Nedd4-2在帕金森病治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及Nedd4-2在帕金森病治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]帕金森病是一種中老年常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床上以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常等運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀為主要表現(xiàn)。最近幾年帕金森病的非運(yùn)動(dòng)癥狀逐漸引起人們的注意，這些癥狀不僅包括多汗、便秘等自主神經(jīng)功能障礙，嗅覺(jué)減退，視空間能力受損、記憶力下降等認(rèn)知障礙和焦慮、抑郁等情緒障礙，而且還有幻覺(jué)、妄想等精神障礙，嚴(yán)重者伴發(fā)癡呆。
[0003]目前公認(rèn)帕金森病的發(fā)病機(jī)制為黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元變性缺失和路易小體(Lewy body)形成[6]，同時(shí)興奮性毒性作用、環(huán)境因素、鈣超載、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激過(guò)度、年齡老化以及神經(jīng)干細(xì)胞隨衰老發(fā)生退行性變等諸多因素參與了帕金森病的發(fā)病過(guò)程[7]。
[0004]根據(jù)帕金森病的發(fā)病機(jī)制，延緩黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性和補(bǔ)充多巴胺是治療的基本原則，基于此，目前，左旋多巴仍然是治療帕金森病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它可以通過(guò)血腦屏障，在多巴胺脫羧酶的作用下變成多巴胺，發(fā)揮替代療法的作用，在疾病初期具有明顯的緩解作用，但長(zhǎng)期服用容易出現(xiàn)直立性低血壓、心律失常，并且易出現(xiàn)譫妄、幻覺(jué)等精神癥狀，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)異動(dòng)癥、劑末惡化現(xiàn)象、“開(kāi)-關(guān)”現(xiàn)象等并發(fā)癥，神經(jīng)干細(xì)胞移植和基因治療是近幾年新興的治療手段，但是因?yàn)槌杀竞惋L(fēng)險(xiǎn)較高，尚不能用于臨床的推廣。
[0005]谷氨酸(glutamate,Glu)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，釋放到突觸間隙，發(fā)揮作用后很快被位于星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元胞膜上的興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體所終止。真核生物高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(excitatory amino acid transporters ,EAATs)分為GLAST(EAATl)、GLT-1 (EAAT2)、EAAC1 (EAAT3)、EAAT4和EAAT5等5個(gè)亞型，其中，GLAST和GLT-1主要表達(dá)于腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞上，GLAST在小腦的Bergmann膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較高，在脊髓和前腦也有少量表達(dá)，GLT-1主要表達(dá)于前腦、海馬、大腦皮層和紋狀體等部位，GLAST和GLT-1不僅可單獨(dú)表達(dá)在不同神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，亦可同時(shí)表達(dá)于同一細(xì)胞的不同部位。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)GLAST和GLT-1可以清除細(xì)胞間隙90%以上的谷氨酸，從而保護(hù)神經(jīng)元免受谷氨酸興奮性毒性損傷[8]。因?yàn)楣劝彼崮芡挥|沒(méi)有降解遞質(zhì)的相應(yīng)酶，只能通過(guò)突觸前重?cái)z取終止遞質(zhì)的傳遞，所以，EAATs在清除遞質(zhì)、終止突觸傳遞中起重要作用，同時(shí)，EAATs通過(guò)迅速移除興奮性突觸釋放出的谷氨酸，有效維持了細(xì)胞外谷氨酸的低濃度，防止了興奮性擴(kuò)布的發(fā)生，同時(shí)也限制了潛在的興奮性毒性作用。
[0006]在帕金森病的眾多病理機(jī)制中，興奮性氨基酸的毒性作用一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，目前的研究證據(jù)提示，突觸前NMDA受體的激活等參與了谷氨酸的過(guò)度釋放，通過(guò)谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性作用選擇性導(dǎo)致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性或壞死，在H)的發(fā)病中起到重要作用[9]。
[0007]EAATs功能的異常和谷氨酸攝取的下降與帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)，F(xiàn)errarese等[1()]研究了34名ro患者和21名正常人的血小板谷氨酸攝取功能，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，原發(fā)性ro患者谷氨酸攝取量減少了50%，且攝取減少量與ro的嚴(yán)重程度有關(guān)。在6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-0HDA)和 1-甲基_4_苯基-1，2，3，6_四氫P比啶(Ι-methy 1_4_phenyl-Ι，2，3，6_tetrahydropyridine，MPTP)及其離子MPP+制造的FO鼠模型中，發(fā)現(xiàn)GLT-
1、EAAC1表達(dá)的減少和谷氨酸攝取的下降[11—13]。當(dāng)應(yīng)用抑制劑阻斷GLT-1后，伴有多巴胺合成限速酶一酪氨酸羥化酶磷酸化水平的降低，導(dǎo)致了多巴胺合成的較少[14]。然而，在PD患者和動(dòng)物模型上也發(fā)現(xiàn)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的升高，？1&^&1^8等[15]進(jìn)行的人腦原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元具有高表達(dá)的EAACl，說(shuō)明EAACl與PD具有密切的相關(guān)性。同時(shí)研究表明，在GLT-1表達(dá)下降的同時(shí)伴隨有EAACI攝取谷氨酸的增加和表達(dá)的增高[11’14]。同樣|&18816等[16]的研究也證實(shí)，在應(yīng)用6-0HDA后的第3周和第12周，GLT-1的在H)大鼠模型雙側(cè)紋狀體的表達(dá)增加。這些研究提示，在PD的發(fā)病過(guò)程中，隨著EAATs表達(dá)的下降，其攝取谷氨酸的能力降低，導(dǎo)致了細(xì)胞外谷氨酸水平的升高，胞外的谷氨酸持續(xù)作用于代謝性谷氨酸受體，激活多巴胺能神經(jīng)元胞內(nèi)第二信使三磷酸肌醇(inositoltriphosphate, IP3)與環(huán)腺苷二磷酸核糖，通過(guò)各自信號(hào)調(diào)控途徑誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，引起對(duì)Ca2+敏感的K+通道開(kāi)放，多巴胺能神經(jīng)元胞膜超極化導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)導(dǎo)致能量消耗增多、自由基形成，最終引發(fā)興奮性神經(jīng)毒性效應(yīng)[17]。而在PD中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的增加可能作為一種補(bǔ)償機(jī)制來(lái)對(duì)抗谷氨酸的興奮性毒性效應(yīng)，以EAACl為例，其在H)中表達(dá)的增加，一方面，攝取谷氨酸用來(lái)合成γ -氨基丁酸(GABA)，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性GABA能神經(jīng)元的突觸傳遞，一方面，攝取半胱氨酸用來(lái)合成谷胱甘肽，對(duì)抗機(jī)體的氧自由基損傷，研究表明，機(jī)體在氧化應(yīng)激條件下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子2-抗氧化劑應(yīng)答元件通路上調(diào)神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)體EAACl的表達(dá)[18]，從而提高谷胱甘肽的合成，對(duì)抗氧自由基損傷，另一方面，也有研究表明，在神經(jīng)退行性疾病患者的海馬，伴隨有非離子表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)處理后不可溶解的EAACl的聚集和谷氨酸攝取的降低，這種功能異常的EAACl是活性氧對(duì)其進(jìn)行了翻譯后氧化修飾形成的高分子量的多聚體，參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過(guò)程[19]。
[0008]研究表明，通過(guò)上調(diào)EAATs的表達(dá)，可以減弱興奮性毒性對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，例如，頭孢曲松鈉能夠提高谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1的表達(dá)，保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受興奮性毒性作用，從而減弱6-0HDA造成的運(yùn)動(dòng)缺陷[2()]，國(guó)內(nèi)胡剛實(shí)驗(yàn)室自主研制的ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，Katp)開(kāi)放劑埃他卡林(iptakalim，IPT)可以增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能，降低細(xì)胞外谷氨酸水平，從而對(duì)PD模型鼠起到一定的治療效應(yīng)[21]，顯示了該類藥物應(yīng)用于ro治療的前景。
[0009]EAATs主要利用Na+-K+ -ATP酶形成的Na+和K+的電化學(xué)濃度梯度來(lái)完成對(duì)谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，EAATs每轉(zhuǎn)運(yùn)一個(gè)谷氨酸分子，伴有3個(gè)Na+和I個(gè)H +同向轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，I個(gè)K+轉(zhuǎn)至細(xì)胞外，而EAATs只有在胞膜上表達(dá)才能發(fā)揮正常的攝取功能[22]。
[0010]調(diào)節(jié)谷氨酸攝取功能的一個(gè)重要機(jī)制是EAATs在胞漿和胞膜之間的動(dòng)態(tài)周轉(zhuǎn)循環(huán)。EAATs在胞漿合成、修飾完畢后，定位表達(dá)至細(xì)胞膜表面發(fā)揮攝取功能，而胞膜上的EAATs經(jīng)泛素化過(guò)程被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿的蛋白酶體系統(tǒng)，在蛋白酶體系統(tǒng)中，EAATs被降解或改變生物活性，從而維持細(xì)胞膜上EAATs的動(dòng)態(tài)水平。整個(gè)周轉(zhuǎn)循環(huán)受到復(fù)雜、精細(xì)的調(diào)控，一旦周轉(zhuǎn)循環(huán)異常，則導(dǎo)致細(xì)胞膜上的EAATs不能正常發(fā)揮功能，攝取谷氨酸的能力下降，介導(dǎo)興奮性毒性作用參與帕金森病的發(fā)生和發(fā)展。
[0011]泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過(guò)程，是翻譯后修飾的一種常見(jiàn)形式。早期的研究發(fā)現(xiàn)，泛素與靶蛋白結(jié)合，由泛素激活酶(ubi quit in-activating enzyme , El)、泛素結(jié)合酉每(ubiquitin-con jugaring enzyme ,E2)和泛素連接酶(ubiquitin protein ligase，E3)級(jí)聯(lián)催化形成多聚泛素鏈，在E3酶的作用下將被泛素化的底物提交給26S蛋白酶體降解，多聚泛素鏈在去泛素化酶(deubiquitinenZymes，DUBs)的作用下被解離為單體，重新回到泛素循環(huán)，這個(gè)過(guò)程稱為泛素蛋白酶體通路，主要參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解，這一研究獲得2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。其后的研究發(fā)現(xiàn)，并非所有泛素化修飾都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解，研究發(fā)現(xiàn)泛素化介導(dǎo)的非蛋白降解功能包括DNA損傷修復(fù)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、胞吞作用和蛋白激酶活化，因此，泛素化異常與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[23]。
[0012]在泛素化過(guò)程中，泛素激活酶El只有一種，泛素結(jié)合酶E2有20余種，而泛素連接酶E3有幾千種。El是通用的，E2、E3則具有底物特異性，即每一種E2和E3只識(shí)別、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合各自特定的一種或一類蛋白。其中，泛素連接酶E3分為HECT(homologous to E6AP Cterminus)家族和RING-finger家族，通過(guò)多泛素化或單泛素化將泛素分子連接到革E蛋白上，提交給蛋白酶體降解或改變靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位或功能[24]。
[0013]Nedd4屬于泛素連接酶E3，其在細(xì)胞膜蛋白和離子通道的泛素化過(guò)程中起重要作用，Nedd4有兩個(gè)異構(gòu)體:Nedd4_l和Nedd4_2。前期的研究證實(shí)Nedd4_2介導(dǎo)了上皮鈉離子通道和電壓門(mén)控鉀離子通道的泛素化降解過(guò)程[25]。
[0014]泛素連接酶E3功能異常與帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)，如Parkin(PARK2)屬于一個(gè)保守的泛素樣和環(huán)基序蛋白質(zhì)家族，是泛素連接酶E3的一種，Parkin基因突變導(dǎo)致蛋白酶體活性降低、線粒體自噬、氧化應(yīng)激水平增加，參與了帕金森病的發(fā)病過(guò)程[26]。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)基因4-2(NeuronaI precursor cell Expressed DevelopmentalIyDown-regulated 4-2，Nedd4_2)蛋白質(zhì)屬于泛素連接酶E3的一種，在細(xì)胞膜蛋白的泛素化過(guò)程中起作用。有研究表明，長(zhǎng)期接觸錳元素造成的錳中毒癥狀類似于原發(fā)性帕金森病的癥狀，機(jī)體通過(guò)激活PKC，導(dǎo)致了 Nedd4-2表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞上谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamine transporters)因過(guò)度泛素化而表達(dá)減少，證實(shí)Nedd4_2表達(dá)異常參與了猛中毒導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。目前，尚未有研究涉及Nedd4-2對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)節(jié)異常在H)發(fā)病過(guò)程中的作用及其調(diào)節(jié)分子機(jī)制，我們擬對(duì)此進(jìn)行深入研究。
[0015]參考文獻(xiàn)
[1]Chen W， Chen S， Xiao Qj Wang Gj Chen SD.Current clinical practicefor Parkinson’s disease among Chinese physicians, general neurologists andmovement disorders speciali