生物納米補片的制備法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及材料化學，具體為通過脫細胞技術(shù)，合成具 有良好生物相容性的黃芪甲苷誘導BMSC復合聚乳酸-羥基乙酸納米顆粒修飾小腸粘膜下層 基質(zhì)構(gòu)建的生物納米補片(AS-BMSC-PLGA-SIS)，本發(fā)明還涉及該生物納米補片在醫(yī)學方面 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 腹壁疝，創(chuàng)傷、腫瘤、感染造成的腹壁缺損，是外科常見的病癥，其治療是外科臨床 棘手的難題之一。臨床手術(shù)所使用的人工修補材料主要還是依賴進口，價格昂貴。腹壁修復 重建材料目前使用最多的，是不可降解的聚合體材料，不可吸收的聚合體材料植入體內(nèi)后， 會導致過量的瘢痕形成。這種長期的、過量的炎癥過程將導致手術(shù)后的一些并發(fā)癥發(fā)生，這 些并發(fā)癥會影響患者的生活質(zhì)量，嚴重者甚至可以威脅患者生命。近年來生物補片在腹壁 疝、腹壁缺損修補中的應(yīng)用，已經(jīng)成為研究的熱點，但是到目前為止國際上還未找到一種完 全理想的修復材料。
[0003] 尋找一種理化性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、力學強度高、并且利于組織再生的修復重 建材料，是治療腹壁疝和缺損的關(guān)鍵。因此，開發(fā)研制新型腹壁修復重建材料，對于我國腹 壁疝和腹壁缺損的治療具有重要的意義，擁有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 目前現(xiàn)有的生物補片包括小腸粘膜下層基質(zhì)（small intestinal submucosa， SIS)、人工脫細胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix，ADM)等的制備方法為:采用脫細胞 技術(shù)，去除能引起宿主免疫排斥反應(yīng)的所有細胞成分，完整保留細胞外基質(zhì)和立體網(wǎng)狀支 架結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種黃芪甲苷誘導BMSC復合聚乳酸-羥基乙酸納 米顆粒修飾的小腸粘膜下層基質(zhì)構(gòu)建的生物納米補片(AS-BMSC-PLGA-SIS)的制備方法，采 用該方法制得的AS-BMSC-PLGA-SIS生物補片能用于治療腹壁疝和缺損，能夠減少腹腔黏連 和炎癥，促進纖維性結(jié)締組織和間皮細胞生長，促進傷口血管生成和膠原蛋白合成，從而加 快腹壁缺損的愈合。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種生物納米補片(AS-BMSC-PLGA-SIS)的制 備方法:采用復乳法制備得到核心粒徑為150~200nm的PLGA納米顆粒(poly (lact ic-co-glycolic acid)，其表征具有良好生物相容性和生物降解性）；采用脫細胞技術(shù)，制備得到 SIS(small intestinal submucosa，其具有天然三維超微結(jié)構(gòu)），使PLGA納米顆粒粘附于 SIS表面，得PLGA-SIS(PLGA納米顆粒表面修飾的豬小腸粘膜下層基質(zhì)）；通過黃芪甲苷誘導 BMSC，促進其增殖分化，并使之復合生長于PLGA-SIS;得生物納米補片AS-BMSC-PLGA-SIS;
[0007] 所述PLGA納米顆粒為聚乳酸-羥基乙酸納米顆粒；
[0008] 所述SIS是小腸粘膜下層基質(zhì)。
[0009] 備注說明：經(jīng)上述PLGA NP表面修飾后的SIS，將更加有利于宿主細胞的粘附和生 長。
[0010] 作為本發(fā)明的生物納米補片的制備方法的改進，依次進行以下步驟：
[0011] 1 )、室溫下，取PLGA溶于有機溶劑I中，得到有機溶液(為無色透明液體），所述PLGA 與有機溶劑I的質(zhì)量體積比為Ig: 80~160ml;
[0012] 泊羅沙姆188攪拌下溶于去離子水中，得到水溶液（為無色透明液體），泊羅沙姆 188與去離子水的質(zhì)量體積比為Ig: 90~IlOmK較佳為Ig :100ml);
[0013] 所述PLGA為聚乳酸-羥基乙酸共聚物(即poly(lactic-co_glycolic acid));
[0014] 備注說明：該PLGA 優(yōu)選 LA/GA = 50/50;
[0015] 所述有機溶劑I為丙酮:乙醇=2.5~3.5:1的體積比(較佳為3:1);
[0016] 2 )、室溫下，將有機溶液于攪拌下滴加（30~60分鐘滴加完畢）到水溶液中，所述 PLGA與泊羅沙姆188的質(zhì)量比為1:3.5~4.5(較佳為1:4);
[0017]滴加完畢后，繼續(xù)攪拌30~60min(目的是蒸發(fā)掉大部分有機溶劑），得到帶乳光的 納米懸池液；
[0018] 3)、將帶乳光的納米懸池液于37~40°C用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸90~120min(目的是去 除殘余的有機溶劑和部分水），得到高分子膠體懸浮液；4000~6000rpm/s高速離心25~ 35min(例如為5000rpm/s高速離心30min)棄去沉淀，得到PLGA納米乳液；
[0019] 備注說明：該PLGA納米乳液中PLGA的粒徑為150~200nm;
[0020] 備注說明：上述步驟中未進行透析，原因是離心過程泊洛沙姆188已被充分去除；
[0021] 4)、將豬小腸制成小腸粘膜下層基質(zhì)（即，將豬小腸剪成IOcm小段，剪開平鋪，將小 腸內(nèi)層粘膜、外層漿膜及肌肉層剝?nèi)?，得到小腸粘膜下層基質(zhì);此為常規(guī)技術(shù)）；
[0022] 5)、將小腸粘膜下層基質(zhì)先用有機溶劑Π 進行浸泡10~Hh(用量比為lg/5ml，浸 泡時間較佳為12 h )，再用去離子水沖洗;有機溶劑Π 為甲醇:氯仿=1:0.9~1.1體積比（較 佳為1:1)混合而得；
[0023] 6)、將步驟5)所得的小腸粘膜下層基質(zhì)經(jīng)消化后，用去生理鹽水沖洗(例如沖洗3 次，每次30分鐘）；
[0024] 7)、將步驟6)所得的小腸粘膜下層基質(zhì)先浸泡在質(zhì)量濃度為0.5%的十二烷基磺 酸鈉(SDS)溶液中（lg/4~6ml的用量比），振搖3~4h，去離子水洗凈；
[0025] 然后再用體積濃度為0.1 %的過氧乙酸溶液浸泡20~40min( lg/4~6ml的用量比） 后，去離子水洗凈；
[0026] 所述體積濃度為0.1 %的過氧乙酸溶液的配制方法為：利用體積濃度為20 %的乙 醇水溶液作為稀釋劑對過氧乙酸進行稀釋，從而使最終所得的過氧乙酸溶液中過氧乙酸的 體積濃度為0.1 % ;
[0027] 最后干燥(用低溫真空干燥機進行干燥），密封后鈷-60輻射滅菌；
[0028] 8 )、無菌環(huán)境下，將步驟7)所得的小腸粘膜下層基質(zhì)（SIS)放入DMEM高糖培養(yǎng)液中 浸泡（用量比約為〇.5g/3ml)22~26h(較佳為24h)后，吸除小腸粘膜下層基質(zhì)（SIS)表面多 余的DMEM高糖培養(yǎng)液;加入由PLGA納米乳液和DMEM高糖培養(yǎng)液組成的混合液浸泡（用量比 約為〇.5g/3ml)12~24h后，再次吸除小腸粘膜下層基質(zhì)（SIS)表面的多余的混合液，得到 PLGA-SIS；
[0029] 所述混合液中，PLGA納米乳液和DMEM高糖培養(yǎng)液的體積比為1: 1.8~2.2(較佳為 v：v = l ：2)；
[0030] 9 )、將第三代BMSC細胞(大鼠BMSC細胞)經(jīng)消化離心后，用DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋至 BMSC細胞的濃度為1 · 8~2 · 2 X IO5CelVml (較佳為2 X IO5CelVml )，得BMSC細胞懸液；
[0031 ] 將BMSC細胞懸液滴加在步驟8)所得的PLGA-SIS于37°C、5 %C〇2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 22~26h(較佳為24h)后，加入DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)于37°C、5%⑶2培養(yǎng)66~78h(較佳為 72h)，中間（即，繼續(xù)培養(yǎng)至一半時間時)更換一次DMEM高糖培養(yǎng)液；
[0032]備注說明：每0.5g的小腸粘膜下層基質(zhì)（SIS)所得的PLGA-SIS配用1.8~2.2ml(較 佳為2ml)的BMSC細胞懸液、4.5~5.5ml (較佳為5ml)的DMEM高糖培養(yǎng)液；
[0033] 10)、將黃芪甲苷溶于DMEM高糖培養(yǎng)液中，從而配制成濃度為黃芪甲苷濃度為150 ~170μπι〇 I /L (較佳為160μπι〇 I /L)的含黃芪甲苷的DMEM高糖培養(yǎng)液；
[0034] 將步驟9)的所得物用上述含黃芪甲苷的DMEM高糖培養(yǎng)液進行培養(yǎng)液的更換，利用 所述含黃芪甲苷的DMEM高糖培養(yǎng)液對BMSC細胞于37°C，5 %C02的條件下干預22~26h(較佳 為24h)后，得到生物納米補片(AS-BMSC-PLGA-SIS)。
[0035]備注說明：每0.5g的小腸粘膜下層基質(zhì)（SIS)所得的PLGA-SIS配用5~7ml(較佳為 6ml)含黃芪甲苷的DMEM高糖培養(yǎng)液。
[0036] 作為本發(fā)明的生物納米補片的制備方法的進一步改進：
[0037] 所述步驟6)中的消化為:將步驟5)所得的小腸粘膜下層基質(zhì)浸泡（用量比為IOg/ 50ml)在0.02%EDTA-0.25%胰酶溶液的稀釋液中，于36.5~37.5°C恒溫搖床內(nèi)消化11.5~ 12.511(較佳為37°(3，1211) ;
[0038] 所述0.02 % EDTA-O . 25 %胰酶溶液的稀釋液為將0.02 % EDTA-O . 25 %胰酶溶液 (Trypsin-EDTA Solution，0 · 25% : 0 · 02% )與磷酸鹽緩沖液（PBS)按照V: V= 1:4混合后而 得；
[0039] 備注說明：上述0.02 % EDTA-0.25 %中，％為質(zhì)量體積％，即g/100ml。
[0040] 上述步驟5)所得的小腸粘膜下層基質(zhì)與0.02%EDTA-0.25%胰酶溶液的稀釋液的 用量比為lg/4~6ml;
[00411 m)TA為乙二胺四乙酸，胰酶為胰蛋白酶；
[0042] 所述步驟9)中的消化為:將第三代BMSC細胞浸泡在0.02 % EDTA-O . 25 %胰酶溶液 中，于36.5~37.5°C恒溫搖床內(nèi)消化11.5~12.5h(較佳為37°C，12h)。
[0043] 作為本發(fā)明的生物納米補片的制備方法的進一步改進：
[0044] 所述DMEM高糖培養(yǎng)液為Gibco DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號11965-092)。
[0045] 作為本發(fā)明的生物納米補片的制備方法的進一步改進：
[0046] 所述步驟5)中，
[0047]有機溶劑Π 為甲醇:氯仿= 1:1體積比(V:V)混合而得，每Ig粘膜下層基質(zhì)配用4~ 6ml的有機溶劑Π ，浸泡時間為10~14小時(例如為12h)。
[0048] 備注說明：用去離子水沖洗的次數(shù)為3次，每次25~35分鐘。
[0049]作為本發(fā)明的生物納米補片的制備方法的進一步改進：
[0050] 步驟1)和步驟2)均在2~4cm轉(zhuǎn)子，400~800rpm/s攪拌條件下進行。
[0051]作為本發(fā)明的生物納米補片的制備方法的進一步改進：
[0052] 步驟7)中的干燥為低溫真空干燥：于5~100的真空度、-60~_40°C的溫度下干燥 120~240分鐘；
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