活疫苗耐熱保護劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及活疫苗耐熱保護劑，本發(fā)明還涉及所述耐熱保護劑的制備方法和應 用，屬于活疫苗耐熱保護劑的制備及應用領域。
【背景技術】
[0002] 雞傳染性支氣管炎（IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV)引起的一種急性高度 接觸性傳染病，表現為咳嗽、噴嚏、氣管羅音等癥狀。雞傳染性支氣管炎給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來 了嚴重的經濟損失。
[0003] 中國在耐熱凍干保護劑方面的研究起步較晚，但在這方面的研究已取得了一定的 成果，現有的耐熱凍干保護劑物質組份通常為：明膠、牛血清白蛋白、蔗糖、PVPK30、山梨醇、 谷氨酸鈉、Vc，使用時需將高分子化合物經高壓滅菌、低分子化合物經0. 22um濾器過濾后， 按1 :1比例加入病毒抗原液中，分裝后進行冷凍干燥。凍干的疫苗在2-8°C條件下，保存24 個月以后，病毒滴度無明顯下降，37°C放置10天，EID5。下降約0. 8個滴度，全程凍干需要48 個小時左右；存在配方和配制過程復雜，凍干時間長，而且耐熱后病毒含量下降多等缺點。
[0004] 因此，改良現有保護劑的配方及凍干曲線，解決現有耐熱保護劑配制程序復雜、凍 干時間長、耐熱后疫苗滴度下降多、成本高等問題，將具有重要的意義。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種活疫苗耐熱保護劑，應用所述耐熱保護劑 制備的雞傳染性支氣管炎活疫苗，耐熱后疫苗滴度下降少，疫苗的效力更加穩(wěn)定，且凍干時 間短，耗費成本低；
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供一種所述活疫苗耐熱保護劑的制備方 法，其配制過程簡單；
[0007] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供所述活疫苗耐熱保護劑在制備雞傳染 性支氣管炎活疫苗中的應用。
[0008] 為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是：
[0009] 本發(fā)明首先公開了一種活疫苗耐熱保護劑，包括以下各組分：海藻糖、葡萄糖、明 膠、硫脲、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVPK30)和純水。
[0010] 每100ml活疫苗耐熱保護劑中，各組分的含量為：海藻糖l_5g，葡萄糖5-10g，明膠 0. 5-2g，硫脲l-6g，聚乙烯吡咯烷酮K30 2-6g，余量為純水；
[0011] 優(yōu)選的，每l〇〇ml活疫苗耐熱保護劑中，各組分的含量為：海藻糖2-5g，葡萄糖 5-10g，明膠0. 5-2g，硫脲l-6g，聚乙烯吡咯烷酮K30 4-6g，余量為純水；
[0012] 更優(yōu)選的，每l〇〇ml活疫苗耐熱保護劑中，各組分的含量為：海藻糖5g，葡萄糖 5-10g，明膠0. 5-2g，硫脲lg，聚乙烯吡咯烷酮K30 6g，余量為純水；
[0013] 最優(yōu)選的，每l〇〇ml活疫苗耐熱保護劑中，各組分的含量為：海藻糖5g，葡萄糖5g， 明膠2g，硫脲lg，聚乙烯吡咯烷酮K30 6g，余量為純水。
[0014] 本發(fā)明進一步公開了一種所述活疫苗耐熱保護劑的制備方法，包括：按照所述比 例稱取各組分，混合均勻，高壓滅菌，即得。其中，所述高壓滅菌為121°c滅菌15分鐘。
[0015] 本發(fā)明選擇配方組份中的主要成份海藻糖、硫脲和PVPK30,通過正交試驗方法配 制9組保護劑，制備凍干雞傳染性支氣管炎活疫苗并進行性狀檢驗、安全檢驗和效力檢驗 等，進行初步篩選。結果表明，按照g/ml計，每100ml活疫苗耐熱保護劑中，海藻糖5%、硫 脲1%和PVPK30 6%的配方，疫苗37°C保存10天，病毒滴度下降的最少，約0.8個滴度。
[0016] 本發(fā)明所述的活疫苗耐熱保護劑能夠應用于制備活疫苗；其中，所述的活疫苗是 雞傳染性支氣管炎活疫苗。
[0017] 本發(fā)明還公開了一種添加了本發(fā)明耐熱保護劑的雞傳染性支氣管炎活疫苗制備 方法，包括以下步驟：將雞傳染性支氣管炎活病毒液與所述的活疫苗耐熱保護劑混合均勻， 冷凍干燥，即得。
[0018] 其中，所述冷凍干燥的方式包括：_30°C預凍3小時，一期升華-30°C~-15°C，28 小時，二期干燥-15°C~28°C，17小時；全程48小時；
[0019] 或者，-40°C預凍4小時，一期升華-40°C~-15°C，18小時，二期干燥-15°C~ 28°C，14小時；全程36小時；
[0020] 或者，-40°C預凍4小時，一期升華-40°C~-15°C，14小時，二期干燥-15°C~ 22°C，6小時；全程24小時。
[0021] 雞傳染性支氣管炎活病毒液與所述活疫苗耐熱保護劑按照體積比1 :0. 5-2混合， 優(yōu)選為按照體積比1 :1混合；更優(yōu)選的，其中所述雞傳染性支氣管炎活病毒液是雞傳染性 支氣管炎病毒H120株或H52株的活病毒液?？梢圆捎肧PF雞胚培養(yǎng)以增殖雞傳染性支氣 管炎病毒收獲活病毒液，其具體方法為本領域技術人員所熟知。
[0022] 本發(fā)明根據所用凍干機器的性能特點、所用的保護劑的種類及凍干病毒的生物學 特性及生化指標等因素，設定3組凍干曲線，以優(yōu)化出最佳的適宜生產的凍干曲線。結果 表明，3組凍干曲線中，產品-40 °C預凍4小時，一期升華-40 °C~-15 °C，14小時，二期干 燥-15°C~22°C，6小時；全程24小時的凍干曲線制備的疫苗，37°C耐熱后病毒滴度下降的 最少，僅〇. 48。
[0023] 本發(fā)明還公開了所制備得到的雞傳染性支氣管炎活疫苗。本發(fā)明所制備的雞傳染 性支氣管炎活疫苗37°C耐熱后病毒含量下降少，約0. 4個滴度，疫苗的效力更加穩(wěn)定。
[0024] 為了驗證本發(fā)明活疫苗制備方法的生產性能，分別利用現有技術的舊方法和本發(fā) 明方法各制備10批疫苗，對凍干曲線全程時間、疫苗2-8°C保存期、疫苗37°C保存10天病 毒含量的下降進行比較。結果表明，舊方法不僅配方復雜，不易于大規(guī)模生產，而且其凍干 時間為48個小時，疫苗耐熱后病毒含量下降約0. 8個滴度。而本發(fā)明方法耐熱保護劑的配 方簡單，且只需高壓滅菌，配制過程簡單，適宜大規(guī)模生產；其凍干時間為24小時，耐熱后 病毒含量下降約〇. 4個滴度，疫苗在2-8 °C條件下可以保存36個月。綜上，本發(fā)明耐熱保護 劑及使用本保護劑的雞傳染性支氣管炎活疫苗的制備可應用于大規(guī)模生產。
[0025] 本發(fā)明技術方案與現有技術相比，具有以下有益效果：
[0026] 本發(fā)明活疫苗耐熱保護劑的配方及配制程序簡單，僅采用一次性高壓滅菌，成本 低；同時，本發(fā)明對雞傳染性支氣管炎活疫苗制備中的凍干曲線進行優(yōu)化，使凍干時間由 48小時縮短至24小時且耐熱后疫苗滴度下降少，疫苗的效力更加穩(wěn)定，安全性好。
[0027] 本發(fā)明所涉及到的術語宙義
[0028] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0029] 可互換使用的術語"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動物 中誘導免疫應答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護動物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對于疫苗或疫苗組合物典型的進一步組分，包括 例如佐劑或免疫調節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經修飾的活疫苗中作為經減毒的生物體，或在經殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領域技術人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時超 過一種上述組分。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié) 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0031] 1、材料和試劑
[0032] 材料：11日齡SPF雞胚由哈藥集團生物疫苗有限公司生產一部提供。
[0033] 毒株：H120株、H52株購買自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0034] 試劑：海藻糖購買自南寧中諾有限公司、葡萄糖購買自國藥集團化學試劑有限公 司、明膠購買自AMRESC0公司、硫脲購買自AMRESC0公司、PVPK30購買自日本化工試劑公司。
[0035] 實施例1耐熱保護劑的制備
[0036] 按照以下比例稱取各組分：
[0037] 海藻糖：5g ;
[0038] 葡萄糖：5g ;
[0039] 明膠：0· 5g ;
[0040] 硫脲：lg;
[0041] PVPK30 ：6g ；
[0042] 加純水至100ml。
[0043] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0044] 實施例2耐熱保護劑的制備
[0045] 按照以下比例稱取各組分：
[0046] 海藻糖：5g ;
[0047] 葡萄糖：10g;
[0048] 明膠：2g ;
[0049] 硫脲：6g ;
[0050] PVPK30 ：6g ；
[0051] 加純水至100ml。
[0052] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0053] 實施例3耐熱保護劑的制備
[0054] 按照以下比例稱取各組分：
[0055] 海藻糖：5g ;
[0056] 葡萄糖：10g;
[0057] 明膠：2g ;
[0058] 硫脲：lg;
[0059] PVPK30 ：6g ；
[0060] 加純水至100ml。
[0061] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0062] 實施例4耐熱保護劑的制備
[0063] 按照以下比例稱取各組分：
[0064] 海藻糖：5g ;
[0065] 葡萄糖：5g ;
[0066] 明膠：2g ;
[0067] 硫脲：lg;
[0068] PVPK30 ：6g ；
[0069] 加純水至100ml。
[0070] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。 [0071 ] 實施例5耐熱保護劑的制備
[0072] 按照以下比例稱取各組分：
[0073] 海藻糖：lg;
[0074] 葡萄糖：5g ;
[0075] 明膠：0· 5g ;
[0076] 硫脲：lg;
[0077] PVPK30 ：2g ；
[0078] 加純水至100ml。
[0079] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0080] 實施例6耐熱保護劑的制備
[0081] 按照以下比例稱取各組分：
[0082] 海藻糖：2g ;
[0083] 葡萄糖：5g ;
[0084] 明膠：0· 5g ;
[0085] 硫脲：lg;
[0086] PVPK30 ：4g ；
[0087] 加純水至100ml。
[0088] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0089] 實施例7耐熱保護劑的制備
[0090] 按照以下比例稱取各組分：
[0091] 海藻糖：3g;
[0092] 葡萄糖：6g ;
[0093] 明膠：lg;
[0094] 硫脲：2g ;
[0095] PVPK30 ：5g ；
[0096] 加純水至100ml。
[0097] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，