針對扇頭蜱屬蜱的疫苗的制作方法
【專利說明】針對扇頭蜱屬蜱的疫苗
[0001] 本發(fā)明一般涉及寄生蟲學和免疫學領域，并且特別地涉及針對扇頭蜱屬 (Rhipicephalus)蜱的疫苗。特別地，本發(fā)明涉及包含第一和第二蛋白質的組合物，此類組 合物作為針對扇頭蜱屬蜱的疫苗的用途，以及第一經分離的蛋白質和第二經分離的蛋白質 用于針對扇頭蜱屬蜱給靶疫苗接種的用途。
[0002] 體外寄生蟲侵襲是當今人和獸醫(yī)衛(wèi)生的重要問題，因為它具有顯著的福利和經濟 影響。體外寄生蟲是非常多樣的，但最有關的害蟲是節(jié)肢動物，例如：昆蟲如蒼蠅和蚊子， 或蛛形綱動物如蜱和螨。體外寄生蟲在其一個或多個發(fā)育階段與人或動物宿主接觸，以宿 主為食，并且這可以是短暫的、延長的和/或反復的接觸。許多體外寄生蟲在其一個或多個 發(fā)育階段以來自宿主的血液為食；因此它們被稱為血食性動物（haematophores)或食血動 物（sanguivores)。這類寄生現(xiàn)象具有許多負面效果，其可以從簡單的煩惱到死亡原因而不 同。這是因為寄生蟲-宿主接觸涉及各種力學和生物學相互作用：體外寄生蟲刺穿皮膚可 以引起皮疹或炎癥；寄生蟲在其叮咬后可以用其唾液注射許多生物學化合物，以維持血液 流動，壓制免疫應答，并且掩蔽知覺，這些物質可以引起過敏反應；通過數(shù)以千計的體外寄 生蟲隨時間的反復血液消耗可以促使宿主變得貧血；并且寄生蟲還可以是微觀病原體的媒 介，所述微觀病原體可以從寄生蟲的口器、唾液或其排泄物感染宿主。被傳播的病原體可以 在宿主中引起所謂的節(jié)肢動物媒介傳播(蟲媒_)疾病。
[0003] 對宿主的后果可以是：長時間的壓力、寄生蟲因子誘導的毒性、來自對獸皮或 皮膚叮咬或繼發(fā)感染的物理損害、貧血和/或伴隨例如通過下述的廣泛多樣傳播疾病的 感染，例如：由細菌或立克次氏體（Rickettsia)例如：疏螺旋體（Borrelia)、埃利希體 (Ehrlichia)、或微粒孢子蟲（Anaplasma);由病毒例如黃病毒、布尼亞病毒或呼腸孤病毒 引起：登革熱、黃熱病、腦炎、藍舌病等；或由原生動物和蠕蟲例如：瘧原蟲（Plasmodium)、 巴貝蟲（Babesia)、錐體蟲（Trypanosomes)、利什曼原蟲（Leishmania)、絳蟲、扁形蟲、線蟲 (nematodal worm)等。還存在此類疾病從動物人畜共患擴散到人的真實危險。
[0004] 體外寄生蟲侵襲因此影響人或動物宿主的一般健康幸福。對于農業(yè)相關的動物宿 主，這嚴重影響其經濟性能，例如在其飼料轉化和生長率方面，以及在其肉、蛋、乳、羊毛、獸 皮和后代數(shù)目的數(shù)量和質量方面。
[0005] 具有顯著的獸醫(yī)和人畜共患病相關性的節(jié)肢動物體外寄生蟲是扇頭蜱屬的蜱。 這些是硬骨蜱(硬蜱科（Ixodidae))，其以各種哺乳動物為食，所述哺乳動物為野生動物 例如鹿、羚羊和數(shù)個嚙齒類動物物種；以及馴養(yǎng)家畜例如牛、馬、驢、山羊、綿羊、豬和犬。 一些扇頭蜱屬蜱對于特定的宿主物種具有偏好，例如通過血紅扇頭蜱（Rhipicephalus sanguineus)對于犬的偏好(黃狗蜱或犬舍蜱（kennel tick))。經濟上更重要的是以牛 為食的扇頭蜱屬蜱，例如：非洲扇頭蜱（R. appendiculatus)(棕色耳蜱)，以及來自牛蜱 (Boophilus)亞屬的蜱，例如：微(牛皮蜱)小扇頭蜱（R. (Boophilus)microplus)(南部牛蜱， 其也以其舊名稱已知：微小牛蜱（Boophilus microplus))，和具環(huán)方頭蜱（R. (Boophilus) annulatus)(北美蜱）。
[0006] 扇頭蜱屬蜱存在于全世界，但主要在（亞）熱帶地區(qū)。它們可以是廣泛多樣的疾病 的攜帶者，其中一些疾病是人畜共患病，例如巴貝蟲、泰勒蟲（Theileria)、微粒孢子蟲、柯 克斯體（Coxiella)、疏螺旋體、立克次氏體、納依羅病毒（Nairovirus)等。
[0007] 蜱隨季節(jié)或區(qū)域環(huán)境變化而出現(xiàn)，并且具有不同的生命周期階段：卵、幼蟲、若蟲 和成蟲。整個周期平均花費2 - 4周，并且每個階段展示了蜱身體的特定形態(tài)特征，例如口 器和背板。通常還是蜱的可動性，反映了蜱附著其宿主且從其宿主脫離的次數(shù)。關于綜述， 參見 Barker & Murrell (2002，Exp. & Appl. Acarol?，第 28 卷，第 55 頁）。
[0008] 在減少通過蜱的侵襲及其后果的嘗試中，隨著時間已應用了各種措施，一些措施 比其它的更成功。最有效的是驅避、殺死或損害蜱的化學藥物例如殺螨劑的使用。這些可 以外部應用于宿主，例如作為噴霧、澆潑或者通過經口或腸胃外途徑，并且作用于宿主身體 上或其內。經過過去一個世紀，已開發(fā)了用于該目的的廣泛多樣的殺螨藥物。
[0009] 此類化學抗寄生蟲藥的應用的主要缺點是蜱中的抗性的發(fā)展，這使得這些化合物 隨著時間過去較不有效。因此，有時需要每數(shù)周處理家畜，這是勞動密集和昂貴的。另外， 還存在其它問題例如：害怕對于使用者的毒性、對于宿主的副作用、在動物產品（肉、乳、獸 皮）中的殘留、以及環(huán)境問題。這由Otranto & Wall (2008，Med. and Vet. Entomol?，第 22卷，第291頁）綜述。
[0010] 作為化學抗寄生蟲藥的可選替代，疫苗接種已測試多年，然而，僅具有中等的成 功。體外寄生蟲疫苗應提供蜱數(shù)目中的減少，或其中它們附著至宿主或以宿主為食的持續(xù) 時間的減少。這還會減少體外寄生蟲侵襲可以對宿主造成的副作用，例如：獸皮損害、貧血、 毒性或傳播疾病的感染。另外，這會減少蜱的生殖力（雌性蜱可產生的卵數(shù)目、重量和活力 方面)，這減少了對獸群和/或地理區(qū)域中的總體侵襲壓力。
[0011] 蜱疫苗的功效可以以其"擊倒作用"來表示，意指通常通過觀察到更少的成蟲的侵 襲水平中的可視減少。最可能地，這通過對幼蟲和若蟲的致命作用引起。
[0012] 疫苗針對heamatophagous體外寄生蟲的作用機制是間接的：體外寄生蟲的宿主 是使用來自體外寄生蟲的抗原的疫苗接種的靶，從而特異性抗體在靶的血液中發(fā)展。隨后 以接種疫苗的宿主血液為食的體外寄生蟲因此攝取這些抗體。當疫苗抗原衍生自寄生蟲的 必需生物分子時，這些抗體將破壞寄生蟲內的必需生物過程，其損害了寄生蟲的生長和繁 殖（Willadsen，2004, Parasitology，第 129 卷，第 S367 頁）〇
[0013] 因為來自血液膳食的抗體需要一些時間發(fā)揮其對體外寄生蟲的作用，所以此類疫 苗不能如一些化學驅螨劑一樣，阻止接種疫苗的宿主和體外寄生蟲之間的初始接觸。然而， 這類疫苗可以有效針對在相同宿主上停留延長時間(數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周）的體外寄生蟲，例 如扇頭蜱屬蜱。
[0014] 針對體外寄生蟲的首個疫苗是完整寄生蟲或特異性身體部分的粗糙勻漿物。隨 后，測試更特異性的蛋白質抗原。大多數(shù)這些疫苗作為佐劑化的油包水乳狀液使用。這些疫 苗使用暴露或隱蔽抗原；暴露抗原是當體外寄生蟲進行接觸時，由宿主的免疫系統(tǒng)"看見" 的抗原，例如來自其口器或唾液的抗原。隱蔽抗原是對于體外寄生蟲更內部且因此通常不 呈遞給宿主的免疫系統(tǒng)的抗原。因而，針對暴露的寄生蟲抗原的免疫通過與體外寄生蟲接 觸天然地定期得到加強；針對隱蔽的寄生蟲抗原的免疫需要人工加強。
[0015] 在針對扇頭蜱屬蜱的疫苗中，過去已測試了隱蔽的腸相關蛋白質。這已導致了僅 有的體外寄生蟲疫苗的開發(fā)，所述體外寄生蟲疫苗自從二十世紀九十年代以后商購可得 用于獸醫(yī)用途：TickGARD?(Intervet，Bendigo,澳大利亞）、以及 Gavac?(Heber Biotec， Havana，Cuba ;Revetmex，墨西哥)。這些疫苗是在牛祀中使用的佐劑化的油包水乳狀液。它 們采用來自微小(牛皮蜱)扇頭蜱的中腸的隱蔽抗原：Bm86,或其同系物Bm95,其在重組表達 系統(tǒng)(分別地大腸桿菌（Escherichia coli)，巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris))中產生。 兩種疫苗均使微小（牛皮蜱）扇頭蜱的活力和繁殖減少至一定程度。因此，這些疫苗主要用 于其中通過殺蟲劑抗性扇頭蜱屬蜱的侵襲高發(fā)的地理地區(qū)。關于綜述參見：De la Fuente 等人（2007, Anim. Health Res. Rev?，第 8 卷，第 23 頁）。
[0016] Bm86是位于微?。ㄅＦを纾┥阮^蜱的中腸上皮的腔側處的糖蛋白。Bm86在TO 88/03929中首次得到描述。全長Bm86具有約650個氨基酸和約89 kDa的表觀Mw。蛋白 質具有N末端信號序列、C末端跨膜區(qū)和多個EGF樣結構域（Lee & 0pdebeeck，1994, Int. J. of Paras?，第 25 卷，第 241 頁；Kamau 等人，2011，Insect Mol. Biol?，第 20 卷，第 105 頁)。它在蜱生物學中的功能是未知的。
[0017] 假定Bm86特異性抗體在血液膳食中且可能是補體因子，與蜱的腸細胞上的Bm86 蛋白質結合且起始損害腸的過程（Kemp等人，1989，Exp. Appl. Acarol.，第7卷，第43頁)。
[0018] 盡管使用的命名不是非常一致，Bm86及其同系物的許多氨基酸序列是例如由 GenBank可公開獲得的：得自除微小扇頭蜱外的其它扇頭蜱屬物種的同源蛋白質可以被稱 為Bm86蛋白質或Bm86樣蛋白質，或以其自身物種代碼命名，例如關于得自血紅扇頭蜱的 Bm86同源蛋白質命名為Rs86。在文獻中，來自不同物種的同源蛋白質有時被稱為"直向同 源物"。
[0019] Bm86的同源物已在硬蜱科的所有屬中發(fā)現(xiàn)，并且它們的氨基酸序列是相當保守 的；在扇頭蜱屬內，在Bm86同源物之間的氨基酸序列同一性水平為至少約71% (Nijhof等 人，2010, Int. J. for Parasit.，第40卷，第1587頁）。從全世界(澳大利亞、非洲、墨西 哥、南美洲）收集的微小扇頭蜱中分離的Bm86的同系物共享至少約82%的氨基酸序列同一 性水平（Canales 等人，2008, BMC Biotech.，vol. 8, doi: 10. 1186/1472-6750-8-14)。由 于該高保守水平，用來自一個扇頭蜱屬蜱物種的Bm86同系物的疫苗接種將還保護以針對 其它扇頭蜱屬蜱。
[0020] 來自Bm86蛋白質的保護性保守表位已得到描述（Odongo等人，2007, Vaccine，第 25 卷，第 1287 頁；Kopp 等人，2010, Vaccine，第 28 卷，第 261 頁）。
[0021] 為了改善基于Bm86的體外寄生蟲疫苗的功效，已考慮了幾種可能性，僅測試了其 中一些。
[0022] 一個選項是改善現(xiàn)有疫苗的制劑。這在TickGARD Plus ?(Intervet，Bendigo,澳 大利亞）中應用（匿名，2002, Aust. Vet. J.，第80卷，第394頁）。
[0023] 另一個選項是使用可選替代的疫苗抗原，例如來自蜱的不同部分，例如口器或血 淋巴（heamolymph)。潛在候選疫苗的幾個列表已得到公開，例如：Almazan等人（2003， Vaccine，第 21 卷，第 1492-1501 頁）;Willadsen(2004,同上）;De la Fuente & Kocan(2006， ?已抑3.1臟1111〇1.，第28卷，第 275);?&1'12；[等人（2009，1^￥.1^&8.?&抑8；[1:01.￥61:.，第 18卷，第1頁）；和41111&2&11等人（2010，？&抑8.1^8.，第106卷，第471頁） 。
[0024] 其它人已提議采用組合；在綜合蜱防治策略中的化學療法和疫苗接種的組合 (Otranto & Wall，2008,同上)，或多組分疫苗中的抗原組合。
[0025] 與此同時已測試了兩種隱蔽抗原的幾個組合；盡管在一些情況下發(fā)現(xiàn)了陽性效 果，但未觀察到疫苗接種效果在任何附加保護方面的總體改善。測試的組合的例子是：Bm86 和Bm91 (來自微?。ㄅＦを?扇頭蜱的羧肽酶）（Willadsen等人，1996，Paras. Immunol.，第 18 卷，第 241 頁）；Bm86 和 BMA7 (粘蛋白樣糖蛋白（McKenna 等人，1998, Paras. Immunol.， 第20卷，第325頁）；以及Bm86和5'核苷酸酶（Hope等人，2010, Paras. Immunol.，第32 卷，第135頁)。一項研究使用RNAi方法，測試來自Rs86 (Bm86同系物）和Subolesin的 1111?熟沉默（(16 1&?1161^6等人，2006，？&抑8.1^8.，第99卷，第108頁）。
[0026] Subolesin也稱為4D8,是具有約20 kDa的表觀Mw的蛋白質，并且在扇頭蜱屬內， Subolesin具有約161個氨基酸。這種蛋白質的確切作用未知，但它在蜱的不同組織中被 發(fā)現(xiàn)：唾液腺、腸和生殖組織。作為隱蔽抗原，它甚至比Bm86更少得到表征，盡管它看起 來在節(jié)肢動物中具有更廣泛的存在（De la Fuente等人，2006, Vaccine，第24卷，第4082 頁)。Subolesin對于在細胞中的核定位具有偏好；這與下述事實一致：在昆蟲中發(fā)現(xiàn)的 Subolesin的直向同源物來自是轉錄因子的Akirin蛋白質家族（Galindo等人，2009, Dev. Comp. Immunol?，第 33 卷，第 612 頁）。
[0027] Subolesin同源蛋白質的大量氨基酸序列在GenBank中可獲得。通常，它們被稱 為Subolesin或4D8蛋白質，與其蜱起源無關。來自各個扇頭蜱屬物種以及來自各種地理 地區(qū)的Subolesin蛋白質的分析揭示這些蛋白質是充分保守的，并且共享至少約85%的氨 基酸序列同一性水平（De la Fuente等人，2006, Vaccine，同上)。
[0028] 已通過來自接種Subolesin疫苗宿主的特異性抗體或通過RNAi方法的基因沉默， 實驗地壓制在扇頭蜱屬蜱中的Subolesin功能。這顯著地干擾了蜱的生長和發(fā)育，例如它 的血液膳食消化、產卵、蛻皮和存活。Subolesin已用作疫苗抗原，并且已提議用于含有大量 潛在疫苗候選物中的一種或多種的組合疫苗中。關于綜述：De la Fuente等人（2011，Vet. Path.，第181卷，第17頁)。Subolesin的保護性表位已得到作圖（Prudencio等人，2010， Vaccine，第 28 卷，第 5398 頁）。
[0029] 然而，迄今為止未描述使用Subolesin針對蜱的成功的組合疫苗。有趣的是，在它 們在該領域中的最近期努力中，De la Fuente和同事已不再測試組合疫苗，并且已回到使 用Subolesin或Bm86蛋白質的單一疫苗，并且建議將此類單一疫苗與其它蜱控制措施例如 殺蟲劑的使用組合（Carreon等人，2012, Vaccine，第30卷，第273頁)。
[0030] 值得注意的是盡管使用不同抗原和組合的所有努力和建議，來自蜱疫苗的三十年 研究結果充其量是表現(xiàn)平平的。這導致TickGARD?的創(chuàng)造者且是該領域中的資深科學家之 一的Dr. P. Willadsen得出結論：基于抗原混合物的蜱疫苗充其量是"有效假設"(盡管未 得到證明)，但在大多數(shù)情況下是"未核實的希望"。在"此類混合物顯示增強功效"的假定 上，它評論說："然而，關于它的實驗證據(jù)是極度匱乏且矛盾的"。（Willadsen，2008, Trends in Paras?，第 24 卷，第 164 - 167 頁）。
[0031] 因而，該領域具有關于針對扇頭蜱屬蜱的更有效疫苗的迫切需要。因此本發(fā)明的 目的是克服現(xiàn)有技術中的缺點，并且通過提供針對扇頭蜱屬蜱的改善疫苗適應本領域的這 種需要。
[0032] 驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過使用來自扇頭蜱屬蜱的兩種蛋白質抗原Bm86和Subolesin、或 者其同系物或免疫原性片段，但僅當兩種蛋白質分別呈遞給靶的免疫系統(tǒng)時，可以滿足該 目的并且因而可以克服現(xiàn)有技術的缺點。當兩種蛋白質在簡單混合物中組合時，僅形成適 度水平的抗體，并且主要針對Bm86。此類疫苗接種僅部分保護免于作為攻擊侵襲置于牛宿 主上的扇頭蜱屬蜱。
[0033] 然而，當Bm86和Subolesin同時呈遞給靶的免疫系統(tǒng)，但彼此物理分開時，本發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)靶形成了針對兩種蛋白質各自的高水平的抗體。這些抗體具有令人驚訝的有利的組 合效果，導致接種疫苗宿主針對用扇頭蜱屬蜱的攻擊侵襲的強免疫保護。在一些情況下，觀 察到幾乎完全的擊倒作用。
[0034] 這個發(fā)現(xiàn)目前可以投入針對扇頭蜱屬蜱的疫苗中的有利使用，其基本上以兩種方 式：即通過這兩種蛋白質的單一或雙重施用。
[0035] 當兩種蛋白質在單一施用中應用時，它們需要以這樣的方式配制，使得它們在最 終疫苗組合物中保持彼此物理分開。
[0036] 可選地，當兩種蛋白質在雙重施用中應用時，它們需要同時但在身體的不同位置 上、通過不同途徑或通過不同方法施用。
[0037] 未知兩種蛋白質Bm86和Subolesin、或者其同系物或免疫原性片段為何需要分開 呈遞給靶的免疫系統(tǒng)，以便實現(xiàn)體液免疫系統(tǒng)的足夠刺激用于克服蜱侵襲。盡管本發(fā)明人 不希望受可能解釋這些觀察的任何理論或模型束縛，但它們推測原因可能是這兩種蛋白質 之間的一定形式的干擾，由此其中一種對于靶的免疫系統(tǒng)掩蔽另一種。
[0038] 因而，在本發(fā)明之前，技術人員將采用兩種蛋白質的簡單組合，這無法實現(xiàn)有效的 免疫保護。本發(fā)明人認為這是為何現(xiàn)有技術中未描述在蜱疫苗中使用Bm86和Subolesin 抗原的組合的原因，更不用說此類使用的任何成功疫苗接種結果。
[0039] 關于兩種蛋白質抗原作為單一施用的應用： 在第一個方面，本發(fā)明涉及包含第一經分離的蛋白質和第二經分離的蛋白質的組合 物，其中所述第一經分離的蛋白質包含與根據(jù)SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有至少71% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二經分離的蛋白質包含與根據(jù)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少96%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中兩種蛋白 質彼此物理分開。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的組合物的第一經分離的蛋白質和第二經分離的蛋白質均為抗原，并 且能夠誘導免疫應答。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物是抗原組合物。根據(jù)本發(fā)明的組合物可 以有利地用于產生針對扇頭蜱屬蜱的疫苗。
[0041] 如本文使用的，術語"包含（comprising)"（以及變化例如"包含（comprise)"、"包 含（comprises)"和"包含（comprised)"）指由該術語在其中使用的正文部分、段落、權利要 求等涵蓋或包括的，對于本發(fā)明可設想的所有元素以及任何可能組合，即使此類元素或組 合未明確敘述；并且并非指此類元素或組合中任一種的排除。因而，任何此類正文部分、段 落、權利要求等還可以涉及一個或多個實施方案，其中術語"包含"（或其變化）替換為術語 例如"由......組成（consist of)"、"由......組成（consisting of)"或"基本上由......組成
[0042] 對于本發(fā)明，指示"第一"和"第二"僅為了便于提及而使用，并且不指示任何數(shù)字 次序或依存關系。
[0043] 術語"經分離的"應解釋為：通過故意行為或人為干預，例如通過用于生物化學純 化的體