一種脫細(xì)胞腦組織三維支架的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)制備領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種脫細(xì)胞腦組織三維支架，其是通過(guò)使用堿性去離子水處理腦組織獲得。
【背景技術(shù)】
[0002]機(jī)體內(nèi)各種器官及組織可以視為由兩部分構(gòu)成:細(xì)胞和細(xì)胞外成分(也稱為細(xì)胞外基質(zhì)，簡(jiǎn)稱ECM)。大部分免疫原性的物質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)。相比單一或復(fù)合的人工合成生物分子材料，脫去細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)不僅有更接近天然的生物體內(nèi)的細(xì)胞外環(huán)境，而且最大程度保留了其生物活性，在組織工程中得到越來(lái)越多的重視和應(yīng)用。
[0003]對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)制備的研究始于20世紀(jì)90年代初，細(xì)胞外基質(zhì)制備是通過(guò)脫出組織細(xì)胞的方法去除存在于細(xì)胞內(nèi)的免疫原性成分，以得到可以用作相應(yīng)組織的替代物和支架材料的細(xì)胞外基質(zhì)。體內(nèi)諸多組織器官的構(gòu)成和特性不盡相同，針對(duì)這些組織器官都有各自適合的脫細(xì)胞方案，目前脫細(xì)胞基質(zhì)的研究多見(jiàn)于真皮、血管、膀胱等組織和器官，對(duì)于中樞神經(jīng)組織(包括大腦、小腦、腦干、延髓)的脫細(xì)胞基質(zhì)制備還鮮有報(bào)道。
[0004]組織的種類、來(lái)源、脫細(xì)胞方法和消毒滅菌方法都會(huì)對(duì)ECM造成影響。脫細(xì)胞的目標(biāo)是有效去除細(xì)胞和細(xì)胞核成分，同時(shí)使任何的副反應(yīng)減小到最小，保留ECM的機(jī)械完整性。目前常用的脫細(xì)胞方法包括基于物理作用的凍融、壓力處理法；基于酶的核酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶處理法；基于化學(xué)作用的Triton X_100、SDS、乙酸、氨水處理法等。這些方法均有較大的不足:凍融、壓力處理容易使ECM發(fā)生大量斷裂；各種酶處理容易破壞ECM的超微結(jié)構(gòu)并且酶難以從產(chǎn)品中去除；各種洗滌劑和酸堿同樣容易破壞超微結(jié)構(gòu)，并且可能損傷ECM膠原、糖胺聚糖(GAG)和生長(zhǎng)因子，各種有毒洗滌劑和酸堿試劑的使用也給后續(xù)的移植帶來(lái)隱患。這些問(wèn)題在處理組織柔軟、結(jié)構(gòu)疏松，質(zhì)地脆的中樞神經(jīng)組織時(shí)更為明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問(wèn)題，發(fā)明人提供了一種脫細(xì)胞腦組織三維支架，其是通過(guò)使用堿性去離子水處理腦組織獲得。
[0006]本發(fā)明中的“堿性去離子水”是指使用NaOH將pH調(diào)至9_10的去離子水。
[0007]—方面，本發(fā)明提供了一種脫細(xì)胞腦組織三維支架，其是通過(guò)使用堿性溶液處理大鼠腦組織獲得。
[0008]進(jìn)一步的方面，使用的堿性溶液為堿性去離子水。
[0009]進(jìn)一步的方面，具體制備步驟為:
[0010]原材料的獲取:
[0011]取大鼠，深度麻醉處死，在兩分鐘內(nèi)取出整個(gè)腦組織，在取出過(guò)程中，用PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)始終保持腦組織表面濕潤(rùn)；
[0012]脫細(xì)胞處理:
[0013]用去離子水清洗腦組織標(biāo)本3次，移至玻璃制培養(yǎng)皿中，加入堿性去離子水(pH9-10);每30分鐘更換新鮮堿性去離子水以保證培養(yǎng)皿中的液體清亮透明；待原材料完全呈透明狀后，使用PBS(0.0lM ;pH7.2?7.4)清洗3次，每次10分鐘；100Kunitz units DNA酶(I型DNase)處理I小時(shí)，PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)再次清洗3次，每次10分鐘；整個(gè)脫細(xì)胞處理過(guò)程在脫色搖床上室溫下進(jìn)行(60-80r/min);
[0014]交聯(lián)處理:
[0015]將經(jīng)上述處理的腦組織組織標(biāo)本移至預(yù)先配置好京尼平溶液中室溫下交聯(lián)48小時(shí)；
[0016]消毒:
[0017]在脫色搖床上(60rmp)使用PBS(0.0lM ;pH7.2?7.4)清洗交聯(lián)過(guò)的腦組織標(biāo)本3次，每次3分鐘；將清洗后的腦組織標(biāo)本投至1%。PAA中消毒6小時(shí)后，在脫色搖床上(60rmp)使用無(wú)菌PBS (0.0lM ;ρΗ7.2?7.4)再次清洗3次，每次3分鐘；得到的產(chǎn)品在4°C下，無(wú)菌PBS溶液內(nèi)保存。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1:按照本發(fā)明的方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架肉眼觀察圖，左為新鮮腦組織，中為脫細(xì)胞處理后的腦組織，右為脫細(xì)胞處理后的腦組織透明度示意圖。
[0019]圖2:按照本發(fā)明的方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架普通HE組織片染色(20Χ)，左為正常腦組織，右為支架。
[0020]圖3:按照本發(fā)明的方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架掃描電鏡圖，左為500倍，右為8000倍(聯(lián)合種子細(xì)胞3D培養(yǎng)實(shí)驗(yàn))。
[0021]圖4:按照本發(fā)明的方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架透射電鏡圖，13500倍。
[0022]圖5:按照本發(fā)明的方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架甲苯胺藍(lán)髓鞘成分染色圖，左圖為正常大腦組織，右圖為脫細(xì)胞處理所得支架。
[0023]圖6:對(duì)照I方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架外觀圖，左圖為氨水處理4小時(shí)，右圖為氨水處理24小時(shí)。
[0024]圖7:對(duì)照2方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架外觀圖。
[0025]圖8、9和10:對(duì)照3方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架外觀、普通HE組織片染色、甲苯胺藍(lán)髓鞘成分染色圖，左為正常腦組織，右為脫細(xì)胞處理后的支架。
[0026]圖11:對(duì)照4方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架掃描電鏡圖，左為1000倍，右為10000 倍。
[0027]圖12和13:對(duì)照5方法制備的脫細(xì)胞腦組織三維支架普通HE組織片染色圖和外觀圖，左為正常腦組織，右為脫細(xì)胞處理后的支架。
[0028]圖14:殘留DNA含量檢測(cè)電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1本發(fā)明脫細(xì)胞腦組織三維支架制備方法:
[0030]原材料的獲取:
[0031]取大鼠(性別不限，體重?280g)，深度麻醉處死，在兩分鐘內(nèi)取出整個(gè)腦組織，取出過(guò)程中盡可能避免銳利的硬腦膜及周圍骨贅殘端損傷中樞神經(jīng)組織；在取出過(guò)程中，用PBS(0.0lM ；pH7.2?7.4)始終保持腦組織表面濕潤(rùn)；取出后直接開(kāi)始脫細(xì)胞處理，也可以40CT PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)中儲(chǔ)存(但儲(chǔ)存時(shí)間不能超過(guò)24小時(shí))；
[0032]脫細(xì)胞處理:
[0033]整個(gè)脫細(xì)胞處理過(guò)程在脫色搖床上室溫下進(jìn)行(60-80r/min);用去離子水清洗腦組織標(biāo)本3次，移至玻璃制培養(yǎng)皿中(直徑約8-lOcm)，加入堿性去離子水(pH 9-10);每30分鐘更換新鮮堿性去離子水以保證培養(yǎng)皿中的液體清亮透明；待原材料完全呈透明狀后(這一過(guò)程時(shí)間根據(jù)標(biāo)本體積而定，2 X 5 X 5mm大小體積需要約3小時(shí)，整個(gè)小腦需要約30小時(shí)，大腦半球需要約70小時(shí))，使用PBS (0.0lM ;pH7.2?7.4)清洗3次，每次10分鐘；100Kunitz units DNA 酶(I 型 DNase 美國(guó)，Sigma-Aldrich 公司)處理 I 小時(shí)，PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)再次清洗3次，每次10分鐘；
[0034]交聯(lián)處理:
[0035]整個(gè)交聯(lián)過(guò)程在室溫下進(jìn)行；將經(jīng)上述處理的腦組織組織標(biāo)本移至預(yù)先配置好京尼平(genipin，0.5%，日本，Wako公司)溶液中交聯(lián)48小時(shí)(標(biāo)本由白色變成藍(lán)色)。
[0036]消毒:
[0037]使用PBS (0.0lM