一種txndc5短肽在制備抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種短肽的制藥應(yīng)用，尤其涉及一種TXNDC5短肽在制備抗類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA)是一種自我免疫疾病，臨床表現(xiàn)為慢 性、多滑膜關(guān)節(jié)炎。RA病理學(xué)表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜嚴(yán)重炎癥，組織增厚，滑膜內(nèi)T細(xì)胞大量滲 入，B細(xì)胞和滑膜纖維狀細(xì)胞異常增生，毛細(xì)血管大量生成，解剖學(xué)上稱之為血管翳。
[0003]已報(bào)到硫氧還蛋白 5 (thiredoxin domain containing 5, TXNDC5)位于人 6 號(hào)染 色體上（6p24. 3)，其編碼的二硫化物異構(gòu)酶含有蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，F(xiàn)1DI)結(jié)構(gòu)，在缺氧的狀況下高表達(dá)，催化蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn) TXNDC5在RA的滑膜組織中顯著性高表達(dá)，并顯示TXNDC5可能與RA發(fā)病過(guò)程有關(guān)。進(jìn)一步 研究發(fā)現(xiàn)，RA低氧條件下誘導(dǎo)滑膜TXNDC5高表達(dá)。高濃度的TXNDC5可以上調(diào)RA滑膜血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF表達(dá)，VEGF刺激滑膜組織毛細(xì)血管增生，形成血管翳，導(dǎo)致T細(xì)胞得 以向滑膜組織大量滲入造成炎癥，同時(shí)，病變組織獲得充足的營(yíng)養(yǎng)支持B細(xì)胞和纖維狀細(xì) 胞大量增殖。因此目前有報(bào)道通過(guò)抑制TXNDC5酶活性，實(shí)現(xiàn)抑制RA滑膜組織毛細(xì)血管生 成，從而阻斷病變滑膜細(xì)胞增生的營(yíng)養(yǎng)途徑和T細(xì)胞轉(zhuǎn)移途徑，達(dá)到殺傷RA滑膜細(xì)胞和抑 制炎癥過(guò)程的治療RA目的。故，TXNDC5有望成為潛在的RA治療靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種TXNDC5短肽在制備抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述的TXNDC5短肽在制備抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 所述短肽是SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列，所述抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物是抑制類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎關(guān)節(jié)的血管翳生成藥物。
[0006] 上述的應(yīng)用是采用免疫治療的途徑，人為刺激RA患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗TXNDC5抗 體，利用抗原、抗體特異性結(jié)合原理，用抗TXNDC5抗體結(jié)合高表達(dá)的TXNDC5,從而抑制該酶 活性，阻斷毛細(xì)血管形成，達(dá)到治療RA病程的目的。目前已報(bào)道的RA有效的生物制劑，如 益塞譜（Etanerc印t)、類克等，皆是用RA炎癥相關(guān)因子TNF(腫瘤壞死因子）的抗體，通過(guò) 向患者體內(nèi)注射抗TNF抗體，結(jié)合RA高表達(dá)的TNF，抑制TNF的生物活性，阻斷RA炎癥發(fā) 展，獲得RA治療效果。本申請(qǐng)也按此RA治療思路，首先以RA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為模型，通過(guò)免疫干 預(yù)治療的方式，通過(guò)抑制TXNDC5生物功能，達(dá)到治療RA目的。
[0007] 將本發(fā)明所述的TXNDC5短肽注入大白鼠體內(nèi)，使動(dòng)物產(chǎn)生抗TXNDC5抗體。然后， 按常用的RA關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型建立方法，向動(dòng)物體內(nèi)注射II型膠原誘導(dǎo)動(dòng)物表現(xiàn)RA臨床 癥狀（向大鼠注射膠原誘導(dǎo)動(dòng)物全身性關(guān)節(jié)炎癥是RA病理研究和藥物篩選最常用的動(dòng)物 模型）。與對(duì)照組相比，觀察注射了 TXNDC5短肽注射后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否表現(xiàn)RA關(guān)節(jié)炎癥。 如果動(dòng)物未出現(xiàn)RA癥狀，則說(shuō)明注射后的動(dòng)物體內(nèi)抗TXNDC5抗體和TXNDC5抗原特異性結(jié) 合，通過(guò)抑制該酶的PDI催化功能有效地阻止了 TXNDC5下游病理途經(jīng)，阻斷了 TXNDC5對(duì)毛 細(xì)血管生成的刺激作用，從而達(dá)到RA治療目的。
[0008] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在注射了本發(fā)明所述的TXNDC5短肽后抗TXNDC5抗體水平明顯升 高，顯示TXNDC5抗體和其抗原在大鼠體內(nèi)發(fā)生特異性結(jié)合，可以對(duì)TXNDC5酶活性形成免疫 抑制。在膠原誘導(dǎo)RA之前注射了 TXNDC5短肽的動(dòng)物不再表現(xiàn)RA臨床癥狀和組織學(xué)特征， 說(shuō)明對(duì)TXNDC5的免疫抑制可以有效地抑制RA的病理進(jìn)程。對(duì)照組包括a頭發(fā)角蛋白短肽 或BSA替代TXNDC5短肽后，RA現(xiàn)象未受到抑制，證實(shí)TXNDC5短肽對(duì)RA抑制結(jié)果不是免疫 耐受不造成的。TXNDC5短肽注射后用BSA免疫的大鼠未表現(xiàn)RA，這意味著TXNDC5短肽本 身并沒(méi)有對(duì)RA影響。在實(shí)驗(yàn)中，TXNDC5短肽相對(duì)應(yīng)該酶的C-末端，鈣離子結(jié)合區(qū)、PDI活 性部位等部位，因此，其產(chǎn)生的抗體可以通過(guò)免疫結(jié)合有效地抑制TXNDC5酶的生理功能。
[0009] 目前治療RA的生物制劑主要是益賽普、英夫利昔、利妥昔（Rituximab)，但這些生 物制劑均針對(duì)RA大量增生的滑膜細(xì)胞或炎癥因子，無(wú)一針對(duì)另一 RA重要病理特征-血管 翳生成。本發(fā)明提供的TXNDC5短肽可以通過(guò)免疫抑制TXNDC5活性，直接抑制RA的血管翳 生成。通過(guò)切斷滑膜細(xì)胞大量增殖所需的營(yíng)養(yǎng)渠道和T細(xì)胞侵入途徑，從根本上達(dá)到治療 RA的目的。RA病變關(guān)節(jié)組織的本質(zhì)是低氧，低氧環(huán)境誘導(dǎo)病變進(jìn)程。抑制低氧所誘導(dǎo)的 TXNDC5的生物活性，為從整體上治療RA開(kāi)辟了一個(gè)新途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1血中抗TXNDC5抗體水平圖。
[0011] 圖2血中VEGF水平圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1
[0013] 按常規(guī)人工合成方法合成SEQIDNO. 1的氨基酸序列，即為本發(fā)明所述的TXNDC5 短肽。進(jìn)行藥物用途驗(yàn)證試驗(yàn)。
[0014] 雄性Lewis大鼠60只，平均體重120克，8周齡。
[0015] 通過(guò)尾靜脈向每只大鼠分別注射100微克的SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的短 肽。短肽分別與載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白（KLH)偶聯(lián)。
[0016] 將上述短肽與同等體積濃度的弗氏佐劑（5ug/ml)充分混合，在第1、14和28天對(duì) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫注射，按常規(guī)方法使之產(chǎn)生抗TXNDC5抗體。然后，在第一次注射后的第42， 56和70天，向這些動(dòng)物注射牛II型膠原（Sigma公司），按常規(guī)建立RA動(dòng)物模型方法誘導(dǎo) 動(dòng)物表現(xiàn)RA。每日檢查大鼠的肢體發(fā)紅、腫脹和僵硬程度。RA炎癥程度按研究通常所用 的12分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0 :正常，無(wú)腫脹/發(fā)紅，1 :輕度發(fā)紅，2 :變紅和整個(gè) 足腫脹；3:強(qiáng)炎癥和足嚴(yán)重變形。每只鼠四肢RA程度最大累計(jì)12分。同時(shí)，在第0,35,77 和102天采集動(dòng)物血液樣本，用常規(guī)ELISA方法測(cè)定血中抗TXNDC5抗體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子VEGF水平。VEGF代表組織毛細(xì)血管發(fā)育程度。VEGF水平用大鼠VEGF ELISA試劑盒 (Invitrogen公司）完成。大鼠在第一次注射后的第102天處死。解剖出來(lái)的滑膜組織用 常規(guī)免疫組織化方法檢查組織病變程度和TXNDC5表達(dá)狀況。
[0017] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置一系列對(duì)照組，每組大鼠為60只，具體組別如下：（1)，a頭發(fā)角蛋 白短肽（AAVGSRPIHCGVRFC肽）替代TXNDC5短肽；（2)牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）的 取代II型膠原蛋白誘導(dǎo)；（3)BSA代替TXNDC5短肽和II型膠原誘導(dǎo)；(4)只注射II膠原誘 導(dǎo)；（5)只用BSA免疫動(dòng)物，取代短肽和膠原免疫注射；(6)未注射任何短肽和蛋白質(zhì)。
[0018] 實(shí)驗(yàn)組大鼠在免疫TXNDC5短肽后按常規(guī)用膠原誘導(dǎo)RA。
[0019] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
[0020] 以在第一次注射膠原蛋白后第50天（即第一次注射后第92天），60只大鼠 (97%)中的58只沒(méi)有表現(xiàn)任何炎癥和四肢關(guān)節(jié)僵硬。只有兩只在第一次注射膠原后第 56天肢體出現(xiàn)輕微發(fā)炎（炎癥評(píng)分=3)。用a頭發(fā)角蛋白短肽替代TXNDC5短肽注射的 大鼠中，54只大鼠（90%)在膠原誘導(dǎo)后第35. 2±3. 4關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹。在用BSA替代 TXNDC5短肽的大鼠中，51只（85% )大鼠在第一次注射膠原蛋白的第38. 5±3. 8天，關(guān)節(jié) 出現(xiàn)明顯炎癥。所有60只（100% )用BSA替代TXNDC5短肽、其他短肽和膠原的大鼠均不 表現(xiàn)RA的臨床表現(xiàn)。57只（95%，其中5只在實(shí)驗(yàn)期間死亡）大鼠在單獨(dú)注射膠原后第 37. 8±2. 7天顯示關(guān)節(jié)炎癥。注射TXNDC5短肽，然后注射BSA替代II型膠原的60只大鼠 (100%)均沒(méi)有表現(xiàn)RA癥狀。沒(méi)有任何注射的大鼠也均沒(méi)有顯示任何關(guān)節(jié)發(fā)炎癥狀。
[0021] 實(shí)驗(yàn)中用ELISA法檢測(cè)大鼠血液中抗TXNDC5水平。
[0022] 結(jié)果表明，大鼠在第一次TXNDC5短肽注射后的35和77天，血液中出現(xiàn)高水平的 抗TXNDC5抗體，在第102天后下降到正常水平（見(jiàn)圖1)。ELISA對(duì)動(dòng)物血液檢測(cè)還表明， VEGF水平在第一次注射后的102天明顯升高。但是，相比之下，VEGF水平明顯降低在注射 了 TXNDC5寡肽的大鼠血液對(duì)中卻明顯降低，甚至比沒(méi)有治療的大鼠低（見(jiàn)圖2)，說(shuō)明該組 大鼠滑膜組織內(nèi)毛細(xì)血管發(fā)育程度也相對(duì)低。
[0023] 實(shí)驗(yàn)中用免疫組織化學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)滑膜病理結(jié)構(gòu)變化及TXNDC5表達(dá)進(jìn) 行了研究。在膠原注射后的大鼠滑膜組織里，滑膜明顯變厚并含有大量T細(xì)胞，B細(xì)胞和纖 維狀細(xì)胞，同時(shí)觀察到大量毛細(xì)血管生成，這種狀況存在于所有的注射了膠原的大鼠中，不 管它們是否同時(shí)也被注射了其它短肽和或BSA。但在那些在膠原誘導(dǎo)前注射了本發(fā)明所述 TXNDC5短肽的大鼠中，它們的滑膜比較薄，與非RA誘導(dǎo)的對(duì)照組相似，同時(shí)，滑膜毛細(xì)血管 也明顯低于膠原RA誘導(dǎo)的大鼠。免疫組織化學(xué)在所有動(dòng)物的關(guān)節(jié)滑膜中檢測(cè)出TXNDC5的 表達(dá)，該酶多在位于滑膜的表層細(xì)胞表達(dá)。然而，在注射本發(fā)明所述TXNDC5短肽的大鼠關(guān) 節(jié)滑膜中，TXNDC5免疫信號(hào)的強(qiáng)度明顯低于膠原RA誘導(dǎo)對(duì)照組的水平。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種TXNDC5短肽在制備抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述短肽是 SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，所述抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物是抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的 血管翳生成藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種TXNDC5短肽在制備抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用，其中所述短肽是SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列，所述抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物是抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的血管翳生成藥物。試驗(yàn)表明本發(fā)明的短肽可以通過(guò)免疫干預(yù)方式抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜毛細(xì)血管增生，阻斷滑膜細(xì)胞增殖的營(yíng)養(yǎng)途徑和T細(xì)胞滲入途徑，抑制組織炎癥和組織損傷，從而抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎過(guò)程病變進(jìn)程，有望成為抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物。
【IPC分類】A61K38/10, A61P29/00, A61P19/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105031608
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510350788
【發(fā)明人】丁兆明
【申請(qǐng)人】丁兆明
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年6月23日