一種緩釋多肽生長(zhǎng)因子生物材料支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種緩釋多肽生長(zhǎng)因子生物材料支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多肽生長(zhǎng)因子是生物體胚胎發(fā)生、發(fā)育、分化以及人體各種組織損傷后再生修復(fù)過(guò)程中起重要作用的具有生物活性的多肽。人體組織損傷后的修復(fù)依賴于多肽生長(zhǎng)因子群體的營(yíng)養(yǎng)和支持作用。一般地說(shuō)，多肽生長(zhǎng)因子與細(xì)胞相互作用時(shí)，生長(zhǎng)因子作為配體與相應(yīng)的受體相結(jié)合形成復(fù)合體。該復(fù)合體凝聚在細(xì)胞膜表面，而后囊泡化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因溶酶體的存在而分解，多肽生長(zhǎng)因子在體內(nèi)半衰期極短。
[0003]多肽生長(zhǎng)因子具有優(yōu)越的生物活性，但是由于多肽生長(zhǎng)因子在體內(nèi)半衰期短，不足以在受損組織恢復(fù)過(guò)程中提供營(yíng)養(yǎng)作用，因此直接體內(nèi)注射多肽生長(zhǎng)因子的方法并不能達(dá)到良好的治療效果，需要將多肽生長(zhǎng)因子包封在生物高分子載體中，目前，一般是將游離的多肽生長(zhǎng)因子通過(guò)交聯(lián)劑或者在有機(jī)溶劑中被包封到高分子材料中，使之呈緩釋狀態(tài)，以延長(zhǎng)其作用時(shí)間。但是在制備多肽生長(zhǎng)因子-生物高分子載體體系過(guò)程中，其制備條件、物理因素(如溫度、機(jī)械攪拌劇烈程度等)、化學(xué)因素(溶劑的pH值、緩沖液的離子強(qiáng)度等)以及所使用的交聯(lián)劑等會(huì)對(duì)多肽生長(zhǎng)因子的生物活性產(chǎn)生一定的影響。因此如何制備一種生物材料支架，能夠?yàn)槎嚯纳L(zhǎng)因子提供長(zhǎng)時(shí)程緩釋，同時(shí)最大程度上保證多肽生長(zhǎng)因子的活性，是醫(yī)學(xué)上的一個(gè)難點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種釋放多肽生長(zhǎng)因子的生物材料支架的制備方法。
[0005]本發(fā)明提供的釋放多肽生長(zhǎng)因子的生物材料支架的制備方法包括如下步驟:
[0006]1)將生物材料、多肽生長(zhǎng)因子和水混勻，反應(yīng)，使所述生物材料溶脹，并且所述水以結(jié)合水、中間態(tài)水和自由水三種狀態(tài)存在于所述生物材料中，得到共混體系；
[0007]2)將所述共混體系進(jìn)行冷凍處理，得到冷凍后產(chǎn)物；
[0008]3)將所述冷凍后產(chǎn)物進(jìn)行冷凍恢復(fù)處理，得到釋放多肽生長(zhǎng)因子的生物材料支架。
[0009]上述方法中，所述冷凍恢復(fù)處理就是解除冷凍狀態(tài)或者融化。
[0010]上述方法中，所述步驟1)中，所述反應(yīng)的條件為0_4°C反應(yīng)6_72h ；
[0011]所述步驟2)中，所述冷凍處理的條件為_(kāi)80°C至_20°C處理12-48h ;
[0012]所述步驟3)中，所述冷凍恢復(fù)處理的條件為4°C處理10_24h。
[0013]上述方法中，所述步驟1)中，所述反應(yīng)的條件為4°C反應(yīng)48h ;
[0014]所述步驟2)中，所述冷凍處理的條件為_(kāi)20°C處理24h ;
[0015]所述步驟3)中，所述冷凍恢復(fù)處理的條件為4°C處理24h。
[0016]上述方法中，所述生物材料為水凝膠類(lèi)生物醫(yī)用高分子材料；所述水凝膠類(lèi)生物醫(yī)用高分子材料具體為殼聚糖、聚乳酸、聚乳酸羥基乙酸、明膠或藻酸鹽。
[0017]上述方法中，所述生物材料為在水中不溶解但能夠吸水的凝膠類(lèi)物質(zhì)或含有羥基、羧基、氨基等親水性基團(tuán)的生物醫(yī)用高分子材料。
[0018]上述方法中，所述多肽生長(zhǎng)因子為神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素_3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素_4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-5、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-6、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素_7、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、膠質(zhì)細(xì)胞株源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子-1、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子-2、骨形成蛋白、Nogo的抗體或硫酸軟骨素抗體。
[0019]上述方法中，所述生物材料、所述多肽生長(zhǎng)因子和所述水的配比為l-1000mg:10_200ng: lml。
[0020]上述方法中，所述生物材料、所述多肽生長(zhǎng)因子和所述水的配比為10mg:30ng:10ml ο
[0021]上述方法中，所述生物材料為殼聚糖；所述多肽生長(zhǎng)因子為神經(jīng)生長(zhǎng)因子。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述方法制備得到的釋放多肽生長(zhǎng)因子的生物材料支架。
[0023]上述生物材料支架中，所述釋放多肽生長(zhǎng)因子的生物材料支架的釋放時(shí)間達(dá)16周。
[0024]本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供上述釋放多肽生長(zhǎng)因子的生物材料支架的新用途。
[0025]本發(fā)明提供了上述釋放多肽生長(zhǎng)因子的生物材料支架在制備重建或修復(fù)組織或器官缺損的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0026]上述應(yīng)用中，所述組織為神經(jīng)組織。
[0027]本發(fā)明利用水分子作為制孔劑，先將水分子以結(jié)合水、中間態(tài)水、自由水三種狀態(tài)在溶脹過(guò)程中進(jìn)入到生物材料結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中；再在冷凍過(guò)程中利用水變成冰這個(gè)物理過(guò)程產(chǎn)生的體積膨脹使得生物材料的孔徑變大、孔隙率增高，更多的多肽生長(zhǎng)因子得以進(jìn)入到生物材料結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中；最后在冷凍恢復(fù)過(guò)程中，利用冰變成水這個(gè)物理過(guò)程產(chǎn)生的體積收縮，使生物材料的孔徑回縮，將已經(jīng)進(jìn)入到材料結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中的多肽生長(zhǎng)因子包封在生物材料結(jié)構(gòu)中，得到長(zhǎng)時(shí)程緩釋神經(jīng)生長(zhǎng)因子的殼聚糖材料支架。本發(fā)明的長(zhǎng)時(shí)程緩釋神經(jīng)生長(zhǎng)因子的殼聚糖材料支架中的多肽生長(zhǎng)因子與生物材料之間以氫鍵連接，生物材料支架為多肽生長(zhǎng)因子提供支撐作用，將多肽生長(zhǎng)因子長(zhǎng)時(shí)程緩釋出來(lái)，本發(fā)明的材料在最大程度保證多肽生長(zhǎng)因子生物活性的同時(shí)，還能夠提供長(zhǎng)時(shí)程的多肽生長(zhǎng)因子緩釋，為缺損組織提供整個(gè)再生過(guò)程中生長(zhǎng)所需的多肽生長(zhǎng)因子。
【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為殼聚糖材料支架反應(yīng)前、冷凍后以及冷凍恢復(fù)后的表面形貌(掃描電子顯微鏡照片)。圖1Α為生物材料支架反應(yīng)前的表面形貌；圖1Β為生物材料支架冷凍后的表面形貌；圖1C為生物材料冷凍恢復(fù)后的表面形貌。
[0029]圖2為殼聚糖材料支架緩釋神經(jīng)生長(zhǎng)因子的ELISA曲線。
[0030]圖3為雞胚背根神經(jīng)節(jié)(DRG)在殼聚糖材料支架作用下生長(zhǎng)的神經(jīng)纖維(顯微鏡照片)。
【具體實(shí)施方式】
[0031 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0032]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033]實(shí)施例1、一種包封神經(jīng)生長(zhǎng)因子的殼聚糖緩釋支架的制備方法
[0034]神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員之一，是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)元細(xì)胞存活、軸突再生以及在神經(jīng)損傷之后調(diào)節(jié)施萬(wàn)細(xì)胞(Schwann cell, SC)分化和軸突髓鞘再生過(guò)程都起到重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軸突可以在合適的微環(huán)境下再生，可以部分恢復(fù)受損軸突的功能，但是神經(jīng)生長(zhǎng)因子在成年大鼠體內(nèi)的半衰期只有7.2min。本實(shí)施例以神經(jīng)生長(zhǎng)因子為試驗(yàn)對(duì)象，制備一種包封神經(jīng)生長(zhǎng)因子的殼聚糖緩釋支架，以延長(zhǎng)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋時(shí)間。具體步驟如下:
[0035]1、殼聚糖材料與神經(jīng)生長(zhǎng)因子共混溶脹
[0036]將10ml蒸餾水、10mg的片狀殼聚糖(圖1A)和30ng的神經(jīng)生長(zhǎng)因子混勻，得到共混體系，將其在4°C下環(huán)境下反應(yīng)48小時(shí)(反應(yīng)時(shí)用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌)，使殼