基于crispr的基因組修飾和調(diào)控的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開(kāi)內(nèi)容涉及靶基因組修飾。具體而言，本公開(kāi)涉及RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶或 包含CRISPR/Cas樣蛋白的融合蛋白和使用所述蛋白修飾修飾或調(diào)控靶染色體序列的方 法。
[0002] 發(fā)明背景 靶基因組修飾是用于真核細(xì)胞、胚胎和動(dòng)物的基因操作的有力的工具。例如，外源序列 可以被整合在靶基因組位置和/或特定的內(nèi)源染色體序列可以被缺失、失活或修飾。當(dāng)前 的方法依賴(lài)于工程化核酸酶的使用，工程化核酸酶例如，鋅指核酸酶（ZFNs)或轉(zhuǎn)錄激活子 樣效應(yīng)子核酸酶（TALENs)。這些嵌合核酸酶含有與非特異性DNA剪切結(jié)構(gòu)域連接的可編程 的、序列特異性的DNA結(jié)合組件。但是，各個(gè)新的基因組靶需要設(shè)計(jì)包含新的序列特異性的 DNA-結(jié)合組件的新ZFN或TALEN。因此，這些用戶(hù)定制設(shè)計(jì)的核酸酶往往制備昂貴且耗時(shí)。 此外，ZFNs和TALENS的特異性使得它們能介導(dǎo)脫靶剪切。
[0003] 因此，需要不要求針對(duì)每個(gè)新的靶基因組位置設(shè)計(jì)新的核酸酶的靶基因組修飾技 術(shù)。另外，需要特異性增加的具有很少或沒(méi)有脫靶作用的技術(shù)。
[0004] 發(fā)明概沐 在本公開(kāi)內(nèi)容的不同方面之中提供分離的RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，其中所述核酸內(nèi)切 酶包含至少一個(gè)核定位信號(hào)、至少一個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)與指導(dǎo)RNA相互作用以將 核酸內(nèi)切酶靶向用于剪切的特定核苷酸序列的結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸內(nèi)切 酶可衍生自Cas9蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述核酸內(nèi)切酶可經(jīng)修飾而缺失至少一個(gè)功能 性核酸酶結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，所述核酸內(nèi)切酶可進(jìn)一步包含細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域、標(biāo) 志物結(jié)構(gòu)域，或二者。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸內(nèi)切酶可以是包含指導(dǎo)RNA的蛋 白-RNA復(fù)合物的一部分。在一些情況下，所述指導(dǎo)RNA可以是包含與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的5'區(qū)域 的單分子。也提供編碼任一本文公開(kāi)的RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的分離的核酸。在一些實(shí)施 方案中，所述核酸可以是針對(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞（例如，人細(xì)胞）中翻譯而最優(yōu)化的密碼子。 在其它實(shí)施方案中，編碼RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的核酸序列可以與啟動(dòng)子控制序列可操作 性地連接，并任選地可以是載體的一部分。在其它實(shí)施方案中，包含可以與啟動(dòng)子控制序列 可操作性地連接的編碼RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的序列的載體也可包含可以與啟動(dòng)子控制 序列可操作性連接的編碼指導(dǎo)RNA的序列。
[0005] 本發(fā)明的另一方面包括用于在真核細(xì)胞或胚胎中修飾染色體序列的方法。該方法 包括向真核細(xì)胞或胚胎中引入（i)至少一種包含至少一個(gè)核定位信號(hào)的RNA指導(dǎo)的核酸 內(nèi)切酶或編碼至少一種如本文所定義的RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的核酸，（ii)至少一種指導(dǎo) RNA或編碼至少一種指導(dǎo)RNA的DNA，和任選（iii)至少一種包含供體序列的供體多核苷 酸。該方法進(jìn)一步包括培養(yǎng)所述細(xì)胞或胚胎以便各指導(dǎo)RNA將RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶定向 至染色體序列中的靶位點(diǎn)，其中所述RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶將雙鏈斷裂引入所述靶位點(diǎn)， 并且所述雙鏈斷裂通過(guò)DNA修復(fù)過(guò)程而修復(fù)以便修飾染色體序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶可以衍生自Cas9蛋白。在另一實(shí)施方案中，編碼引入細(xì)胞或胚胎 中的RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的核酸可以是mRNA。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，其中編碼引入細(xì) 胞或胚胎的RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的核酸可以是DNA。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，編碼RNA指 導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的DNA可以是另外包含編碼指導(dǎo)RNA的序列的載體的一部分。在某些實(shí)施 方案中，所述真核細(xì)胞可以是人細(xì)胞、非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞、非哺乳動(dòng)物的脊椎動(dòng)物 細(xì)胞、無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或單細(xì)胞真核生物。在某些其它實(shí)施方案中，所述胚胎是 非人單細(xì)胞動(dòng)物胚胎。
[0006] 本公開(kāi)內(nèi)容的另外方面提供包含CRISPR/Cas樣蛋白或其片段和效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的 融合蛋白。一般而言，所述融合蛋白包含至少一個(gè)核定位信號(hào)。融合蛋白的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域 可以是剪切結(jié)構(gòu)域、表觀遺傳修飾結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí) 施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas樣蛋白可以衍生自Cas9蛋白。在一個(gè)重復(fù)中，所述Cas9 蛋白可經(jīng)修飾而缺失至少一個(gè)功能性核酸酶結(jié)構(gòu)域。在備選的重復(fù)中，所述Cas9蛋白可以 被修飾而缺失全部核酸酶活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域可以是剪切結(jié)構(gòu)域， 例如，F(xiàn)okI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域或修飾的FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，一種 融合蛋白可與另一融合蛋白形成二聚體。所述二聚體可以是同源二聚體或異源二聚體。在 另一實(shí)施方案中，所述融合蛋白可與鋅指核酸酶形成異源二聚體，其中融合蛋白和鋅指核 酸酶二者的剪切結(jié)構(gòu)域是FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域或修飾的FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。在仍 另一實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含衍生自經(jīng)修飾而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白的 CRISPR/Cas樣蛋白，并且所述效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域是FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域或修飾的FokI核酸 內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。在仍另一實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含衍生自經(jīng)修飾而缺失全部核酸酶 活性的Cas9蛋白的CRISPR/Cas樣蛋白，并且所述效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域可以是表觀遺傳修飾結(jié)構(gòu) 域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域。在另外的實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的融合蛋白中任 一種可包含至少一個(gè)選自核定位信號(hào)、細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域和標(biāo)志物結(jié)構(gòu)域的另外的結(jié)構(gòu)域。 也提供編碼本文提供的融合蛋白中任一種的分離的核酸。
[0007] 本公開(kāi)內(nèi)容的仍另一方面包括用于在細(xì)胞或胚胎中修飾染色體序列或調(diào)控染色 體序列的表達(dá)的方法。所述方法包括向細(xì)胞或胚胎中引入：(a)至少一種融合蛋白或編碼 至少一種融合蛋白的核酸，其中所述融合蛋白包含CRISPR/Cas樣蛋白或其片段和效應(yīng)子 結(jié)構(gòu)域，和（b)至少一種指導(dǎo)RNA或編碼至少一種指導(dǎo)RNA的DNA，其中所述指導(dǎo)RNA將融 合蛋白的CRISPR/Cas樣蛋白指導(dǎo)至染色體序列中的靶位點(diǎn)，并且融合蛋白的效應(yīng)子結(jié)構(gòu) 域修飾染色體序列或調(diào)控染色體序列的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/ Cas樣蛋白可以衍生自Cas9蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/Cas樣蛋 白可經(jīng)修飾而缺失至少一個(gè)功能性核酸酶結(jié)構(gòu)域。在仍另一實(shí)施方案中，所述融合蛋白的 CRISPR/Cas樣蛋白可經(jīng)修飾而缺失全部核酸酶活性。在其中融合蛋白包含經(jīng)修飾而缺失全 部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切結(jié)構(gòu)域或修飾的FokI剪切結(jié)構(gòu)域的一個(gè)實(shí)施方案 中，該方法可包括向所述細(xì)胞或胚胎引入一種融合蛋白或編碼一種融合蛋白的核酸和兩種 指導(dǎo)RNA或編碼兩種指導(dǎo)RNA的DNA，并且其中一個(gè)雙鏈斷裂被引入染色體序列。在其中 所述融合蛋白包含經(jīng)修飾而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切結(jié)構(gòu)域或修飾的 FokI剪切結(jié)構(gòu)域的另一實(shí)施方案中，所述方法可包括向所述細(xì)胞或胚胎中引入兩種融合蛋 白或編碼兩種融合蛋白的核酸和兩種指導(dǎo)RNA或編碼兩種指導(dǎo)RNA的DNA，并且其中兩個(gè)雙 鏈斷裂被引入所述染色體序列。在其中所述融合蛋白包含經(jīng)修飾而缺失全部核酸酶活性的 Cas9蛋白和FokI剪切結(jié)構(gòu)域或修飾的FokI剪切結(jié)構(gòu)域的仍另一實(shí)施方案中，所述方法可 包括向細(xì)胞或胚胎中引入一種融合蛋白或編碼一種融合蛋白的核酸、一種指導(dǎo)RNA或編碼 一種指導(dǎo)RNA的核酸和一種鋅指核酸酶或編碼一種鋅指核酸酶的核酸，其中所述鋅指核酸 酶包含F(xiàn)okI剪切結(jié)構(gòu)域或修飾的FokI剪切結(jié)構(gòu)域，并且其中一個(gè)雙鏈斷裂被引入所述染 色體序列。在其中所述融合蛋白包含剪切結(jié)構(gòu)域的某些實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包 含向細(xì)胞或胚胎引入至少一種供體多核苷酸。在其中所述融合蛋白包含選自表觀遺傳修飾 結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的實(shí)施方案中，所述融合蛋 白可包含經(jīng)修飾而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白，且所述方法可以包括向細(xì)胞或胚胎 中引入一種融合蛋白或編碼一種融合蛋白的核酸和一種指導(dǎo)RNA或編碼一種指導(dǎo)RNA的核 酸，并且其中修飾所述靶染色體序列的結(jié)構(gòu)或表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述真核細(xì)胞可以 是人細(xì)胞、非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞、非哺乳動(dòng)物的脊椎動(dòng)物細(xì)胞、無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞、植物 細(xì)胞或單細(xì)胞真核生物。在某些其它實(shí)施方案中，所述胚胎是非人單細(xì)胞動(dòng)物胚胎。
[0008] 本公開(kāi)內(nèi)容的其它方面和重復(fù)在下面詳述。
[0009] 附圖簡(jiǎn)沐 圖1圖示使用蛋白二聚體的基因組修飾。（A)描繪了由兩種融合蛋白組成的二聚體所 產(chǎn)生的雙鏈斷裂，所述兩種融合蛋白的每一種包含用于DNA結(jié)合的Cas樣蛋白和FokI剪切 結(jié)構(gòu)域。（B)描繪了由二聚體所產(chǎn)生的雙鏈斷裂，所述二聚體由包含Cas樣蛋白和FokI剪 切結(jié)構(gòu)域的融合蛋白以及包含鋅指（ZF) DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和FokI剪切結(jié)構(gòu)域的鋅指核酸酶 組成。
[0010] 圖2表明使用包含基因調(diào)控結(jié)構(gòu)域的RNA指導(dǎo)的融合蛋白調(diào)控基因表達(dá)。（A)描 繪了包含用于DNA結(jié)合的Cas樣蛋白和激活或抑制基因表達(dá)的"A/R"結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。 (B)圖示包含用于DNA結(jié)合的Cas樣蛋白和通過(guò)鄰近的DNA或蛋白的共價(jià)修飾而影響表觀 遺傳狀態(tài)的表觀遺傳修飾結(jié)構(gòu)域（"Epi-mod'）的融合蛋白。
[0011] 圖3圖示使用兩種RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的基因組修飾。
[0012] (A)描繪了由已經(jīng)轉(zhuǎn)化為切口酶的兩種RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的雙鏈斷裂。 (B)描繪了由具有核酸內(nèi)切酶活性的兩種RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的兩個(gè)雙鏈斷裂。
[0013] 圖4顯示了用Cas9核酸、Cas9指導(dǎo)的RNA和AAVS1-GFP DNA供體轉(zhuǎn)染的人K562 細(xì)胞的熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS)。Y軸表示在紅色通道的自發(fā)熒光強(qiáng)度，和X軸表示綠 色熒光強(qiáng)度，（A)用以下轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞：10噸的用Anti-Reverse帽類(lèi)似物轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA、0. 3 nmol 的預(yù)退火的 crRNA-tracrRNA 雙鏈體和 10 噸的 AAVS1-GFP 質(zhì)粒 DNA ; (B) 用以下轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞：10 Pg的用Anti-Reverse帽類(lèi)似物轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA、0. 3 nmol 的嵌合RNA和10噸的AAVS1-GFP質(zhì)粒DNA ; (C)用以下轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞：10噸的通過(guò) 轉(zhuǎn)錄后加帽反應(yīng)加帽的Cas9 mRNA、0. 3 nmol的嵌合RNA和10噸的AAVS1-GFP質(zhì)粒DNA ; (D)用10噸的Cas9質(zhì)粒DNA、5噸的U6-嵌合RNA質(zhì)粒DNA和10噸的AAVS1-GFP質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞；（E)用10噸的AAVS1-GFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞；（F)僅用轉(zhuǎn) 染試劑轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞。
[0014] 圖5顯示證明GFP靶向整合至人細(xì)胞的AAVSl基因座的連接PCR分析。泳道M: 1 kb DNA分子標(biāo)記；泳道A:用以下轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞：用Anti-Reverse帽類(lèi)似物轉(zhuǎn)錄的10 Kg 的 Cas9 mRNA、0. 3 nmol 的預(yù)退火的 crRNA-tracrRNA 雙鏈體和 10 Kg 的 AAVS1-GFP 質(zhì) 粒DNA ;泳道B:用以下轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞：用Anti-Reverse帽類(lèi)似物轉(zhuǎn)錄的10噸的Cas9 mRNA、0. 3 nmol的嵌合RNA和10噸的AAVS1-GFP質(zhì)粒DNA ;泳道C:用通過(guò)轉(zhuǎn)錄后加帽反 應(yīng)加帽的10噸的Cas9 mRNA、0. 3 nmol的嵌合RNA和10噸的AAVS1-GFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染 的K562細(xì)胞；泳道D:用10噸的Cas9質(zhì)粒DNA、5噸的U6-嵌合RNA質(zhì)粒DNA和10噸 的AAVS1-GFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞；泳道E:用10噸的AAVS1-GFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的 K562細(xì)胞；泳道F:僅用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞。
[0015]發(fā)明詳沐 本文提供RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，其包含至少一個(gè)核定位信號(hào)、至少一個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu) 域和至少一個(gè)與指導(dǎo)RNA相互作用以將所述核酸內(nèi)切酶靶向用于剪切的特異性核苷酸序 列的結(jié)構(gòu)域。也提供了編碼RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的核酸，和使用RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶 修飾真核細(xì)胞或胚胎的染色體序列的方法。所述RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶與特異性的指導(dǎo) RNA相互作用，所述特異性的指導(dǎo)RNA的每一種將所述核酸內(nèi)切酶定向至特定靶位點(diǎn)，在所 述位點(diǎn)該RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶引起雙鏈斷裂，其可通過(guò)DNA修復(fù)過(guò)程而修復(fù)使得修復(fù)染 色體序列。因?yàn)樘禺愋酝ㄟ^(guò)所述指導(dǎo)RNA提供，因此基于RNA的核酸內(nèi)切酶是通用的，并且 可以與不同的指導(dǎo)RNA-起使用以靶向不同基因組序列。本文公開(kāi)的方法可用于靶向和修 飾特定的染色體序列和/或?qū)⑼庠葱蛄幸氲郊?xì)胞或胚胎的基因組中的靶位置。此外，靶 向是特異性的，具有有限的脫靶效果。
[0016] 本公開(kāi)內(nèi)容提供了融合蛋白，其中融合蛋白包含CRISPR/Cas樣蛋白或其片段和 效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。合適的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域包括但不限于剪切結(jié)構(gòu)域、表觀遺傳修飾結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄 激活結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域。通過(guò)特異性指導(dǎo)RNA將各融合蛋白指導(dǎo)至具體的染色體 序列，其中所述效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)靶基因組修飾或基因調(diào)控。在一個(gè)方面，所述融合蛋白可 用作二聚體，從而增加靶位點(diǎn)的長(zhǎng)度和增加其在基因組中的唯一性的可能性（從而，降低 脫靶效果）。例如，內(nèi)源的CRISPR系統(tǒng)基于大約13-20 bp的DNA結(jié)合字長(zhǎng)度而修飾基因組 位置（Cong等人，Science, 339:819-823)。在此字長(zhǎng)，僅5-7%的靶位點(diǎn)在基因組內(nèi)是唯 一的（Iseli等人，PLos One 2(6):e579)。相比之下，鋅指核酸酶的DNA結(jié)合字長(zhǎng)范圍通 常為30-36 bp，這產(chǎn)生大約85-87%在人基因組內(nèi)唯一的靶位點(diǎn)。基于CRISPR的系統(tǒng)所利 用的較小大小的DNA結(jié)合位點(diǎn)限制了在所需位置附近的基于靶向CRISP的核酸酶的設(shè)計(jì)并 使其復(fù)雜化，所述所需位置例如疾病SNPs、小外顯子、起始密碼子和終止密碼子，以及在復(fù) 雜的基因組中的其它位置。本公開(kāi)內(nèi)容不僅提供了用于擴(kuò)展CRISPR DNA結(jié)合字長(zhǎng)的方式 (即，以便限制脫靶活性），而且進(jìn)一步提供具有修飾功能性的CRISPR融合蛋白。因此，所 公開(kāi)的CRISPR融合蛋白具有增加的靶特異性和唯一的功能性。本文也提供使用融合蛋白 以修飾或調(diào)控靶染色體序列的表達(dá)的方法。
[0017] (I) RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶 本公開(kāi)內(nèi)容的一個(gè)方面提供包含至少一個(gè)核定位信號(hào)的RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，所述 核定位信號(hào)允許核酸內(nèi)切酶進(jìn)入真核細(xì)胞和胚胎（例如，非人單細(xì)胞胚胎）的胞核。RNA指 導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶也包含至少一個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)與指導(dǎo)RNA相互作用的結(jié)構(gòu)域。 RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶被指導(dǎo)RNA定向至特定的核酸序列（或革EU立點(diǎn)）。所述指導(dǎo)RNA與 RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶和靶位點(diǎn)相互作用使得一旦定向至靶位點(diǎn)，RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶 就能夠向靶位點(diǎn)核酸序列中引入雙鏈斷裂。因?yàn)樗鲋笇?dǎo)RNA提供針對(duì)靶向剪切的特異 性，RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的核酸內(nèi)切酶是通用的并且可以與不同指導(dǎo)RNA -起使用以剪 切不同靶核酸序列。本文提供了分離的RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶、編碼RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切 酶的分離的核酸（即，RNA或DNA)、包含編碼RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶的核酸的載體、以及包 含RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶加上指導(dǎo)RNA的蛋白-RNA復(fù)合物。
[0018] RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶可衍生自成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)（CRISPR)/CRISPR 相關(guān)的（Cas)系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)可以是類(lèi)型I、類(lèi)型II或類(lèi)型III系統(tǒng)。合適的CRISPR/ Cas 蛋白的非限制性實(shí)例包括 Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e (或 CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、 Cas7、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、 Csy3、Csel (或 CasA)、Cse2 (或 CasB)、Cse3 (或 CasE)、Cse4 (或 CasC)、Cscl、Csc2、 Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、 Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Cszl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4 和 Cul966。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶衍生自類(lèi)型11 CRI SPR/Cas系 統(tǒng)。在特定實(shí)施方案中，RNA指導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶衍生自Cas9蛋白。Cas9蛋白可來(lái)自釀 {Streptococcus pyogenes) ^ ^ ^ {Streptococcus thermophilus)> 鏈球菌57?.)、達(dá)松維爾擬諾卡氏菌KiUei)、 始旋鏈霉菌、綠色產(chǎn)色鏈霉菌（tSYre1/?細(xì) )、綠色產(chǎn)色鏈霉菌、玫瑰鏈抱囊菌（tSYre1/?、玫 瑰鏈孢囊菌、酸熱脂環(huán)酸桿菌（Wi、假蕈狀芽孢桿菌 {Bacillus pseudomycoides) ^Bacillus selenitireducens^Exiguohacterium sihiricum^ 德氏乳桿菌、唾液乳桿菌、 M ^ ^{Microscilla marina)>Burkholderiales bacterium、Polaromonas naphthalenivorans>Polaromonas sp.、Crocosphaera watsonii、奮奸餐{Cyanothece職）、銅綠微囊藍(lán)細(xì)菌胤紹)、聚球菌職）、阿拉伯 {Acetohalobium arabaticum) ^ Ammonifex degensiu Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus Desulforudis、與毒後舊{Clostridium botulinuni)、娘後 菌（C/astri、大芬戈?duì)柕戮?7Zne^rWia 、嗜熱鹽堿厭氧菌 {Na tranaerohi us thermophi I us)> M ? 5 ^ ^{Pelo tomaculum thermoprop i oni cum)> Acidithiobacillus caldus、^%後氧M覽銀MiVi:著[{Acidithiobacillus ferrooxidan^)、紫色硫細(xì)菌、海桿菌57?.)、嗜鹽硝化球 菌(Ni trosococcus halophilus、、Ni trosococcus watsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、多魚(yú){Anabaena {Nodularia spumigena) ^Nostoc57?. {Arthrospira maxima) ^ Arthrospira platens{Arthrospira57?.)、鞘絲藍(lán)細(xì)菌屬57?.)、原型體微鞘藍(lán)細(xì)菌 顫藍(lán)細(xì)菌屬（(?以Vhtoria職）、非洲棲熱腔菌（TXe/TffosipAc*africanus)或Acaryochloris marina。
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