抗體通過針對上述序列SEQ ID NO. 1-4的四種肽之一免疫接種動物來獲得。
[0041] 根據優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的單克隆抗BAG3抗體使用上述四種MAP-BAG3肽通 過標準程序（Tassone P.,等人，Tissue Antigens 51:671(1998))獲得并通過選自以下的 九種母克隆的至少一種來產生：AC-1、AC-2、AC-3、AC-4、AC-5、AC-6、AC-7、AC-8、或 AC-9 (描 述于W003/055908中），其包含對使用的四種MAP-BAG3構建體的每種的特異性雜交瘤。
[0042] 根據另外的實施方案，所用的抗體是從上述母克隆中的至少一種，且優(yōu)選地從選 自以下的至少一種獲得的單克隆抗BAG3抗體：401、八(：-2、4(：-3、4(：-4、或4(：-5。更優(yōu)選地， 所述單克隆抗體從選自以下的至少一種母克隆獲得：AC-I、AC-2、和AC-3。
[0043] 根據另外的優(yōu)選實施方案，以標準程序（Ceran C, Cokol M, Cillgdz S, Tasan I, Ozturk M, Ya