一種聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白雙層仿生血管支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于仿生血管支架的制備領(lǐng)域，特別涉及一種聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白雙層仿生血管支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]天然血管的三層結(jié)構(gòu)中起主要作用的是內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞層和中層的平滑肌細(xì)胞層，其中內(nèi)層均勻排列的內(nèi)皮細(xì)胞主要起到防止血栓、保持內(nèi)腔通暢率的作用；中層的梭狀平滑肌細(xì)胞繞軸取向排列，提供力學(xué)支撐以維持血管的收縮和舒張。在血管組織工程領(lǐng)域中，再生功能化血管主要就是再生出內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞層和中層的平滑肌細(xì)胞層。
[0003]靜電紡絲技術(shù)是組織工程研究中制備支架的常用方法，它可以連續(xù)制備出納米級(jí)到微米級(jí)纖維，仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的尺寸和結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的粘附和生長。同時(shí)靜電紡絲方法原材料選擇廣泛，合成高分子材料、天然高分子材料以及他們的共混復(fù)合物都可以通過靜電紡絲方法獲得纖維結(jié)構(gòu)。近年來，基于組織工程支架對(duì)纖維結(jié)構(gòu)和功能上的要求，一些改進(jìn)的靜電紡絲方法逐漸得到研究者們的研發(fā)和應(yīng)用。同軸靜電紡絲法主要是用于制備負(fù)載功能性藥物或因子的纖維，通過此種方法能夠?qū)⒐δ苄运幬锇诶w維的內(nèi)部，得到具有殼芯結(jié)構(gòu)的納米纖維，不僅可以最大程度的保護(hù)藥物或因子的生物活性，更可以通過擴(kuò)散作用、降解機(jī)制等使藥物或因子可控、持續(xù)釋放，本發(fā)明中通過負(fù)載肝素和⑶133抗體，可以得到具有短期抗凝性能和長期促內(nèi)皮化的血管支架內(nèi)層；目前組織工程支架還要求纖維具有大孔徑、高孔隙率結(jié)構(gòu)，以維持養(yǎng)分的傳輸并保證細(xì)胞的三維迀移和生長，本發(fā)明中采用的動(dòng)態(tài)液體靜電紡絲法可以將傳統(tǒng)靜電紡絲方法得到的納米纖維通過水流漩渦的帶動(dòng)加捻形成納米紗，通過低速旋轉(zhuǎn)的不銹鋼棒接收裝置可接收到具有一定繞軸取向性且結(jié)構(gòu)疏松的納米紗血管外層，其特殊的纖維結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的原位取向排列和三維滲透生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白雙層仿生血管支架的制備方法，本發(fā)明該制備的仿生雙層支架具有優(yōu)良的力學(xué)性能和生物相容性，并且內(nèi)層負(fù)載功能型藥物、外層模擬天然血管平滑肌層結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)上和功能上仿生天然血管組織，主要表現(xiàn)為:內(nèi)層納米纖維仿生天然ECM尺寸，有利于內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和生長；同時(shí)負(fù)載肝素和CD133抗體，早期通過肝素的緩釋實(shí)現(xiàn)抗凝，遠(yuǎn)期通過CD133抗體對(duì)內(nèi)皮化的促進(jìn)實(shí)現(xiàn)抗凝；外層為具有一定繞軸取向性的納米紗，其疏松多孔的結(jié)構(gòu)有利于平滑肌細(xì)胞的繞軸平行排列和三維生長。本發(fā)明涉及的支架根據(jù)所需內(nèi)徑和長度不同可制備出多種規(guī)格，特別是3至6毫米小口徑的血管，在血管組織工程中將會(huì)有重要的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的一種聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白雙層仿生血管支架的制備方法，包括:
[0006](1)將聚乳酸己內(nèi)酯、膠原蛋白溶于溶劑中，得到聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白復(fù)合紡絲液；
[0007](2)將 CD133 抗體(mouse monoclonal anti human CD 133 antibody)、肝素鈉溶于稀釋液中混勻，得到藥物溶液；
[0008](3)以藥物溶液作為芯層，以聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白復(fù)合紡絲液作為殼層，進(jìn)行同軸靜電紡絲，得到負(fù)載肝素和CD133抗體的復(fù)合納米纖維(作為血管內(nèi)層)，然后采用動(dòng)態(tài)液體靜電紡絲方法，連續(xù)電紡聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白復(fù)合紡絲液生成具有一定取向性且纖維結(jié)構(gòu)疏松、孔徑較大的復(fù)合納米紗(作為血管外層)，得到雙層血管支架；
[0009](4)將上述雙層血管支架進(jìn)行冷凍干燥、交聯(lián)，即得聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白雙層仿生血管支架。
[0010]所述步驟⑴中聚乳酸己內(nèi)酯為是摩爾比為50:50的聚乳酸和聚己內(nèi)酯合成的無規(guī)共聚物。
[0011]所述步驟⑴中溶劑為六氟異丙醇；聚乳酸己內(nèi)酯和膠原蛋白的質(zhì)量比為3:1。
[0012]所述步驟(1)中聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白復(fù)合紡絲液的質(zhì)量百分濃度為8-12%。
[0013]所述步驟⑵中CD133抗體為20-30 μ g(理論負(fù)載量);藥物溶液中肝素鈉的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為15%。
[0014]所述步驟(2)中稀釋液為western —抗稀釋液(碧云天公司，產(chǎn)品編號(hào)P0023A)。
[0015]所述步驟(3)中同軸靜電紡絲的工藝參數(shù)為:紡絲電壓為14kV，殼層紡絲速度為1.0mL/h，芯層紡絲速度為0.lmL/h，接收距離為12cm，不銹鋼棒旋轉(zhuǎn)速率為lOOOrpm。
[0016]所述步驟(3)中動(dòng)態(tài)液體靜電紡絲的工藝參數(shù)為:紡絲電壓為12-14kV，紡絲速度為1.0mL/h，針頭到水面的距離為15cm，水盆底部到不銹鋼棒的距離為10cm，不銹鋼棒旋轉(zhuǎn)速率為 80-100rpm。
[0017]所述步驟(4)中冷凍干燥時(shí)間為48h ;交聯(lián)時(shí)間為20min。
[0018]所述交聯(lián)為戊二醛蒸汽進(jìn)行交聯(lián)。
[0019]本發(fā)明設(shè)計(jì)的雙層仿生功能型血管支架，選取具有優(yōu)良力學(xué)性能和生物降解性能的聚乳酸己內(nèi)酯以及具有優(yōu)良生物相容性的仿生材料膠原蛋白為基礎(chǔ)材料，同時(shí)選擇臨床上常用的抗凝劑肝素，以及具有促內(nèi)皮化作用的CD133抗體作為緩釋藥物。目前尚無報(bào)道制備負(fù)載功能性藥物肝素和CD133抗體，并且具有仿生雙層結(jié)構(gòu)的血管支架的研究。此雙層仿生功能型血管支架的內(nèi)層納米纖維仿生天然ECM尺寸，有利于內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和生長；同時(shí)負(fù)載肝素和CD133抗體，能夠?qū)崿F(xiàn)早期的抗凝和遠(yuǎn)期的促內(nèi)皮化作用；外層為具有一定繞軸取向性的納米紗，其疏松多孔的結(jié)構(gòu)有利于平滑肌細(xì)胞的繞軸平行排列和三維生長。支架雙層均為生物可降解材料，可隨著新生血管組織的重構(gòu)而逐漸吸收降解。此雙層血管支架實(shí)現(xiàn)了從組分上、結(jié)構(gòu)上、功能上仿生天然血管組織，同時(shí)可根據(jù)所需內(nèi)徑和長度不同可制備出多種規(guī)格，特別是3至6毫米小口徑的血管，在血管組織工程中將會(huì)有重要的應(yīng)用。
[0020]有益效果
[0021](1)本發(fā)明首次制備負(fù)載肝素和⑶133抗體并仿生天然血管多層結(jié)構(gòu)的組織工程雙層血管支架。選用的原材料是具有優(yōu)良拉伸力學(xué)性能和順應(yīng)性的聚乳酸己內(nèi)酯，以及具有優(yōu)良生物相容性的膠原蛋白。通過靜電紡得到的纖維與天然細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維束尺寸相當(dāng)，模擬其組分和結(jié)構(gòu)。因此本發(fā)明的雙層血管支架能夠從組分上、結(jié)構(gòu)上、功能上仿生天然血管的多層結(jié)構(gòu)，同時(shí)兼具優(yōu)良的生物力學(xué)性能和生物相容性。
[0022](2)此仿生雙層血管支架的內(nèi)層是負(fù)載肝素和⑶133抗體的聚乳酸己內(nèi)酯-膠原蛋白復(fù)合納米纖維，有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附生長；同時(shí)通過肝素的緩釋能夠?qū)崿F(xiàn)移植初期的抗凝效果，而遠(yuǎn)期可以通過CD133抗體對(duì)內(nèi)皮化的促進(jìn)實(shí)現(xiàn)抗凝。
[0023](3)此仿生雙層血管支架的外層是具有一定繞軸取向性且疏松多孔的納米紗，平行纖維方向的力學(xué)強(qiáng)度得到增強(qiáng)，同時(shí)其特有的取向結(jié)構(gòu)和大孔徑有利于平滑肌細(xì)胞的繞軸平行