一種紫花牡荊素肺靶向脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種紫花牡荊素肺靶向脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用，屬于肺癌藥物研 究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，發(fā)達(dá)國家肺癌的5年生 存率約10%~15%，在我國則更低。肺癌患者中80%~85%為非小細(xì)胞肺癌，且多數(shù)患者初 次診斷時(shí)已處于晚期（mb/iv期），失去手術(shù)機(jī)會(huì)。放療和化療雖可在一定程度上改善肺癌 的整體治療水平，但效果并不理想。放療難以根除浸潤轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞，而化療無選擇性， 在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)正常細(xì)胞造成傷害。因此，尋找更為有效和安全的治療手段成為 當(dāng)前肺癌研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0003] 由于脂質(zhì)體(liposomes)能夠保護(hù)藥物避免其在血漿中降解、繞開外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 利于藥物靶向入肺部，顯著增加肺部藥物濃度，從而提高治療效果并減小全身毒副作用，廣 泛用于肺部藥物傳遞的研究。轉(zhuǎn)鐵蛋白（transf errin，TF)是一類Π 型跨膜糖蛋白家族，由2 個(gè)單體(90 000)經(jīng)二硫鍵交聯(lián)而成。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(1:瓜1181^1-^〇6卩1:〇1'1?1〇在分裂活躍 的細(xì)胞上表達(dá)水平很高，在腫瘤細(xì)胞上每個(gè)細(xì)胞能達(dá)到1萬~10萬個(gè)分子，而在非增殖細(xì)胞 上很少表達(dá)，甚至檢測不到。TF/TFR系統(tǒng)在轉(zhuǎn)運(yùn)抗癌藥、蛋白質(zhì)以及基因治療藥物上顯示出 了很大潛能?；诖?，有望提供以中方肺靶向脂質(zhì)體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種紫花牡荊素肺靶向脂質(zhì)體及其制備方法與應(yīng)用，本法通 過將革G向肺癌的功能基配體TF (轉(zhuǎn)鐵蛋白）修飾到脂質(zhì)體表面，增加脂質(zhì)體到達(dá)肺部的能 力；同時(shí)，本發(fā)明將紫花牡荊素包載到靶向脂質(zhì)體中，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞促凋亡作用，為殺 死腫瘤細(xì)胞提供可能，從而防止治療后因細(xì)胞殘留而引起腫瘤復(fù)發(fā)。
[0005] 本發(fā)明所提供的靶向脂質(zhì)體，由脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)鐵蛋白組成；
[0006] 所述轉(zhuǎn)鐵蛋白連接于所述脂質(zhì)體的羧基。
[0007] 上述的靶向脂質(zhì)體中，所述脂質(zhì)體的羧基可由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG-C00H)提供。
[0008] 上述的靶向脂質(zhì)體中，所述脂質(zhì)體具體可由卵磷脂、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇（DSPE-PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基（DSPE-PEG-⑶0H)制備 得到；
[0009] 各原料的摩爾份數(shù)可為：
[0010] 所述卵磷脂80~88份；
[0011] 所述膽固醇7~15份；
[0012] 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.2~4.8份；
[0013] 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.2~0.7份；
[0014] 各原料的摩爾份數(shù)具體可為：
[0015] 所述卵磷脂84份；
[0016] 所述膽固醇11份；
[0017]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.5份；
[0018]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.5份。
[0019]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇具體可為二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙 二醇2000(DSPE-PEG2000);
[0020] 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基具體可為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚 乙二醇 2000-羧基交連物(DSPE-PEG2000-C00H)。
[0021] 上述的靶向脂質(zhì)體中，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白與所述脂質(zhì)體的質(zhì)量比可為1:8.1~9.1，具 體可為1:8.6。
[0022]本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述靶向脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟：在碳二亞胺 (EDCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)存在的條件下，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白連接于所述脂質(zhì)體的所述 羧基上，即得所述靶向脂質(zhì)體。
[0023]上述的制備方法中，所述脂質(zhì)體可由所述卵磷脂、所述膽固醇、所述二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺-聚乙二醇與所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基通過硫酸銨梯度法制備 得到。
[0024]上述的制備方法中，所述碳二亞胺與所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的摩爾比為12~18:1，具體可 為16.5:1;
[0025] 所述N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為35~40:1，具體可為39.7:1。
[0026] 以所述靶向脂質(zhì)體為活性成分的藥物載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027] 本發(fā)明還提供一種載藥脂質(zhì)體，其由所述靶向脂質(zhì)體包載藥物得到。
[0028] 所述載藥脂質(zhì)體中，所述藥物具體可為紫花牡荊素（Casticin，CAS)分子式為 C19H18O8,相對(duì)分子質(zhì)量374.35,恪點(diǎn)為186~187°C，純品為淡黃色晶體。紫花牡荊素學(xué)名5， 3 二羥基-3，6，7，4 四甲氧基黃酮，又叫蔓荊子黃素，屬于多甲氧基黃酮類化合物。
[0029]所述載藥脂質(zhì)體的藥脂比為1:20~40，具體可為1:30;
[0030] 所述藥脂比指的是所述藥物的質(zhì)量與所述靶向脂質(zhì)體中的所述卵磷脂和所述膽 固醇的質(zhì)量之和的比值。
[0031] 本發(fā)明提供的載藥脂質(zhì)體可用于治療肺癌，所述肺癌可為肺腺癌，具體可為A549 肺腺癌。
[0032] 本發(fā)明所述載藥脂質(zhì)體能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡，所述肺癌細(xì)胞可為肺腺癌細(xì) 胞，具體可為A549肺腺癌。
[0033]本發(fā)明將TF修飾到脂質(zhì)體表面，增強(qiáng)肺靶向的能力，同時(shí)具有靶向腫瘤細(xì)胞的作 用;將抗腫瘤藥紫花牡荊素包載到脂質(zhì)體中，得到靶向功能的靶向肺癌細(xì)胞的脂質(zhì)體，能使 藥物到達(dá)病灶部位，并預(yù)期能有效防止腫瘤復(fù)發(fā)。本發(fā)明為徹底根治肺癌帶來了希望，具有 重要的理論意義與臨床意義。
【附圖說明】
[0034]圖1為本發(fā)明載藥脂質(zhì)體(TF-CAS-脂質(zhì)體)的透射電鏡照片。
[0035]圖2為本發(fā)明載藥脂質(zhì)體(TF-CAS-脂質(zhì)體)的藥物釋放曲線。
[0036]圖3為A549肺腺癌細(xì)胞的形態(tài)。
[0037]圖4為不同載藥脂質(zhì)體對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的抑制作用。
[0038]圖5為激光共聚焦法檢測細(xì)胞對(duì)不同載藥脂質(zhì)體的攝取及其在細(xì)胞內(nèi)的分布行 為，其中，圖5(A1)、圖5(A2)和圖5(A3)表示細(xì)胞對(duì)游離紫花牡荊素(CAS)的攝取及其在細(xì)胞 內(nèi)的分布行為，圖5(B1)、圖5(B2)和圖5(B3)表示細(xì)胞對(duì)CAS-脂質(zhì)體的攝取及其在細(xì)胞內(nèi)的 分布行為，圖5(C1)、圖5(C2)和圖5(C3)表示細(xì)胞對(duì)TF-CAS-脂質(zhì)體的攝取及其在細(xì)胞內(nèi)的 分布行為。
[0039]圖6為A549肺腺癌細(xì)胞對(duì)不同載藥脂質(zhì)體的攝取能力，其中，圖6(A)表示A549肺腺 癌細(xì)胞對(duì)空白脂質(zhì)體的攝取能力，圖6(B)表示A549肺腺癌細(xì)胞對(duì)紫花牡荊素-脂質(zhì)體的攝 取能力，圖6(C)表示A549肺腺癌細(xì)胞對(duì)TF-紫花牡荊素-脂質(zhì)體的攝取能力。
[0040]圖7為不同載藥脂質(zhì)體對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的凋亡作用，其中，圖7(A)表示游離紫花 牡荊素(CAS)對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的凋亡作用，圖7(B)表示CAS-脂質(zhì)體對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的 凋亡作用，圖7(C)表示TF-CAS-脂質(zhì)體對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的凋亡作用。
【具體實(shí)施方式】
[0041 ]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 下述實(shí)施例所用的試劑和儀器如下：
[0044] 1、實(shí)驗(yàn)試劑和細(xì)胞
[0045] 蛋黃卵磷脂（EPC)購自Germany Lipoid company ,ShangHai local agent ,China; 膽固醇(cholesterol)購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇（DSPE-TOG2000)購自日本油脂株式會(huì)社（日本NOF公司）；轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF)、葡聚糖凝膠 (shephedex G