碳氟連接的肽制劑的制作方法
【專利說(shuō)明】碳?xì)膺B接的化制劑
[000。本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年12月30日，申請(qǐng)?zhí)枮?01180067838. 7,發(fā)明名稱為"碳 氣連接的膚制劑"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及包含碳?xì)膺B接的膚的可藥用制劑、用于制備運(yùn)類可藥用制劑的制劑、 制備運(yùn)類制劑的方法W及運(yùn)類制劑作為疫苗和免疫治療劑的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 將合成膚抗原用于疫苗W預(yù)防感染性疾病（例如病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感 染和真菌感染）受到關(guān)注。合成膚抗原在免疫治療劑領(lǐng)域一一包括治療感染、刺激對(duì)癌細(xì) 胞的免疫、下調(diào)多膚激素W及控制不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答例如過(guò)敏反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)一一也受到 關(guān)注。
[0004] 實(shí)際使用基于膚的疫苗和免疫治療中的一個(gè)難點(diǎn)是確保通過(guò)有效地遞送膚抗原 至抗原呈遞細(xì)胞而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。如果沒(méi)有運(yùn)種祀向作用，則可能需要難W實(shí)施的量的膚， 運(yùn)不僅在制造上是不經(jīng)濟(jì)的而且也會(huì)導(dǎo)致毒性問(wèn)題。
[0005] 膚遞送的增強(qiáng)可通過(guò)?？诘倪f送載體來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如能夠持續(xù)釋放的基于微粒的結(jié) 構(gòu)。另外，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了包含共價(jià)連接到遞送增強(qiáng)劑的目的膚的膚衍生物或修飾膚，W改進(jìn)生 物利用度及呈遞所述膚至特定祀細(xì)胞和受體。
[0006] 通過(guò)將碳?xì)怄湽矁r(jià)連接至膚N末端或C末端，或兩者之間的任何位置W產(chǎn)生碳?xì)?連接的膚（FCP)而構(gòu)建了被修飾W改善至抗原呈遞細(xì)胞的遞送的一類具體膚。碳?xì)膺B接的 膚的實(shí)例在W02005/099752和W02009/027688中給出，其中提供了在增強(qiáng)對(duì)所述膚的免疫 應(yīng)答中由碳?xì)膺B接賦予的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 疫苗設(shè)計(jì)者會(huì)理解，可能需要多于一種膚W提供更寬的預(yù)防或免疫治療效果。運(yùn) 類多組分產(chǎn)品是合乎需要的，因?yàn)樗鼈兒芸赡芨行У丶ぐl(fā)恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。
[000引為了制造該性質(zhì)的藥劑，必須合成、純化、從險(xiǎn)當(dāng)?shù)谋壤旌纤鎏細(xì)膺B接的膚， 使其無(wú)菌并W適于給藥的同質(zhì)形式提供。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，碳?xì)膺B接的膚經(jīng)常難溶于水性介質(zhì)，例如水或憐酸鹽緩沖鹽水， 即使當(dāng)未連接的膚可溶于水性介質(zhì)時(shí)也如此。他們還發(fā)現(xiàn)，碳?xì)膺B接的膚中膚組分的長(zhǎng)度 和疏水性影響所述碳?xì)膺B接的膚的溶解性。尤其地，已發(fā)現(xiàn)連接到顯示出更好免疫遺傳性 質(zhì)的更長(zhǎng)、疏水性更強(qiáng)的膚的碳?xì)廨d體是尤其不溶的。
[0010] 碳?xì)膺B接的膚是雙親性的，并特征性地在極性（質(zhì)子和非質(zhì)子）溶劑和非極性溶 劑中形成多分子微團(tuán)型結(jié)構(gòu)。天然未連接的膚通常不形成運(yùn)類結(jié)構(gòu)。但是，本發(fā)明人已發(fā) 現(xiàn)，許多碳?xì)膺B接的膚，尤其是具有最佳免疫原性性質(zhì)的那些，在水性介質(zhì)和其他溶劑中傾 向于形成大的可見(jiàn)聚集體。運(yùn)類聚集體的形成在需要產(chǎn)生同質(zhì)的、可表征的制劑的藥物制 造過(guò)程中是不可接受的。
[0011] 已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了該問(wèn)題，本發(fā)明人已經(jīng)將其解決并設(shè)計(jì)了一種制備碳?xì)膺B接的膚制 劑的方法，其中維持了支持所述碳?xì)膺B接的膚的溶解性的超分子結(jié)構(gòu)。發(fā)明人開(kāi)發(fā)的配制 方法使得有可能制造包含W前被發(fā)現(xiàn)難W配制的免疫原性的碳?xì)膺B接的膚的穩(wěn)定產(chǎn)品，所 述產(chǎn)品可用水性介質(zhì)容易地復(fù)原W獲得可藥用溶液。
[0012] 具體地，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，使用酸性溶液可促進(jìn)微團(tuán)形成并避免不溶性聚集體的形 成。所述溶解的碳?xì)膺B接的膚可通過(guò)過(guò)濾除菌，而不損失溶液中的碳?xì)膺B接的膚。在冷凍 干燥之后，通常在冷凍保護(hù)劑的存在下，可將碳?xì)膺B接的膚W穩(wěn)定的形式儲(chǔ)存并溶解于水 性介質(zhì)中W獲得用于給藥的可藥用溶液。
[0013] 發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于寬范圍的碳?xì)膺B接的膚，乙酸是尤其適合的溶劑，盡管不同膚 的電荷和疏水性具有高度的可變性。因此，乙酸也尤其適用于溶解碳?xì)膺B接的膚的混合物。
[0014] 因此，本發(fā)明提供了一種適合用于制備可藥用碳?xì)膺B接的膚制劑中的水性酸性制 劑，所述制劑包含第一碳?xì)膺B接的膚，其中：
[0015] (i)連接到所述碳?xì)獾哪w為長(zhǎng)度至少20個(gè)氨基酸殘基，包含至少50%的疏水性氨 基酸殘基并且具有大于或等于7的等電點(diǎn)；并且
[0016] (ii)所述碳?xì)膺B接的膚W直徑小于0. 22ym的微團(tuán)存在。
[0017] 優(yōu)選地，所述制劑包含乙酸。所述水性制劑可具有例如5或小于5的抑。
[0018] 所述制劑可包含存W直徑小于0. 22ym的微團(tuán)存在的一種或多種另外的碳?xì)膺B 接的膚。優(yōu)選地，所述制劑中存在的至少80%的碳?xì)膺B接的膚微團(tuán)具有小于lOOnm的直徑。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑不包含運(yùn)樣的碳?xì)膺B接的膚，即其中連接到所 述碳?xì)獾乃瞿w：（i)具有小于7的等電點(diǎn)；（ii)在所述碳?xì)膺h(yuǎn)端的最后15個(gè)連續(xù)氨基酸 中不包含帶正電的氨基酸；并且/或者（iii)包含含有多于80%的疏水性氨基酸殘基的20 個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列。
[0020] 連接到所述碳?xì)獾乃瞿w通常是衍生自病原體、自體蛋白或腫瘤細(xì)胞的免疫原性 膚。本發(fā)明的制劑還可包含可藥用載體或稀釋劑和/或佐劑。
[0021] 本發(fā)明還提供了：
[0022] -一種獲得可藥用的碳?xì)膺B接的膚制劑的方法，所述方法包含：
[0023] (i)將碳?xì)膺B接的膚溶解于乙酸；
[0024] (ii)將所述溶解的碳?xì)膺B接的膚過(guò)濾除菌；和 [00巧](iii)干燥所述過(guò)濾除菌的碳?xì)膺B接的膚。
[0026] -一種可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的碳?xì)膺B接的膚制劑；
[0027] --種包含6種碳?xì)膺B接的膚的可藥用制劑，其中連接到所述碳?xì)獾哪w包含SEQ IDN0:l-6中列出的序列，并且其中所述制劑不包含其他碳?xì)膺B接的膚；
[0028] --種本發(fā)明的可藥用制劑，用于通過(guò)療法來(lái)治療人體或動(dòng)物體的方法中；
[0029] - 一種本發(fā)明的可藥用制劑，用于治療或預(yù)防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥 的方法中；
[0030] -本發(fā)明的可藥用制劑在制造用于治療或預(yù)防病原體感染、自身免疫性疾病或癌 癥的藥劑中的用途；W及
[0031] - 一種治療或預(yù)防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥的方法，所述方法包含向需 要其的個(gè)體給予有效量的本發(fā)明的可藥用制劑。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1示出了典型的碳?xì)膺B接的膚制造過(guò)程流程的實(shí)例。
[0033] 圖2示出了備選的碳?xì)膺B接的膚制造過(guò)程流程。
[0034] 圖3的表示出溶于多種溶劑的各個(gè)FCP的目視檢查結(jié)果?？v滿后目視檢查每種溶 液的澄清度，對(duì)于澄清溶液指定"+++"的得分至對(duì)于高度渾濁的溶液指定的得分。還 記錄了泡沫形成程度和微粒的存在情況，"+++"表示高水平，表示均不存在。表示 溶液變粘稠。
[0035] 圖4的表示出用甘露醇溶液稀釋后溶于每種溶劑中的各個(gè)FCP的目視檢查的結(jié) 果。目視檢查每種溶液的澄清度，對(duì)于澄清溶液指定"+++"的得分至對(duì)于高度渾濁的溶液 指定的得分。還記錄了泡沫形成程度和微粒的存在情況，"+++"表示高水平，表示 均不存在。
[0036] 圖5示出了通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射值ynamicLi曲tScattering,化巧評(píng)估的混合和稀 釋后溶液中碳?xì)膺B接的膚的粒度。
[0037] 圖6示出了通過(guò)透射電子顯微術(shù)（TEM)評(píng)估的混合和稀釋后溶液中碳?xì)膺B接的膚 顆粒的大小和形狀。
[003引圖7示出了通過(guò)DLS評(píng)估的在除菌級(jí)過(guò)濾之前（A)和之后做的碳?xì)膺B接的膚顆 粒的W體積表示的大小分布。
[0039] 圖8示出了通過(guò)DLS評(píng)估的在TrislOmM抑7. 85(A)和水做中復(fù)原的碳?xì)膺B接 的膚顆粒的W體積表示的大小分布。
[0040] 圖9示出了暴露于50% (v/v)乙酸中24小時(shí)的7種碳?xì)膺B接的膚的混合物的 RP-HPLC分析的結(jié)果。
[0041] 圖10示出了用手搖動(dòng)后，碳?xì)膺B接的膚的經(jīng)配制混合物和未經(jīng)配制混合物的照 片。瓶A:經(jīng)配制的+甘露醇/水；瓶B:經(jīng)配制的+甘露醇/組氨酸；瓶C:未經(jīng)配制的+甘 露醇/水；瓶D:未經(jīng)配制的+甘露醇/組氨酸。
[0042] 圖11示出了縱滿和超聲后的碳?xì)膺B接的膚的經(jīng)配制混合物和未經(jīng)配制混合物的 照片。瓶A:配制的+甘露醇/水；瓶B:經(jīng)配制的+甘露醇/組氨酸；瓶C:未經(jīng)配制的+甘 露醇/水；瓶D:未經(jīng)配制的+甘露醇/組氨酸。
[0043] 圖12示出了包含6種碳?xì)膺B接的流感膚的制劑（FP-01. 1)的透射電子顯微鏡照 片。
[0044] 圖13示出了過(guò)濾后的FR01. 1在t。（上圖）和24小時(shí)后（下圖）的HPLC譜。
[0045] 圖14示出了在水中復(fù)原后FP01. 1的HPLC譜。
[004引圖15示出了在水中復(fù)原的經(jīng)配制的碳?xì)饽w腫01. 1)和未經(jīng)配制的膚的比較。左 照片在20分鐘靜置后拍攝，右照片在3分鐘超聲處理后拍攝。
[0047] 圖16示出了在28mMk組氨酸中復(fù)原的經(jīng)配制的碳?xì)饽w（FP01. 1)與未經(jīng)配制的 膚的比較。左照片在20分鐘靜置后拍攝，右照片在3分鐘超聲處理后拍攝。
[0048] 圖17示出了大鼠中的體積調(diào)整的劑量應(yīng)答。在測(cè)試的所有劑量水平下，F(xiàn)P-01. 1 W劑量依賴的形式誘導(dǎo)了陽(yáng)性IFN- 丫T細(xì)胞應(yīng)答。
[0049] 圖18示出了使用體外IFN-丫ELISpot測(cè)定觀察到的疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答。用 6種個(gè)體膚（對(duì)應(yīng)于所述疫苗中含有的膚）刺激PBMC18小時(shí)。陽(yáng)性測(cè)定響應(yīng)被定義為陰 性對(duì)照孔中斑點(diǎn)數(shù)的平均值+所述平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)算了 6種膚的每一個(gè)的斑點(diǎn)數(shù) W獲得"長(zhǎng)膚的總和"，并表示為每一百萬(wàn)輸入的PBMC的斑點(diǎn)數(shù)。
[0050] 序列說(shuō)明
[0051] 對(duì)應(yīng)于實(shí)施例中使用的膚的序列表如下表所示。
[0052]
[0053]

【具體實(shí)施方式】
[0054] 本發(fā)明提供了一種配制用于給予人或動(dòng)物的碳?xì)膺B接的膚的方法和可通過(guò)本發(fā) 明的方法獲得的可藥用的碳?xì)膺B接的膚制劑。本發(fā)明的方法包含將所述碳?xì)膺B接的膚溶于 酸性溶液，優(yōu)選溶于乙酸的步驟。本發(fā)明還提供了水性制劑，所述水性制劑是酸性的并因此 不適用于給予人或動(dòng)物，但是其對(duì)于獲得所述可藥用的制劑是重要的。
[0055] 通常，在配制方法中使用的或者在本發(fā)明的水性酸性制劑或可藥用制劑中存在的 至少一種碳?xì)膺B接的膚包含至少20個(gè)氨基酸殘基的膚，所述膚具有至少50 %的疏水性氨 基酸殘基并具有大于或等于7的等電點(diǎn)。
[0056] 本發(fā)明的制劑可包含，或者本發(fā)明的配制方法可使用，至少一種碳?xì)膺B接的膚，其 中所述膚包含至少約20個(gè)氨基酸，其中至少約50%的氨基酸是疏水性的。所述制劑中存在 的其他碳?xì)膺B接的膚可W短于20個(gè)氨基酸并且/或者可具有少于50 %的疏水性殘基。
[0057] 本發(fā)明的制劑可含有包含至少7個(gè)氨基酸至最高達(dá)約100個(gè)氨基酸，例如約9至 約50個(gè)氨基酸，優(yōu)選約15至約45個(gè)氨基酸，更優(yōu)選約20至約40個(gè)氨基酸，例如約25至 約38,例如30、31、32、33、34、35、36或37個(gè)氨基酸的序列的碳?xì)膺B接的膚。
[0058] 本發(fā)明的制劑可包含至少一種碳?xì)膺B接的膚，其中所述膚中至少50%的氨基酸是 疏水性的。通常，約50%至約80%，例如約70%或約75%的殘基是疏水性的。下限可W為 48%或49%。優(yōu)選地，所述膚包含約55%至約60%或約65%的疏水性殘基。當(dāng)所述制劑 包含另外的碳?xì)膺B接的膚時(shí)，所述另外的碳?xì)膺B接的膚可具有少于50%的疏水性。例如， 另外的碳?xì)膺B接的膚的膚組分可包含約30%至約70%的疏水性殘基，例如約40%，例如約 45%、50%、55%、60%或65%的疏水性殘基。色氨酸（W)、酪氨酸燈)、異亮氨酸（I)、苯丙 氨酸（巧、亮氨酸化)、鄉(xiāng)氨酸（V)、甲硫氨酸（M)、精氨酸（A)、脯氨酸（P)、甘氨酸（G)和半 脫氨酸（C)為疏水性氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制劑中存在的膚都不包含其中 多于80%的殘基為疏水性的具有20或更多個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列。
[0059] 所述一種或多種另外的碳?xì)膺B接的膚可包含運(yùn)樣的膚：長(zhǎng)度為至少20個(gè)氨基酸 殘基；包含至少50 %的疏水性氨基酸殘基；并且/或者具有大于或等于7的等電點(diǎn)。所述 第一碳?xì)膺B接的膚和/或一種或多種另外的碳?xì)膺B接的膚可包含運(yùn)樣的膚：在所述碳?xì)膺h(yuǎn) 端最后的15個(gè)連續(xù)氨基酸中包含帶正電的氨基酸；并且/或者不包含含有多于80%疏水 性氨基酸殘基的20個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明制劑中的膚都不具有小于7的等電點(diǎn)，在碳?xì)膺h(yuǎn)端的 最后15個(gè)連續(xù)氨基酸中不包含帶正電的氨基酸，并且/或者包含含有多于80%疏水性氨基 酸殘基的20個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列。
[0061] 在本發(fā)明的制劑中所述碳?xì)膺B接的膚通常W直徑小于0. 22ym的微團(tuán)存在。所述 微團(tuán)通常具有約15至約200皿，通常約20皿至約100皿，例如約20皿至約30皿或約30皿 至約50皿的直徑。然而，可存在一些更大的微團(tuán)。通常，不多于20%，例如約10%至約 15%的聚集體具有大于lOOnm的直徑。優(yōu)選地，所述碳?xì)膺B接的膚微團(tuán)的至少80%具有小 于100皿的直徑。微團(tuán)大小可通過(guò)任何合適的方法測(cè)定，例如通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射值L巧或使 用透射電子顯微術(shù)（TEM)。
[0062] 通過(guò)將所述碳?xì)膺B接的膚溶于酸性溶液可有助于微團(tuán)的形成。例如，如本文所述， 可將所述碳?xì)膺B接的膚溶于乙酸。用于制備可藥用制劑的本發(fā)明的水性制劑可W是酸性 的，具有例如5或更小的抑。
[0063] 本發(fā)明的可藥用制劑可W是干燥形式例如凍干形式。本發(fā)明的可藥用制劑可W為 水溶液，例如通過(guò)將凍干物或其他干燥的制劑溶于水性介質(zhì)形成的溶液。所述水溶液通常 是抑中性的。
[0064] 在本發(fā)明的水性（液體）制劑中，所述溶液通常是澄清的，沒(méi)有可見(jiàn)的聚集體。尤 其地，在通過(guò)縱滿和超聲處理擾動(dòng)后，所述溶液中沒(méi)有可見(jiàn)微粒。運(yùn)對(duì)所述酸