使用微rna和egfr-tki抑制劑的聯(lián)合癌癥治療的制作方法
【專利說明】使用微RNA和EGFR-TKI抑制劑的聯(lián)合癌癥治療 相關(guān)申請
[0001] 本申請要求2013年3月15日提交的美國序列號61/787,558和2014年1月15 日提交的美國序列號61/927, 543申請的優(yōu)先權(quán)，其均通過引用全文并入本文。 序列表
[0002] 本申請包含已經(jīng)以ASCII格式電子提交并通過引用全文并入于此的序列表。創(chuàng)建 于2014年3月11日的所述ASCII拷貝被命名為112172-201_SL.txt并且大小為26, 427 個字節(jié)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及癌癥治療，更具體地涉及使用微RNA(microRNA)和EGFR-TKI抑制劑的 聯(lián)合癌癥治療。
【背景技術(shù)】
[0004] 肺癌在男性和女性癌癥相關(guān)死亡中均占最多數(shù)。預(yù)期在2012年估計有約220, 000 例肺癌新病例，占全部癌癥診斷的約14%(CancerFacts&Figures2012,Society)。肺癌 是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，2012年總數(shù)估計有160, 000例死亡，相當(dāng)于全部癌癥死亡的 約28%。肺癌分為兩個主要類別。小細(xì)胞肺癌（SCLC)影響到20%的患者而非小細(xì)胞肺 癌（NSCLC)影響到約80%。NSCLC包括三個主要類型：腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌，其中 肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌占所有肺癌的絕大部分（參見，例如，F(xiàn)orgacs等人，PatholOncol Res, 2001. 7(1) :6-13;Sekido等人，BiochimBiophysActa, 1998. 1378(1) :F21-59)。治療 包括手術(shù)、放射治療、化療和靶向治療。對于局部NSCLC，手術(shù)通常是所選的治療，并且通過 手術(shù)后給予化療提高了這些患者中大多數(shù)的存活率。根據(jù)癌癥基因型或疾病的階段使用靶 向治療，革巴向治療包括貝伐珠單抗（Avastin?，Genentech/Roche)---種革巴向VEGF-A的 人源化單克隆抗體，埃羅替尼（Tarceva?，Genentech/Roche)---種EGFR酪氨酸激酶抑 制劑（EGFR-TKI)，和克唑替尼（crizotinib) (Xalkori?，Pfizer)--ALK(間變性淋巴瘤 激酶）和R0Sl(c-r〇s癌基因，受體酪氨酸激酶）的抑制劑?？诉蛱婺嵋驯籉DA批準(zhǔn)用于治 療某些晚期（局部晚期或轉(zhuǎn)移性）非小細(xì)胞肺癌，并限于表達突變的ALK基因的那些。貝 伐珠單抗已被首次批準(zhǔn)在一線晚期非鱗狀NSCLC中與卡鉑/紫杉醇化療聯(lián)合使用。此后， 美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NationalComprehensiveCancerNetwork)推薦貝伐珠單抗作為 與任何基于鉑的化療相聯(lián)合的標(biāo)準(zhǔn)一線治療，隨后維持貝伐珠單抗直至疾病進展（Sandler 等人，NEnglJMed, 2006. 355 (24) : 2542-50)。
[0005] 埃羅替尼獲得了美國食品和藥物管理局（FDA)的快速通道批準(zhǔn)，用于在先前 的傳統(tǒng)化療方案失敗后的NSCLC患者（Cohen等人，Oncologist, 2005. 10 (7) : 461-6 ; Cohen等人，Oncologist, 2003. 8 (4) : 303-6)。它是EGFR激酶的可逆抑制劑，被設(shè)計 為充當(dāng)在EGFR激酶的活性位點處的ATP結(jié)合的競爭性抑制劑（Sharma等人.NatRev Cancer，2007. 7 (3) : 169-81)。吉非替尼是在美國之外的國家中使用的另一種EGFR-TKI 藥劑。雖然不存在比較吉非替尼與埃羅替尼的直接對比效果試驗，但數(shù)據(jù)表明它們之間 沒有大的治療差異（Pao等人，NatRevCancer, 2010. 10(11) :760-74)。使用EGFR-TKI 的早期臨床試驗在一定程度上是令人鼓舞的，其中在約10-20%的接受治療的NSCLC患 者中觀察到部分反應(yīng)（Fukuoka等人.JClinOncol, 2003. 21 (12) :2237-46)。藥物 反應(yīng)更常發(fā)生于女性、從不吸煙者、亞裔患者和診斷為腺癌或具有支氣管肺泡組織學(xué) 的那些人（Fukuoka等人，JClinOncol, 2003. 21 (12) :2237-46;Bell等人，JClin Oncol，2005. 23(31) :8081-92)。值得注意的是，這兩種藥物僅使患者總體存活期延長約2 個月，它們由于原發(fā)性或獲得性的繼發(fā)性抗性而失去功效（Sharma,同上；Shepherd等人，N EnglJMed, 2005. 353 (2) : 123-32)。
[0006] 吉非替尼和埃羅替尼的不夠理想的反應(yīng)率已引發(fā)了多項研究來評估反應(yīng)性與抗 性患者人群的遺傳背景。臨床試驗的追溯分析揭示，EGFR表達水平與對吉非替尼的反應(yīng) 不相關(guān)（Bell，同上）。相反，對所述藥物有反應(yīng)的患者經(jīng)常在EGFR激酶結(jié)構(gòu)域中具有激 活突變（同上）。然而，少于50%的具有EGFR突變的患者產(chǎn)生反應(yīng)，表明還存在另外的決 定對EGFR-TKI的敏感性的因素。原發(fā)性抗性或繼發(fā)性抗性與以下因素相關(guān)：（l)K-RAS突 變，它可與EGFR突變共同存在，盡管K-RAS與EGFR突變似乎是顯著相互排斥的（Gazdar 等人，TrendsMolMed, 2004. 10 (10) :481-6;Pao等人，PLoSMed，2005.2(l):el7); (2)c-Met( -種向PI3K途徑發(fā)信號的受體酪氨酸激酶）的擴增和超表達，代替EGFR 的失活（Engelman等人，Science, 2007. 316(5827) :039-43) ; (3)EGFR的催化域中第 二突變的獲得（通常是T790M)(Pao等人·PLoSMed, 2005. 2 (3) :e73)，（4)BRAF突變 (Pratilas等人，CancerRes，2008.68(22):9375-83) ;(5)ALK易位（Shaw等人，JClin Oncol, 2009. 27(26):4247-53) ; (6)肝細(xì)胞生長因子（HGF)超表達，其為MET受體的配 體（Yano等人，CancerRes, 2008. 68(22) :9479-87) ; (7)其他EGFR突變的存在（在外顯 子 20 中的小插入或復(fù)制：D770_N771、insNPG、insSVQ、insG和N771T)(Wu等人，Clin CancerRes, 2008. 14(15):4877-82);以及（8)影響EGFR下游的信號傳導(dǎo)的遺傳損傷，包 括PIK3CA(Engelman等人，JClinInvest, 2006. 116(10) :2695-706;Kawano等人，Lung Cancer, 2006. 54 (2): 209-15)，PTEN(Sos等人，CancerRes, 2009. 69 (8) :3256-61)、IGF1R 和KDM5A(Gong等人，PLoSOne, 2009. 4(10)e7273;Sharma等人，Cell. 141(1) :69-80)的損 失。T790M突變發(fā)現(xiàn)于約50%的具有獲得性抗性的EGFR突變腫瘤中；KRAS突變發(fā)生于全部 NSCLC的15-25%中；突變的BRAF和ALK易位分別發(fā)現(xiàn)于2-3%和5%的NSCLC中（Pao等 人，NatRevCancer, 2010. 10(11) :760-74)。因此，有可能對EGFR-TKI治療有反應(yīng)的NSCLC 患者的百分比相對較小?？赡艽嬖诮閷?dǎo)對EGFR抑制劑的抗性的其他尚未鑒定的分子決定 因素。
[0007] 作為單一治療劑的埃羅替尼的適度功效要求這些EGFR-TKI與其他治療方案聯(lián) 合使用。ΠΙ期臨床試驗TRIBUTE/TALENT試驗（其研究埃羅替尼與順鉑/吉西他濱或 卡鉑/紫杉醇組合的效果）未能證明該藥物相對于單獨的傳統(tǒng)化療的存活益處（Sharma， 同上；Herbst等人，JClinOncol, 2005. 23(25) :5892-9 ;以及Giaccone等人，JClin Oncol, 2004. 22(5) :777-84 ;以及Herbst等人，JClinOncol, 2004. 22(5) :785-94)。因 此，目前正在將埃羅替尼與在臨床前研究中顯示有前景的結(jié)果的其他靶向小分子抑制劑組 合進行測試，這樣的抑制劑抗mTOR和MET(Pao,同上）。該策略在具有EGFR-TKI抗性的患 者中是否有效仍有待確定。可獲得的數(shù)據(jù)表明抗性腫瘤由在已經(jīng)攜帶抗性基因的突變的未 經(jīng)處理的腫瘤中的稀有細(xì)胞引起，而這些亞群被選擇用于TKI治療的整個過程（同上）。也 有可能未經(jīng)處理的腫瘤已經(jīng)顯示出EGFR-TKI抗性細(xì)胞的異基因譜，表明靶向治療的單一 藥物組合將不足以用于有效治療。相反，若干組合的順序使用對于消除在先前治療過程中 經(jīng)歷陽性選擇的抗性腫瘤可能是必要的。
[0008] 因此，盡管在肺癌的治療中已取得進展，但肺癌患者的存活率仍然極低。目前的靶 向治療諸如EGFR-TKI前景可觀，但由于原發(fā)性和繼發(fā)性抗性的存在或發(fā)展而在單一治療 中缺乏滿意的功效。EGFR抑制劑與其他靶向治療的聯(lián)合使用可有助于EGFR抑制劑的功效， 并且可以幫助克服或阻止抗藥性。
[0009] 初步研究表明，某些miRNA可在體外使癌細(xì)胞致敏（在Bommer等人，Curr Biol, 2007. 17 (15) : 1298-307中評述）。例如，let-7能夠使肺癌細(xì)胞對基于TRAIL的吉西他 濱或放射治療敏感（Li等人，CancerRes, 2009. 69 (16) : 6704-12 ;0vcharenko等人，Cancer Res, 2007. 67(22):10782-8;Weidhaas等人，CancerRes, 2007. 67(23):11111-6)。類 似地，miR-34提高了傳統(tǒng)治療在前列腺、結(jié)腸、腦、胃、膀胱和胰腺的癌細(xì)胞系中的功 效（Fujita等人，BiochemBiophysResCommun, 2008. 377(1):114-9;Ji等人，PLoS One, 2009. 4(8) :e6816;Kojima等人，Prostate. 70(14) :1501-12.Akao等人，Cancer Lett.300 (2):197-204;Weeraratne等人，NeuroOncol. 13(2):165-75Ji等人，BMC Cancer, 2008. 8:266;以及Vinall等人，IntJCancer，2011.130(ll):2526-38)。然而，仍 然不存在任何埃羅替尼/miRNA組合在肺癌的細(xì)胞和動物模型中的示例。
[0010]近來，Zong等人（Chemico-BioInterac. 2010, 184:431-438)已經(jīng)測試了let_7a、 miR-126和miR-145使吉非替尼抗性細(xì)胞系A(chǔ)549和H460對吉非替尼敏感的能力。IC5。的最 大降低通過H440細(xì)胞中的miR-126而實現(xiàn)（約7倍），而其余的條件僅導(dǎo)致IC5。降低2-3 倍（參見Zhong(同上）中的表2) 〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：某些微RNA可在EGFR-TKI抗性細(xì)胞系中一致地上調(diào) 或下調(diào)，以及微RNA和EGFR-TKI藥劑的特定組合可具有有利的和/或出乎意料的結(jié)果，例 如由于它們在處理某些癌細(xì)胞中尤其有效（例如，協(xié)同作用或具有大于累加效應(yīng)的效果）。 因此，本發(fā)明在各個方面和實施方案中包括使細(xì)胞、組織和/或生物與微RNA和EGFR-TKI 藥劑的特定組合相接觸。更具體地，本發(fā)明可包括使癌細(xì)胞、癌組織和/或患有癌癥的生物 與微RNA和EGFR-TKI藥劑的這樣的組合相接觸。所述方法可以是實驗性的、診斷性的和 /或治療性的。所述方法可用于抑制或減少細(xì)胞（包括組織或生物中的細(xì)胞）的增殖。微 RNA可以是例如在EGFR-TKI抗性細(xì)胞系中一致地下調(diào)或上調(diào)的微RNA的模擬物或抑制劑。
[0012] 因此，在各個方面和實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有癌癥的受試者的方法。在 某些實施方案中，該方法包括：向所述受試者施用EGFR-TKI藥劑，以及向所述受試者施用 miR-34、miR-126、miR-124、miR-147和miR-215的微RNA模擬物。類似的方法包括：使細(xì)胞 或組織（例如，癌細(xì)胞或癌組織如腫瘤）與EGFR-TKI藥劑相接觸（例如，處理），以及使所 述細(xì)胞或組織與miR-34、miR-126、miR-124、miR-147和miR-215的微RNA模擬物相接觸。 所述微RNA可包含與SEQIDN0:1-6 和 168-179 (miR-34、miR-126、miR-124、miR-147 和 miR-215,及其家族成員、功能同源物、種子序列或共有序列）中的至少一個至少80% (或 85%、90%、95%、100% )相同的序列。這些以及其他微RNA可包含天然核酸、其衍生物和 化學(xué)修飾形式以及核酸類似物。
[0013] 在各個方面和實施方案中，本發(fā)明提供了向受試者（例如，患有癌癥的受試者）施 用EGFR-TKI藥劑以及向所述受試者施用在附錄A中以SEQIDN0:8-122列出的微RNA(下 調(diào)的微RNA)的微RNA模擬物的方法。類似的方法包括使細(xì)胞或組織（例如，癌細(xì)胞或癌 組織如腫瘤）與EGFR-TKI藥劑相接觸，以及使所述細(xì)胞或組織與在附錄A中以SEQID NO: 8-122列出的微RNA(下調(diào)的微RNA)的微RNA模擬物相接觸。該微RNA可包含與SEQID NO:8-122中的至少一個至少80% (或85%、90%、95%、100% )相同的序列。
[0014] 在各個方面和實施方案中，本發(fā)明提供了向受試者（例如，患有癌癥的受試者）施 用EGFR-TKI藥劑以及施用在附錄A中以SEQIDN0:123-167,優(yōu)選SEQIDN0:156-167,更 優(yōu)選SEQIDNO: 159、164和165列出的微RNA(上調(diào)的微RNA)的抑制劑的方法。類似的方 法包括使細(xì)胞或組織（例如，癌細(xì)胞或癌組織如腫瘤）與EGFR-TKI藥劑相接觸，以及使所 述細(xì)胞或組織與在附錄A中以SEQIDN0:123-167,優(yōu)選SEQIDN0:156-167,更優(yōu)選SEQ IDNO: 159、164和165列出的微RNA(上調(diào)的微RNA)的抑制劑相接觸。該抑制劑可以是包 含與微RNA至少80% (或85%、90%、95%、100% )互補的序列的微RNA。
[0015] 在各個實施方案中，所述EGFR-TKI藥劑可以是埃羅替尼或類似的EGFR-TKI藥劑 如吉非替尼、阿法替尼、帕尼單抗或西妥昔單抗，或HER2抑制劑如拉帕替尼、培妥珠單抗或 曲妥珠單抗。在一些實施方案中，所述EGFR抑制劑是埃羅替尼，并且所述微RNA與SEQID NO: 1-4 中的一個，例如SEQIDNO: 1 至少 80% (或 85%、90%、95%、100% )相同。
[0016] 在各個實施方案中，所述癌癥可以是其中根據(jù)本發(fā)明的微RNA和EGFR-TKI抑制劑 的組合是對其有效的治療的癌癥，例如肺癌（例如，非小細(xì)胞肺癌，NSCL)和肝癌（例如，肝 細(xì)胞癌，HCC)。所述癌癥可包括肝的轉(zhuǎn)移性病變。
[0017] 在各個實施方案中，所述癌癥可以對單獨采用EGFR-TKI藥劑的治療具有抗性。所 述抗性可以是原發(fā)性或繼發(fā)性的（獲得性的）。所述癌癥可以是對單獨采用EGFR-TKI藥 劑的治療具有原發(fā)性或繼發(fā)性抗性的肺（例如，NSCL)癌。所述癌癥可以是對單獨采用 EGFR-TKI藥劑的治療具有原發(fā)性或繼發(fā)性抗性的肝癌（例如，HCC)。
[0018] 在各個實施方案中，所述EGFR-TKI藥劑可以以有效劑量施用，該有效劑量比在不 存在微RNA施用的情況下有效所需的劑量低（例如，低至少50% )。所述劑量可以是在不存 在微RNA的情況下所必需的劑量以下5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、60%、70%、80% 或 90%。
[0019] 在各個實施方案中，所述EGFR-TKI藥劑的IC5。相對于在不存在微RNA施用的情況 下的IC5。降低（例如，至少2倍）。所述1C5。可降低至少L5、2、2. 5、3、4、5或10倍。
[0020] 在各個實施方案中，所述受試者是人、非人靈長類動物或?qū)嶒瀯游铮ɡ?，小鼠?大鼠、豚鼠、兔、豬）。所述受試者可具有KRAS突變。所述受試者可具有EGFR突變。在一些 實施方案中，所述受試者對埃羅替尼具有原發(fā)性或繼發(fā)性抗性，例如，已發(fā)展或有可能發(fā)展 對EGFR-TKI藥劑的抗性的患者。或者，所述受試者的癌癥可對EGFR-TKI藥劑足夠敏感，然 而，單一治療的這種毒性可表明較低劑量的EGFR-TKI藥劑是理想的。
[0021] 本發(fā)明的各個方面、實施方案和特征在下文中進行了更詳細(xì)的說明和描述。然而， 如所聲稱的，前文和以下描述僅是說明和解釋性的，并非對本發(fā)明的限制。