一種膠原蛋白/海藻酸鈣/殼聚糖復(fù)合止血海綿及制備方法
【專利說明】一種膠原蛋白/海藻酸鈣/殼聚糖復(fù)合止血海綿及制備方 法 1技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及局部外傷止血敷料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種止血用生物材料-膠原蛋 白/海藻酸鈣/殼聚糖復(fù)合止血海綿及制備方法。 2【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會的發(fā)展，臨床與戰(zhàn)傷救治對局部外傷止血的要求越來越高。生物醫(yī)用材 料被認(rèn)為局部外傷止血最有效的材料之一，具有可吸收、高效、經(jīng)濟(jì)和無毒害等優(yōu)點，生物 醫(yī)用材料是一種新型的止血材料，它主要是通過自身材料特征與優(yōu)勢，吸附血液，凝聚血小 板，堵塞血管，促進(jìn)凝血酶產(chǎn)生，從而達(dá)到止血作用。
[0003] 目前應(yīng)用生物醫(yī)用材料作為局部外傷止血的優(yōu)勢得到了廣泛認(rèn)可，其應(yīng)用前景看 好，正受到世界各國的普遍重視，相關(guān)研究也十分活躍。生物醫(yī)用材料的止血過程一般包括 兩個方面：①材料自身的吸液性能夠迅速有效的吸收滲血，溶脹并貼合在傷口上，堵塞血管 并產(chǎn)生一定壓力，對傷口起到壓迫止血作用；②材料自身能夠吸附血小板，使其黏附聚集于 傷口，堵塞血管；③促進(jìn)凝血酶的產(chǎn)生達(dá)到止血的最終目的。
[0004] 目前較為成熟的生物止血材料主要有海藻酸鹽海綿、殼聚糖海綿及膠原蛋白海 綿。這些材料由于成分單一，止血機制、止血效果和生物相容性等各有特點。殼聚糖是來源 廣泛的甲殼素脫乙?；奶烊桓叻肿?，生物相容性好，通過作用于紅細(xì)胞，使其發(fā)生聚集從 而使血液凝固，其止血作用有限。膠原蛋白海綿利用大面積結(jié)構(gòu)破壞血小板促進(jìn)凝血，膠原 蛋白海綿在創(chuàng)面的溶解和降解，使創(chuàng)面局部黏度變化發(fā)生變化，從而促進(jìn)凝血過程，但一般 動物源性膠原蛋白的生物相容性較差。海藻酸鈣海綿是一種具有高吸濕性能的功能性傷口 敷料，與傷口滲出液接觸后，通過離子交換海藻酸鈣轉(zhuǎn)換為海藻酸鈉，大量的水分進(jìn)入海綿 結(jié)構(gòu)而吸濕膨脹，形成水凝膠，海藻酸鹽敷料的止血作用不但由于其凝血效應(yīng)，也因為其對 血小板活性具有顯著的刺激作用，但其生物相容性不如殼聚糖海綿。
[0005] 本發(fā)明采用膠原蛋白、海藻酸鈣與殼聚糖，在乙酸鹽水溶液中按一定比例混合形 成三者的復(fù)合溶液，通過冷凍干燥方法制備復(fù)合止血海綿，發(fā)揮膠原蛋白、海藻酸鈣與殼聚 糖各自優(yōu)勢，達(dá)到強效止血效果。該止血海綿與創(chuàng)面接觸后，能夠使血小板迅速黏附并聚集 于創(chuàng)面，堵塞血管；同時，復(fù)合止血海綿吸收大量滲液，溶脹后對傷口產(chǎn)生一定壓力，起到一 定程度的壓迫止血作用；此外，復(fù)合止血海綿中的Ca +可與血液中的Na+互換，促進(jìn)凝血酶的 生成，參與內(nèi)源性與外源性凝血，可以顯著提高止血效果。 3
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種局部創(chuàng)傷止血的復(fù)合生物海綿及制備方法。該復(fù)合海綿與創(chuàng) 面接觸后，能夠使血小板迅速聚集，形成血痂，而良好的吸液性使得復(fù)合海綿能吸收大量滲 出液對傷口產(chǎn)生一定的壓力，進(jìn)而起到一定按壓止血的作用，并且復(fù)合海綿中的Ca +在與創(chuàng) 面接觸后能迅速與血液里的Na+發(fā)生交換，從而促進(jìn)凝血酶的產(chǎn)生，加快創(chuàng)面自身凝血，進(jìn) 一步提高止血效果。采用對人體無危害的膠原蛋白、海藻酸鈣與殼聚糖，具備良好的安全 性，不會對傷口造成污染與毒害。
[0007] 本發(fā)明提供一種膠原蛋白/海藻酸鈣/殼聚糖復(fù)合止血海綿及制備方法。該復(fù)合 海綿的膠原蛋白、海藻酸鈣與殼聚糖的含量如下：
[0008] 膠原蛋白含量：20mg/ml
[0009] 海藻酸鈣含量：0· 4mg/ml
[0010] 殼聚糖含量：〇· lmg/ml
[0011] 所述的膠原蛋白/海藻酸鈣/殼聚糖復(fù)合止血海綿，其特征是所述的膠原蛋白是 陸生膠原或海生膠原，與人體有較好的生物相容性。
[0012] 所述的膠原蛋白/海藻酸鈣/殼聚糖復(fù)合止血海綿，其特征是所述的海藻酸鈣是 從海藻中提取而來，具備原料廣泛的特點。
[0013] 所述的膠原蛋白/海藻酸鈣/殼聚糖復(fù)合止血海綿，其特征是所述的殼聚糖是指 脫乙酰度在80. 0~95. 0的殼聚糖。
[0014] 本發(fā)明制備上述膠原蛋白/海藻酸鈣/殼聚糖復(fù)合止血海綿的方法步驟如下：
[0015] 通過體外單因素凝血實驗確定膠原蛋白、海藻酸鈣以及殼聚糖各自的較優(yōu)凝血濃 度，再設(shè)計L9(3 3)正交實驗（如表1與表2所示）。根據(jù)正交實驗設(shè)計配制不同濃度的復(fù) 合溶液，經(jīng)冷凍干燥成海綿。利用BCI (Blood Clotting Index)法測定正交實驗中各復(fù)合 海綿的體外凝血指數(shù)，通過直觀分析法（表3)與方差分析法（表4)，進(jìn)而篩選出最佳的組 方，即膠原蛋白：海藻酸f丐：殼聚糖=20(mg/ml) : 0. 4(mg/ml) : 0. l(mg/ml)。
[0016] 按照上述最佳組方，將膠原蛋白在室溫下加入乙酸生理鹽水中，室溫攪拌溶解，配 制成終濃度為20mg/ml的溶液，再加入海藻酸|丐，使其濃度為0. 4mg/ml，最后加入殼聚糖， 使其濃度為〇. lmg/ml，室溫下渦旋15min混合均勻，然后靜置30min左右后倒入塑料平皿， 常規(guī)冷凍干燥后，密封保存即得產(chǎn)品。
[0017] 本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有如下顯著特征：
[0018] (1)復(fù)合止血海綿的組分采用的是對人體無毒害，具有良好相容性與安全性的生 物材料。
[0019] (2)復(fù)合止血海綿的主要成分均為具有良好止血性能且止血機理各不相同的生物 材料，能夠協(xié)同作用促進(jìn)止血。
[0020] (3)復(fù)合止血海綿既能使血小板黏附，形成血痂，又能促進(jìn)凝血酶的產(chǎn)生，促進(jìn)傷 口自身凝血；復(fù)合海綿還具備高吸液性，能迅速有效地吸收血液，對傷口產(chǎn)生一定壓力，起 到按壓止血作用，同時保持傷口的濕潤環(huán)境。
[0021] (4)復(fù)合止血海綿制備方法簡單，原料廣泛。
[0022] (5) -系列動物實驗表明復(fù)合止血海綿具有顯著優(yōu)于常規(guī)止血敷料的止血性能。 4【附圖說明】
[0023] 圖1復(fù)合止血海綿的直觀圖
[0024] 圖2復(fù)合止血海綿的電鏡圖（A :復(fù)合止血海綿橫截面，B :復(fù)合止血海綿縱截面）
[0025] 圖3復(fù)合止血海綿與各組分紅外光譜
[0026] 圖4復(fù)合止血海綿體外凝血指數(shù)（Blood Clotting Index)
[0027] 圖5復(fù)合止血海綿體表全皮層止血效果（A :復(fù)合止血海綿止血時間測定，B :復(fù)合 止血海綿出血量測定）
[0028] 圖6復(fù)合止血海綿耳動脈止血效果（A :復(fù)合止血海綿止血時間測定，B :復(fù)合止血 海綿出血量測定）
[0029] 圖7復(fù)合止血海綿細(xì)胞毒性評價 5【具體實施方式】
[0030] 以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件。
[0031] 實施例1 :膠原蛋白、海藻酸鈣與殼聚糖溶液體外單因素凝血實驗
[0032] 配制 5mg/ml，10mg/ml，15mg/ml，20mg/ml，25mg/ml 的膠原蛋白溶液（0· lmol/L 乙 酸生理鹽水溶液為溶劑）。各0. 5ml加入試管，37°C水浴lh，Lee-White全血凝血法測定其 凝血時間，選取凝血時間最短的為最優(yōu)膠原蛋白止血濃度，每樣平行三次。測定結(jié)果膠原蛋 白的最優(yōu)凝血濃度為15mg/ml。
[0033] 配制 0· Omg/ml，0· 4mg/ml，2. Omg/ml，10mg/ml 海藻酸鈣溶液（0· lmol/L 乙酸生理 鹽水溶液為溶劑）。各〇. 5ml加入試管，37°C水浴lh，Lee-White全血凝血法測定其凝血時 間，選取凝血時間最短的為最優(yōu)海藻酸鈣止血濃度，每樣平行三次。測定結(jié)果海藻酸鈣的最 優(yōu)凝血濃度為0. 4mg/ml。
[0034] 配制 0mg/ml，0· lmg/ml，0· 2mg/ml，0· 3mg/ml，0· 4mg/ml，0· 5mg/ml 殼聚糖溶液 (0· lmol/L乙酸生理鹽水溶液為溶劑）。各0· 5ml加入試管，37°C水浴lh，Lee-White全血 凝血法測定其凝血時間，選取凝血時間最短的為最優(yōu)殼聚糖止血濃度，每樣平行三次。測定 結(jié)果殼聚糖的最優(yōu)凝血濃度為〇. 2mg/ml。
[0035] 實施例2 L9 (33)正交實驗篩選最佳組方
[0036] 根據(jù)實施例1獲得的膠原蛋白、海藻酸鈣與殼聚糖的最優(yōu)濃度，設(shè)計L9(33)正交 實驗（表1、表2)，配制不同濃度三者復(fù)合溶液，經(jīng)冷凍干燥制