抑制靶基因表達的組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是中國專利申請?zhí)枮?00980130771.X(PCT申請?zhí)枮镻CT/JP2009/063685， PCT公開號為WO2010/013815)、申請日為2009年7月31日、發(fā)明名稱為"抑制靶基因表達 的組合物"的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及用于抑制靶基因表達的組合物等。
【背景技術】
[0003] 作為抑制革El基因表達的方法，已知例如利用RNA干涉（RNAinterference，以下 稱為RNAi)的方法等，具體而言，有報道指出通過在線蟲中導入具有與靶基因相同的序列 的雙鏈RNA，可特異性地抑制該靶基因表達的現(xiàn)象[參見"自然（Nature) "，1998年，第391 卷、第6669號，p. 806-811]。另外，發(fā)現(xiàn)通過在果蠅中導入21~23堿基長度的雙鏈RNA代 替長雙鏈RNA，可以抑制靶基因的表達，將其命名為短干擾RNA(shortinterferingRNA) (siRNA)(參見國際公開第01/75164號說明書）。
[0004] 哺乳動物細胞中導入長雙鏈RNA時，由于病毒防御機制引起細胞程序死亡，不能 抑制特定的基因表達，但發(fā)現(xiàn)只要為20~29堿基的siRNA，則不會引起上述反應，可以抑 制特定基因的表達。其中21~25個堿基的siRNA的表達抑制效果高["自然（Nature) "， 2001 年，第 411 卷，第 6836 號，p. 494-498，"遺傳學自然評論（NatureReviewsGenetics) "， 2002 年，第 3 卷，第 10 號，p. 737-747，"分子細胞（MolecularCell)"，（美國），2002 年，第 10 卷，第 3 號，p.f549_56l，" 自然生物技術（NatureBiotechnology) "，（美國），2002 年，第 20卷，第5號，p. 497-500]。另外，已有報道指出，不僅是雙鏈RNA，具有通過分子內雜交形 成的發(fā)夾（hairpin)結構的單鏈RNA也與siRNA相同地顯示為RNAi[參見"美國國家科學 院院刊（ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesof America) "，2002 年，第 99 卷，第 9 號，p. 6047-6052] 〇
[0005] 關于RNAi，在體內試驗中也經常得到驗證，已經報道了對胎兒動物使用50個堿基 對以下的siRNA的效果（參見專利文獻1)及對成體小鼠的效果（參見專利文獻2)。另外， 靜脈內給與小鼠胎鼠siRNA時，可確認在腎臟、脾臟、肺、胰臟及肝臟各臟器內具有抑制特 定基因表達的效果（參見非專利文獻1)。并且，還報道了在腦細胞中直接給與siRNA，也能 抑制特定基因的表達（參見非專利文獻2)。
[0006] 另一方面，作為向細胞內輸送核酸的方法，已知有使用陽離子脂質體或陽離子聚 合物的方法。但是，該方法中，靜脈內給與含有核酸的陽離子脂質體或陽離子聚合物后，核 酸被迅速地從血中除去，靶組織為肝臟或肺以外的組織時，例如為腫瘤部位等時，不能將核 酸輸送到靶組織，不能夠充分地發(fā)揮作用。因此，已有報道指出一種包封核酸的脂質體（在 脂質體內包封了核酸的脂質體）可以解決核酸在血中被迅速地除去的問題（參見專利文獻 3~6及非專利文獻3)。作為包封核酸等的脂質體的制備方法，專利文獻3中報道了如下方 法，即，例如將陽離子性脂質預先溶解在氯仿中，然后加入寡脫氧核苷酸（ODN)的水溶液和 甲醇，混合后，通過離心分離使陽離子性脂質/ODN的復合體移至氯仿層中，再取出氯仿層， 向其中加入聚乙二醇化磷脂、中性的脂質和水，形成油包水型（W/0)乳劑，采用逆相蒸發(fā)法 處理，制備ODN內包脂質體，專利文獻4及非專利文獻3中報道了如下方法，S卩，將ODN溶解 于PH3. 8的檸檬酸水溶液中，加入脂質（乙醇中），使乙醇濃度降低至20v/v%，制備ODN內 包脂質體，進行定型過濾，通過透析除去過量的乙醇后，再在PH7. 5下透析試樣，除去附著 在脂質體表面的0DN，制備ODN內包脂質體。上述方法均可制備包封核酸等有效成分的脂質 體。
[0007] 相對于此，在專利文獻5及6中報道了通過在液體中用脂雙層膜（lipidbilayer membrane)被覆微粒的方法，制備包封了核酸等有效成分的脂質體。在該方法中，通過減少 含有分散有微粒且溶解了脂質的極性有機溶劑的水溶液中的極性有機溶劑的濃度，可以在 液體中用脂雙層膜被覆微粒。該方法中，能夠以優(yōu)異的效率制備例如適于靜脈注射用微粒 等的大小的用脂雙層膜被覆的微粒（被覆微粒）。另外，專利文獻5及6中，作為被覆微粒 的例子，例如舉出了由ODN或SiRNA與陽離子性脂質構成的通過靜電相互作用形成的復合 體。有報道指出被覆該粒子得到的被覆微粒的粒徑較小，可以用作注射劑，靜脈內給與該被 覆微粒時，顯示較高的血中滯留性，較多地集聚在腫瘤組織。
[0008] 專利文獻1:美國公開第2002-132788號
[0009] 專利文獻2:國際公開第03/10180號說明書
[0010] 專利文獻3:日本特表2002-508765號公報
[0011] 專利文獻4:日本特表2002-501511號公報
[0012] 專利文獻5:國際公開第02/28367號說明書
[0013] 專利文獻6:國際公開第2006/080118號說明書
[0014] 非專利文獻1: "自然?遺傳學（NatureGenetics) "，2002年，第32卷，第1號， p. 107 - 108
[0015] 非專利文獻2: "自然生物技術（NatureBiotechnology) "，2002年，第20卷，第 10 號，P. 1006 - 1010
[0016] 非專利文獻3: "生物化學與生物物理學報（BiochimicaetBiophysicaActa) "， 2001 年，第 1510 卷，p. 152 - 166

【發(fā)明內容】

[0017] 本發(fā)明的目的在于提供用于抑制靶基因表達的組合物等。
[0018] 本發(fā)明涉及以下（1)~（54)項發(fā)明。
[0019] (1) -種組合物，含有包封了RNA的脂質體，所述RNA含有靶基因mRNA的連續(xù)15~ 30個堿基的序列（以下記為序列X)及與該序列X互補的堿基的序列（以下記為互補序列 X'），與序列X及互補序列X'的堿基鍵合的糖的總計1~90%為在2'位上被修飾基團取 代的核糖，所述脂質體是可到達包含靶基因表達部位的組織或臟器的脂質體。
[0020] (2)如上述（1)所述的組合物，其中，所述脂質體是具有可靜脈內給藥的大小的脂 質體。
[0021] (3)如上述（1)或⑵所述的組合物，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉（RNAi) 抑制該靶基因表達的作用的RNA。
[0022] (4)如上述⑴~⑶中任一項所述的組合物，其中，所述靶基因是與腫瘤或炎癥 相關的基因。
[0023] (5)如上述（1)~（4)中任一項所述的組合物，其中，所述靶基因是與血管新生 (angiogenesis)相關的基因。
[0024] (6)如上述⑴~⑷中任一項所述的組合物，其中，所述靶基因是血管內皮生長 因子、血管內皮生長因子受體、纖維芽細胞生長因子、纖維芽細胞生長因子受體、血小板衍 生生長因子、血小板衍生生長因子受體、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、Kruppel樣 因子、Ets轉錄因子、核因子及低氧誘導因子中的任一種的基因。
[0025] (7)如上述⑴~（6)中任一項所述的組合物，其中，所述mRNA為人或小鼠的 mRNAo
[0026] (8)如⑴~（7)中任一項所述的組合物，其中，所述包封了RNA的脂質體含 有復合粒子及被覆該復合粒子的脂雙層膜，所述復合粒子的構成成分為前導粒子（lead particle)和該RNA，
[0027] 該脂雙層膜的構成成分可溶于極性有機溶劑，該脂雙層膜的構成成分及該復合粒 子可以分散在以特定濃度含有該極性有機溶劑的液體中。
[0028] (9)如⑶所述的組合物，其中，所述極性有機溶劑為醇。
[0029] (10)如⑶所述的組合物，其中，所述極性有機溶劑為乙醇。
[0030] (11)如⑶~（10)中任一項所述的組合物，其中，所述前導粒子是含有陽離子性 物質的前導粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質及水溶性物質的脂質衍生物、脂肪酸衍生物 或脂肪烴衍生物為構成成分的脂雙層膜。
[0031] (12)如⑴~（7)中任一項所述的組合物，其中，所述包封了RNA的脂質體是含有 復合粒子及被覆該復合粒子的脂雙層膜的脂質體，所述復合粒子以含有陽離子性物質的前 導粒子和該RNA為構成成分，
[0032] 其中，該脂雙層膜是以中性脂質及水溶性物質的脂質衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烴衍生物為構成成分的脂雙層膜。
[0033] (13)如（11)或（12)所述的組合物，其中，所述陽離子性物質為選自N- [1 - (2， 3-二油酰丙基）]一N，N，N-三甲基氯化銨、N- [1 一（2,3-二油酰丙基）]一N，N- 二甲基胺、N- [1 - (2, 3 -二油基氧基丙基）]-N，N，N-二甲基氣化錢、N- [1 - (2， 3-雙十四烷氧基丙基）]一N，N-二甲基一N-羥乙基溴化銨及3f3 -[N-（N'，N' 一 二甲基氨基乙基）氨基甲?；鵠膽固醇中的一種以上。
[0034] (14)如（11)~（13)中任一項所述的組合物，其中，所述水溶性物質的脂質衍生 物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。
[0035] (15)如（11)~（14)中任一項所述的組合物，其中，所述中性脂質為卵黃卵磷脂。
[0036] (16) -種癌癥或炎癥疾病的治療劑，所述治療劑含有脂質體，所述脂質體含有復 合粒子及被覆該復合粒子的脂雙層膜，
[0037] 所述復合粒子以前導粒子和RNA為構成成分，所述RNA含有與腫瘤或炎癥相關的 靶基因mRNA的連續(xù)15~30個堿基的序列（以下記為序列X1)及與該序列互補的堿基的 序列（以下記為互補序列X/)，與序列X1及互補序列X/的堿基鍵合的糖的總計1~90% 為在2'位上被修飾基團取代的核糖，
[0038] 其中，該脂雙層膜的構成成分可溶于極性有機溶劑，該脂雙層膜的構成成分及該 復合粒子能夠分散在以特定濃度含有該極性有機溶劑的液體中。
[0039] (17)如（16)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述極性有機溶劑為醇。
[0040] (18)如（16)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述極性有機溶劑為乙醇。
[0041] (19)如（16)~（18)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述前導粒 子為含有陽離子性物質的前導粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質及水溶性物質的脂質衍生 物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為構成成分的脂雙層膜。
[0042] (20) -種癌癥或炎癥疾病的治療劑，所述治療劑含有復合粒子及被覆該復合粒子 的脂雙層膜，所述復合粒子以含有陽離子性物質的前導粒子和RNA為構成成分，所述RNA含 有與腫瘤或炎癥相關的靶基因mRNA的連續(xù)15~30個堿基的序列（序列X1)及與該序列 互補的堿基的序列（互補序列X/ )，與序列X1及互補序列X/的堿基鍵合的糖的總計1~ 90%為在2'位上被修飾基團取代的核糖，
[0043] 其中，該脂雙層膜是以中性脂質及水溶性物質的脂質衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烴衍生物為構成成分的脂雙層膜。
[0044] (21)如（19)或（20)所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述陽離子性物質為 選自N- [1 一（2,3-二油酰丙基）]一N，N，N-三甲基氯化銨、N- [1 一（2,3 -二油酰 丙基）]-N，N-二甲基胺、N- [1 - (2,3-二油基氧基丙基）]-N，N，N-三甲基氯化 銨、N- [1 一（2,3-雙十四烷氧基丙基）]一N，N-二甲基一N-羥乙基溴化銨及3P- [N-（N'，N' 一二甲基氨基乙基）氨基甲酰基]膽固醇中的一種以上。
[0045] (22)如（19)~（21)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述水溶性 物質的脂質衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。
[0046] (23)如（19)~（22)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述中性脂 質為卵黃卵磷脂。
[0047] (24)如（16)~（23)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述RNA是 具有利用RNA干涉（RNAi)抑制該靶基因表達的作用的RNA。
[0048] (25)如（16)~（23)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，與腫瘤或炎 癥相關的靶基因是與血管新生相關的基因。
[0049] (26)如（16)~（23)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述與腫瘤 或炎癥相關的靶基因是血管內皮生長因子、血管內皮生長因子受體、纖維芽細胞生長因子、 纖維芽細胞生長因子受體、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子受體、肝細胞生長因 子、肝細胞生長因子受體、Kruppel樣因子、Ets轉錄因子、核因子及低氧誘導因子中的任一 種的基因。
[0050] (27)如（16)~（26)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療劑，其中，所述mRNA 是人或小鼠的mRNA。
[0051] (28)-種癌癥或炎癥疾病的治療方法，所述治療方法將含有脂質體的組合物給與 哺乳動物，所述脂質體含有復合粒子及被覆該復合粒子的脂雙層膜：
[0052] 所述復合粒子以前導粒子和RNA為構成成分，所述RNA含有與腫瘤或炎癥相關的 靶基因mRNA的連續(xù)15~30個堿基的序列（序列X1)及與該序列互補的堿基的序列（互 補序列X/ )，與序列X1及互補序列X/的堿基鍵合的糖的總計1~90%為在2'位上被修 飾基團取代的核糖，
[0053] 其中，該脂雙層膜的構成成分可溶于極性有機溶劑，該脂雙層膜的構成成分及該 復合粒子能夠分散在以特定濃度含有該極性有機溶劑的液體中。
[0054] (29)如（28)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述極性有機溶劑為醇。
[0055] (30)如（28)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述極性有機溶劑為乙 醇。
[0056] (31)如（28)~（30)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述前導 粒子是含有陽離子性物質的前導粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質及水溶性物質的脂質衍 生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為構成成分的脂雙層膜。
[0057] (32)-種癌癥或炎癥疾病的治療方法，所述治療方法將組合物給與哺乳動物，所 述組合物含有復合粒子及被覆該復合粒子的脂雙層膜，
[0058] 所述復合粒子以含有陽離子性物質的前導粒子和RNA為構成成分，所述RNA含有 與腫瘤或炎癥相關的靶基因mRNA的連續(xù)15~30個堿基的序列（序列X1)及與該序列互補 的堿基的序列（互補序列X/)，與序列X1及互補序列X/的堿基鍵合的糖的總計1~90% 為在2'位上被修飾基團取代的核糖，
[0059] 其中，該脂雙層膜是以中性脂質及水溶性物質的脂質衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烴衍生物為構成成分的脂雙層膜。
[0060] (33)如（31)或（32)所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述陽離子性物 質為選自N- [1 一（2,3 -二油酰丙基）]一N，N，N-三甲基氯化銨、N- [1 一（2,3 - 二油酰丙基）]一N，N-二甲基胺、N- [1 一（2,3-二油基氧基丙基）]一N，N，N-三甲 基氯化銨、N- [1 一（2, 3 -雙十四烷氧基丙基）]一N，N-二甲基一N-輕乙基溴化銨及 30 -[N-（N'，N' 一二甲基氨基乙基）氨基甲?；鵠膽固醇中的一種以上。
[0061] (34)如（31)~（33)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中所述水溶 性物質的脂質衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。
[0062] (35)如（31)~（34)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述中性 脂質為卵黃卵磷脂。
[0063] (36)如（28)~（35)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述RNA 是具有利用RNA干涉（RNAi)抑制該靶基因表達的作用的RNA。
[0064] (37)如（28)~（35)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，與腫瘤或 炎癥相關的靶基因是與血管新生相關的基因。
[0065] (38)如（28)~（35)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，所述與腫 瘤或炎癥相關的靶基因是血管內皮生長因子、血管內皮生長因子受體、纖維芽細胞生長因 子、纖維芽細胞生長因子受體、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子受體、肝細胞生 長因子、肝細胞生長因子受體、Kruppel樣因子、Ets轉錄因子、核因子及低氧誘導因子中的 任一種的基因。
[0066] (39)如（28)~（38)中任一項所述的癌癥或炎癥疾病的治療方法，其中，mRNA是 人或小鼠的mRNA。
[0067] (40)-種組合物在制備癌癥或炎癥疾病的治療劑中的應用，所述組合物含有脂質 體，所述脂質體含有復合粒子及被覆該復合粒子的脂雙層膜，
[0068] 所述復合粒子以前導粒子和RNA為構成成分，所述RNA含有與腫瘤或炎癥相關的 靶基因mRNA的連續(xù)15~30個堿基的序列（序列X1)及與該序列互補的堿基的序列（互 補序列X/ )，與序列X1及互補序列X/的堿基鍵合的糖的總計1~90%為在2'位上被修 飾基團取代的核糖，
[0069] 其中，該脂雙層膜的構成成分可溶于極性有機溶劑，該脂雙層膜的構成成分及該 復合粒子能夠分散在以特定濃度含有該極性有機溶劑的液體中。
[0070] (41)如（40)所述的應用，其中，所述極性有機溶劑為醇。
[0071] (42)如（40)所述的應用，其中，所述極性有機溶劑為乙醇。
[0072] (43)如（40)~（42)中任一項所述的應用，其中，所述前導粒子是含有陽離子性物 質的前導粒子，所述脂雙層膜是以中性脂質及水溶性物質的脂質衍生物、脂肪酸衍生物或 脂肪烴衍生物為構成成分的脂雙層膜。
[0073] (44) -種組合物在制備癌癥或炎癥疾病的治療劑中的應用，所述組合物含有復合 粒子及被覆該復合粒子的脂雙層膜，
[0074] 所述復合粒子以含有陽離子性物質的前導粒子和RNA為構成成分，所述RNA含有 與腫瘤或炎癥相關的靶基因mRNA的連續(xù)15~30個堿基的序列（序列X1)及與該序列互補 的堿基的序列（互補序列X/)，與序列X1及互補序列X/的堿基鍵合的糖的總計1~90% 為在2'位上被修飾基團取代的核糖，
[0075] 其中，該脂雙層膜為以中性脂質及水溶性物質的脂質衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烴衍生物為構成成分的脂雙層膜。
[0076] (45)如（43)或（44)所述的應用，其中，所述陽離子性物質為選自N-[1 一（2， 3-二油酰丙基）]一N，N，N-三甲基氯化銨、N- [1 一（2,3 -二油酰丙基）]一N，N-二 甲基胺、N- [1 一（2, 3 -二油基氧基丙基）]一N，N，N-二甲基氣化錢、N- [1 一（2, 3 - 雙十四烷氧基丙基）]一N，N-二甲基一N-羥乙基溴化銨及30 -[N-（N'，N' 一二甲 基氨基乙基）氨基甲?；鵠膽固醇中的一種以上。
[0077] (46)如（43)~（45)中任一項所述的應用，其中，所述水溶性物質的脂質衍生物、 脂肪酸衍生物或脂肪烴衍生物為聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。
[0078] (47)如（43)~（46)中任一項所述的應用，其中，所述中性脂質為卵黃卵磷脂。
[0079] (48)如（40)~（47)中任一項所述的應用，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉 (RNAi)抑制該靶基因表達的作用的RNA。
[0080] (49)如（40)~（47)中任一項所述的應用，其中，所述與腫瘤或炎癥相關的靶基因 是與血管新生相關的基因。
[0081] (50)如（40)~（47)中任一項所述的應用，其中，所述與腫瘤或炎癥相關的靶基因 是血管內皮生長因子、血管內皮生長因子受體、纖維芽細胞生長因子、纖維芽細胞生長因子 受體、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子受體、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子 受體、Kruppel樣因子、Ets轉錄因子、核因子及低氧誘導因子中任一種的基因。
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