羅漢果皂甙提取物在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及羅漢果皂甙提取物在制備α-葡萄糖苷酶抑制 劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是以持續(xù)高血糖為基本生化特征的一種綜合病癥。主要是由于體內(nèi)胰島素 相對(duì)或絕對(duì)不足所引起的糖代謝紊亂所致。糖尿病患者在長(zhǎng)期高血糖的狀態(tài)下可產(chǎn)生多種 并發(fā)癥?，F(xiàn)今所報(bào)道的各種降糖物質(zhì)的機(jī)制有所差異，常為多靶點(diǎn)、多效應(yīng)、多途徑的綜合 作用，其中通過(guò)抑制a-葡萄糖苷酶的活性，延緩總體碳水化合物的消化時(shí)間，降低餐后高血 糖，防治糖尿病并減少糖尿病并發(fā)癥，被認(rèn)為是控制Π 型糖尿病的理想途徑。臨床上應(yīng)用的 α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物主要為:阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。由于阿卡波糖等均 為合成藥物，口服時(shí)會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐等胃腸道不良反應(yīng)。因此，越來(lái)越多的學(xué)者開始青睞 于從藥用植物中篩選天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑，以期待尋找到安全并有效的藥物。
[0003] 羅漢果（Siraitia grosvenorii(swingle)C.Jeffrey)為廣西特色中藥，研究表 明，強(qiáng)甜味的非糖物質(zhì)三帖類成分羅漢果皂甙是其主要的有效成分，具有多種生物活性。目 前關(guān)于羅漢果皂甙降血糖方面，有研究表明羅漢果皂甙粗提物在高血糖環(huán)境中能有效地保 護(hù)血管的內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)血管自身的舒張因子功能。周英等發(fā)現(xiàn)羅漢果提取物對(duì)于在體外 培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞具有刺激其胰島素分泌的作用。Suzuk等認(rèn)為羅漢果提取物有抑制麥芽糖 酶的活性，從而能抑制大鼠進(jìn)食麥芽糖后的血糖生成。何偉平等研究發(fā)現(xiàn)羅漢果皂甙能降 低血清中游離脂肪酸，并減輕糖尿病發(fā)展過(guò)程中的氧化應(yīng)激，減輕血管內(nèi)皮損傷。張麗勤等 研究表明羅漢果皂甙粗提物對(duì)于糖尿病小鼠具有降血糖，降血脂，調(diào)節(jié)免疫及抗氧化功能。 而有關(guān)羅漢果粗提物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的相關(guān)研究尚未見有關(guān)報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種羅漢果皂甙提取物的新應(yīng)用，具體為羅漢果皂甙在α-葡萄糖苷酶抑制劑中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)技術(shù)目標(biāo)：
[0006] 羅漢果皂甙提取物在α-葡萄糖苷酶抑制劑中的應(yīng)用。
[0007] 其中所述的羅漢果皂甙提取物的藥物和保健品的劑型是膠囊劑、片劑、顆粒劑或 口服液中任意一種。
[0008] 所述的羅漢果皂甙提取物用于制備α-葡萄糖苷酶抑制劑由下列方法制備：
[0009] (1)挑選果齡為40~50d的羅漢果鮮果，清洗去毛后，真空冷凍干燥，粉碎機(jī)粉碎， 過(guò)20~100目篩，備用；
[0010] (2)取粉碎后的羅漢果粉末，按照1:30~60(w/v)的料液比，加入60~80 %的乙醇， 70~80 °C的水浴鍋中加熱回流提取1~3h，過(guò)濾，得濾液，濾渣重復(fù)提取1~3h，過(guò)濾，合并前 后兩次濾液，3000~5000r/min離心20~40min，得上清液，真空濃縮干燥后備用；
[0011] (3)取一玻璃層析柱，大孔吸附樹脂濕法裝柱，將上述提取物用水溶解后上柱，流 速為1~2mL/min，上樣結(jié)束后，用純水沖洗柱子至流出液無(wú)色，然后用3~5倍柱體積60~ 70 %乙醇溶液進(jìn)行洗脫，同時(shí)收集洗脫液，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；
[0012] (4)取一玻璃層析柱，離子交換樹脂濕法裝柱，取得到的上述濃縮液上樣，流速為1 ~2mL/min，吸附完成后，用純水以5~7mL/min的流速洗脫，同時(shí)收集洗脫液，抽濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)濃縮和真空干燥，得到羅漢果皂甙粗提物粉末，所述的羅漢果皂甙粗提物粉末中羅漢 果皂甙V含量為30~35%、羅漢果皂甙IV含量為10~14%和羅漢果皂甙III的含量為10~ 14%〇
[0013] 本發(fā)明的有益效果：
[0014] 本發(fā)明研究表明，羅漢果皂甙提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，其對(duì) α_葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型抑制，且對(duì)α-葡萄糖苷酶內(nèi)源性熒光產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜態(tài)猝 滅作用。提示羅漢果皂甙提取物可在制備治療及輔助治療Π 型糖尿病的食品、保健食品及 藥品中應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為本發(fā)明的羅漢果皂甙V的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0016]圖2為本發(fā)明的羅漢果皂甙IV的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0017] 圖3為本發(fā)明的羅漢果皂甙III的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0018] 圖4為本發(fā)明的阿卡波糖(a)及羅漢果皂甙粗提物(b)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果 圖；
[0019]圖5為本發(fā)明的羅漢果阜戒粗提物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk 曲線；
[0020] 圖6為本發(fā)明的羅漢果粗提取物在310Κ下對(duì)Cl-葡萄糖苷酶熒光的猝滅作用（c)和 在298Κ、303Κ、310Κ下與α-葡萄糖苷酶作用的熒光猝滅曲線(d)。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了更詳細(xì)的說(shuō)明本發(fā)明，給出下述實(shí)例，實(shí)例中所用的羅漢果皂甙提取物即為 上述方法制備的羅漢果皂甙粗提物，羅漢果皂甙粗提物的有益效果可以說(shuō)明羅漢果皂甙提 取物的有益效果，但本發(fā)明的范圍并不局限于此實(shí)施例。
[0022] 實(shí)施例:羅漢果皂甙提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制
[0023] 1.1試劑及主要儀器
[0024] 4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷（CAS:3767-28-0)、a-葡萄糖苷酶（CAS:9001-42-7)均 購(gòu)于美國(guó)sigma公司；阿卡波糖購(gòu)于德國(guó)拜耳公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。美國(guó)Bio-tek SynergyTM HT超級(jí)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek公司；瑞士 Tecan Infinite 200 PRO NanoQuant酶標(biāo)儀，瑞士 Tecan集團(tuán)公司。
[0025] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0026] 1.2.1羅漢果皂甙提取物的制備
[0027] (1)挑選果齡為40~50d的羅漢果鮮果，清洗去毛后，真空冷凍干燥，粉碎機(jī)粉碎， 過(guò)40目篩，備用。
[0028] (2)取粉碎后的羅漢果粉末，按照1:40(w/v)的料液比，加入70 %的乙醇，80°C的水 浴鍋中加熱回流提取2h，過(guò)濾，得濾液，濾渣重復(fù)提取2h，過(guò)濾，合并前后兩次濾液，4500r/ min離心30min，得上清液，真空濃縮干燥后備用。
[0029] (3)取一玻璃層析柱，LXA-8大孔吸附樹脂濕法裝柱，將上述提取物用水溶解后上 柱，流速為2mL/min。上樣結(jié)束后，用純水沖洗柱子至流出液無(wú)色，然后用三倍柱體積60%乙 醇溶液進(jìn)行洗脫，同時(shí)收集洗脫液，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得濃縮液。
[0030] (4)取一玻璃層析柱，700B離子交換樹脂濕法裝柱。取得到的濃縮液上樣，流速為 2mL/min。吸附完成后，用純水以5mL/min的流速洗脫，同時(shí)收集洗脫液，抽濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃 縮和真空干燥，可得羅漢果皂甙粗提物粉末，總皂甙的含量在75 %以上。
[0031] 1.2.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0032]用10%的乙腈做溶劑，準(zhǔn)確稱取一定量的羅漢果皂甙粗提取物，配制成濃度為 lmg/mL的溶液，0 · 22μηι微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。
[0033] (1)高效液相色譜條件為：色譜柱，Waters ODS Ci8(4.6mmX 150mm I .D.5ym);流 速:0.8mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):203nm;進(jìn)樣量：IOyL;流動(dòng)相:0.1% (v/v)磷酸水(A)和乙腈(B)梯 度洗脫，0min:10%B;10min，17%B;20min，17%B ;30min，20%B;40min，20%B;50min，23% B;60min，23%B;70min，26%B;80min，26%B。
[0034] (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用10 %的乙腈作溶劑，分別配制濃度為Omg/mL、0.4mg/mL、 0 · 6mg/mL、0 · 8mg/mL、I · Omg/mL的羅漢果皂甙V、羅漢果皂甙IV和羅漢果皂甙III的標(biāo)準(zhǔn)溶 液，按上述液相色譜條件，以高效液相色譜峰面積-含量分別作羅漢果皂甙V、羅漢果皂甙IV 和羅漢果皂甙III的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到三種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
[0035] 1.2.3羅漢果皂甙提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的分析
[0036]反應(yīng)體系以4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)為底物建立篩選模型。在96孔板上 加入a-葡萄糖苷酶(0.32U/mL，IOyL)、不同濃度羅漢果提皂甙提取物樣品溶液（IOyL)與pH =6.8的磷酸鹽緩沖溶液(5(^1^)于37°(：中孵育1〇1^11，再加入4-硝基-€[-0-吡喃葡萄糖苷 (PNPG) (10yL，2.5mM)，放入 37°C恒溫 Tecan Infinite 200 PRO NanoQuant 酶標(biāo)儀中反應(yīng) 15min，以Na0H( 20yL