一種魚鱗膠原止血海綿的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種魚鱗膠原止血海綿的制備方法，屬于醫(yī)療材料制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的纖維支架，存在于絕大多數(shù)薄壁器官間質(zhì)組織中，起著支撐和保護(hù)器官、組織完整性的作用。同時(shí)，膠原與人體血管、皮膚、骨骼和軟骨的形成關(guān)系密切，也是維持各器官、組織彈性和韌性的重要保障。膠原具有優(yōu)越的止血特性和生物相容性，與出血?jiǎng)?chuàng)面接觸時(shí)，能引起血小板聚集，縮短血栓形成的時(shí)間。同時(shí)，膠原能夠刺激血小板釋放亞細(xì)胞顆粒和凝血因子，凝血因子會(huì)主動(dòng)附著、填塞受損血管，從而促進(jìn)凝血過程。此外，膠原還能在接觸面形成穩(wěn)定的凝膠，確保創(chuàng)面新生組織順利地長出，修復(fù)受損創(chuàng)面，大幅縮短傷口愈合時(shí)間。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，性質(zhì)決定用途，膠原特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)賦予膠原良好的生物相容性、可降解性、低抗原性及止血性能等優(yōu)良特性。
[0003]魚鱗主要由有機(jī)物和礦物質(zhì)構(gòu)成，分別占總重的41%?55%和38%?46%，有機(jī)物中以膠原蛋白和角蛋白為主，占有機(jī)物總含量的90%以上；礦物質(zhì)則以磷酸鈣為主，還含有少量的碳酸鈣、磷酸鎂、磷酸鈣等無機(jī)鹽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對(duì)目前膠原止血材料機(jī)械性能弱，止血所需時(shí)間長，促進(jìn)傷口愈合慢的缺陷，提供了一種魚鱗膠原止血海綿的制備方法，該方法是以魚鱗為原材料，通過清洗粉碎，用酸浸泡脫除鈣質(zhì)，之后加入胃蛋白酶酶解，將酶解液高速離心并鹽析得到魚鱗膠原蛋白，再將膠原與殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)最終制得一種魚鱗膠原止血海綿。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)取100?200g魚鱗，用去離子水沖洗3?5遍后晾干，放入反應(yīng)罐，加入400?500mL蒸餾水和50?10mL質(zhì)量濃度為80%的檸檬酸溶液，之后將反應(yīng)罐放置在磁力攪拌機(jī)上，以300?400r/min的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)8?10h，過濾去除酸水，用蒸饋水沖洗5?15min，得到去灰魚鱗；
(2)將上述去灰魚鱗放入500mL燒杯中，加入200?300mL濃度為30%的碳酸氫鈉溶液，攪拌反應(yīng)20?30min，使魚鱗脫脂；
(3)將脫脂后的魚鱗放入100?200mL蒸餾水中，用質(zhì)量濃度為20%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7?8，再用去離子水沖洗，連同魚鱗質(zhì)量2?10倍的蒸餾水一起放入砂鍋，之后油浴升溫至150?160°C，煮沸30?40min后冷卻至室溫繼續(xù)加入魚鱗質(zhì)量0.1?1%的胃蛋白酶，密封酶解I?4h，過濾分離得到酶解液；
(4)將酶解液放入臥式高速離心機(jī)，以8000?9000r/min的轉(zhuǎn)速離心處理10?20min，分離收集上清液，沉淀物繼續(xù)提取2?3次后合并上清液，向上清液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氯化鈉溶液，同時(shí)用玻璃棒沿順時(shí)針方向輕微攪拌，防止過于激烈的攪拌導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，之后靜置于10?12°C的恒溫箱中12?15h，使魚鱗膠原逐漸鹽析出來； (5)之后對(duì)魚鱗膠原鹽析液進(jìn)行高速離心處理，離心轉(zhuǎn)速為6000?7000r/min，分離得到沉淀物，將其裝入截留分子量為12000?16000的透析袋中，以蒸餾水作透析液，于10?12°C的恒溫箱中透析3?5天，透析液每隔12h更換一次，透析完成后將透析袋埋于聚乙二醇中濃縮5?10h，得到魚鱗膠原濃縮液，對(duì)其進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為160?230 0C，出口溫度控制為40?85°C，干燥后得到魚鱗膠原蛋白；
(6)將上述制得的魚鱗膠原和殼聚糖按質(zhì)量比為2:3加到質(zhì)量濃度為0.2?0.5%的乙酸溶液中，再滴加2?3滴質(zhì)量濃度為80%的戊二醛溶液作交聯(lián)劑，用低速攪拌機(jī)以100?200r/min的轉(zhuǎn)速攪拌5?1min混合均勾，之后倒入5cmX 3cmX Icm的娃膠模具中，放入恒溫箱在4?6°C下靜置交聯(lián)24?36h，之后用液氮在_70°C下凍結(jié)5?6h，最后通過真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥I?2天，得到多孔隙海綿狀固體，即一種魚鱗膠原止血海綿。
[0006]本發(fā)明的具體應(yīng)用方法:取本發(fā)明制得的止血海綿，覆蓋在傷口表面，用手輕按施壓5?10s，之后取下海綿，傷口即可止血，本發(fā)明制得的止血海綿所需的止血時(shí)間比一般止血材料所需的止血時(shí)間少30%?40%。
[0007]本發(fā)明的有益效果:
(1)發(fā)明所需的原材料來源豐富，成本低廉，實(shí)現(xiàn)了廢物再利用的目標(biāo)；
(2)本發(fā)明制得的止血材料機(jī)械性能優(yōu)異，不易破損，結(jié)實(shí)耐用。
【具體實(shí)施方式】
[0008]取100?200g魚鱗，用去離子水沖洗3?5遍后晾干，放入反應(yīng)罐，加入400?500mL蒸餾水和50?10mL質(zhì)量濃度為80%的檸檬酸溶液，之后將反應(yīng)罐放置在磁力攪拌機(jī)上，以300?400r/min的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)8?10h，過濾去除酸水，用蒸饋水沖洗5?15min，得到去灰魚鱗；將上述去灰魚鱗放入500mL燒杯中，加入200?3OOmL濃度為30%的碳酸氫鈉溶液，攪拌反應(yīng)20?30min，使魚鱗脫脂；將脫脂后的魚鱗放入100?200mL蒸餾水中，用質(zhì)量濃度為20%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7?8，再用去離子水沖洗，連同魚鱗質(zhì)量2?10倍的蒸餾水一起放入砂鍋，之后油浴升溫至150?160°C，煮沸30?40min后冷卻至室溫繼續(xù)加入魚鱗質(zhì)量0.1?1%的胃蛋白酶，密封酶解I?4h，過濾分離得到酶解液；將酶解液放入臥式高速離心機(jī)，以8000?9000r/min的轉(zhuǎn)速離心處理10?20min，分離收集上清液，沉淀物繼續(xù)提取2?3次后合并上清液，向上清液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氯化鈉溶液，同時(shí)用玻璃棒沿順時(shí)針方向輕微攪拌，防止過于激烈的攪拌導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，之后靜置于10?12°C的恒溫箱中12?15h，使魚鱗膠原逐漸鹽析出來；之后對(duì)魚鱗膠原鹽析液進(jìn)行高速離心處理，離心轉(zhuǎn)速為6000?7000r/min，分離得到沉淀物，將其裝入截留分子量為12000?16000的透析袋中，以蒸餾水作透析液，于10?12°C的恒溫箱中透析3?5天，透析液每隔12h更換一次，透析完成后將透析袋埋于聚乙二醇中濃縮5?10h，得到魚鱗膠原濃縮液，對(duì)其進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為160?230°C，出口溫度控制為40?85°C，干燥后得到魚鱗膠原蛋白；將上述制得的魚鱗膠原和殼聚糖按質(zhì)量比為2:3加到質(zhì)量濃度為0.2?0.5%的乙酸溶液中，再滴加2?3滴質(zhì)量濃度為80%的戊二醛溶液作交聯(lián)劑，用低速攪拌機(jī)以100?200r/min的轉(zhuǎn)速攪拌5?1min混合均勾，之后倒入5cmX 3cmX Icm的娃膠模具中，放入恒溫箱在4?6°C下靜置交聯(lián)24?36h，之后用液氮在_70°C下凍結(jié)5?6h，最后通過真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥I?2天，得到多孔隙海綿狀固體，即一種魚鱗膠原止血海綿。
[0009]本發(fā)明的具體應(yīng)用方法:取本發(fā)明制得的止血海綿，覆蓋在傷口表面，用手輕按施壓5?10s，之后取下海綿，傷口即可止血，本發(fā)明制得的止血海綿所需的止血時(shí)間比一般止血材料所需的止血時(shí)間縮短30%?40%。
[0010]實(shí)例I
取10g魚鱗，用去離子水沖洗3遍后晾干，放入反應(yīng)罐，加入400mL蒸餾水和5OmL質(zhì)量濃度為80%的檸檬酸溶液，之后將反應(yīng)罐放置在磁力攪拌機(jī)上，以300r/min的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)8h，過濾去除酸水，用蒸餾水沖洗5min，得到去灰魚鱗；將上述去灰魚鱗放入500mL燒杯中，加入200mL濃度為30%的碳酸氫鈉溶液，攪拌反應(yīng)20min，使魚鱗脫脂；將脫脂后的魚鱗放入10mL蒸餾水中，用質(zhì)量濃度為20%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7，再用去離子水沖洗，連同魚鱗質(zhì)量2倍的蒸餾水一起放入砂鍋，之后油浴升溫至150°C，煮沸30min后冷卻至室溫繼續(xù)加入魚鱗質(zhì)量0.1%的胃蛋白酶，密封酶解lh，過濾分離得到酶解液；將酶解液放入臥式高速離心機(jī)，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心處理lOmin，分離收集上清液，沉淀物繼續(xù)提取2次后合并上清液，向上清液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氯化鈉溶液，同時(shí)用玻璃棒沿順時(shí)針方向輕微攪拌，防止過于激烈的攪拌導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，之后靜置于10°C的恒溫箱中12h，使魚鱗膠原逐漸鹽析出來；之后對(duì)魚鱗膠原鹽析液進(jìn)行高速離心處理，離心轉(zhuǎn)速為6000r/min，分離得到沉淀物，將其裝入截留分子量為12000的透析袋中，以蒸餾水作透析液，于10°C的恒溫箱中透析3天，透析液每隔12h更換一次，透析完成后將透析袋埋于聚乙二醇中濃縮5h，得到魚鱗膠原濃縮液，對(duì)其進(jìn)