Virosaine A的哌嗪基和咪唑基衍生物的組合物在抗急性痛風藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其在制備抗急性痛風藥物上的用途。本發(fā)明公開了一種組合物及其制備方法。藥理學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有抗急性痛風的作用，具有開發(fā)抗急性痛風藥物的價值。
【專利說明】
Vi rosa i ne A的哌嗪基和咪唑基衍生物的組合物在抗急性痛 風藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 痛風（gouty)，又稱痛風性關節(jié)炎（gouty arthritis)，是體內噪呤代謝紊亂所致 的疾病，表現(xiàn)為血中尿酸過多，易于使尿酸鹽(MSU)在關節(jié)等組織析出結晶。痛風的急性發(fā) 作是由于沉積在關節(jié)的MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應。
[0003] 西藥在痛風急性發(fā)作期選用三種藥:秋水仙堿、非留體抗炎藥和腎上腺皮質激素。 秋水仙堿的作用機制是與中性粒細胞的微管蛋白結合，從而妨礙粒細胞的活動，抑制粒細 胞浸潤。非甾體抗炎藥如吲哚美辛，抑制環(huán)氧酶（C0X)活性而發(fā)揮抗炎作用，以及選擇性 C0X2抑制藥。它們雖然消炎止痛作用快，但毒副作用也相當明顯，如秋水仙堿的有效劑量與 產(chǎn)生腹瀉等胃腸道癥狀的劑量相近，非留體抗炎藥在有活動性消化性潰瘍、胃腸道出血情 況下絕對禁用，而保泰松用藥短至3周也可致嚴重的粒細胞減少癥或再生障礙性貧血。
[0004] 從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
[0005] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個2012年發(fā)表（Bing-Xin Zhao et al .， 2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的化合物，我們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化 合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗抗急性痛風活性進行了 評價，其具有抗急性痛風活性。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質量百分數(shù)分別為45%和55%。
[0008] 本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
[0009] 本發(fā)明用尿酸鈉(MSU)致人血管內皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示， 本發(fā)明組合物對MSU致HUVEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達，可用于制備治療急性 痛風炎癥藥物。本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明組合物在醫(yī)學中的新用途，具體地說是涉及 本發(fā)明組合物在制備治療急性痛風藥物中的應用。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的：
[0011] 現(xiàn)代醫(yī)學病理研究說明，痛風性關節(jié)炎是MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反 應，急性痛風產(chǎn)生的本質是中性粒細胞(PMN)-血管內皮細胞(HUVEC)黏連增強(Terkeltaub R，et al.The murine homolog of the interleukin-8receptorcxcr-2is essential for the occurrence of neutrophilic inflammation in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis.Arthritis Rheum，1998,41(5):900-909.)，HUVEC損 傷，其分子生物學基礎在于PMN與HUVEC表面黏附分子的相互作用（FujiwaraY，et al.Interleukin-8stimulates leukocyte migration across amonolayer of cultured rabbit NF_a，IL-10，IL-8，and IL-lrain Monosodium Urate Crystal induced rabbit arthritis.Labinvest，19998,78(5): 559-569.)，其中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)與粘附 功能關系最密切，是急性痛風炎癥的重要指標之一(張春，唐怡，劉軍，等.痛風靈方對尿酸 鈉致大鼠模型關節(jié)軟組織ICAM-1表達的影響，重慶醫(yī)學，2002,31(12): 1211-1213.)。
[0012 ] 因此，針對急性痛風MSU致HUVEC損傷，I CAM-1表達增多的病理特征，本發(fā)明用MSU 致HUVEC損傷的體外急性痛風模型(楊妍華，尹蓮，王明艷，等.尿酸鈉誘導HUVEC損傷的急性 痛風模型研究，中華中醫(yī)藥學刊，2010,28(3):592-594.)，評價本發(fā)明組合物抗急性痛風炎 癥活性。MSU致人血管內皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示，本發(fā)明組合物對MSU 致HUVEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達。
[0013]有益效果
[0014]研究結果表明，用MSU致HUVEC損傷的急性痛風模型評價顯示，本發(fā)明組合物可保 護MSU致HUVEC損傷，減少細胞凋亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風炎癥 的活性，本發(fā)明組合物可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。
[0015]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1化合物Virosaine A的制備
[0017] 化合物Virosaine A(I)的制備方法參照Bing-Xin Zhao等人發(fā)表的文獻(Bing-Xin Zhao et al.,2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的方法。
[0019] 實施例2 Virosaine A的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0020] 將化合物I (235mg，1. OOmmo 1)溶于20mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙烷(3.76(^，20.00臟〇1)和51^的50%氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏 度攪拌Shdh之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后 對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶 劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮=100:1. 〇，v/V)，收 集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(26lmg，78% )。
[0021] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)S5.91(s，lH)，4.07(S，1H)，3.81(s，2H)，3.59(S，1H)， 3.43(s，2H)，3.33(s，lH)，2.26(s，lH)，1.58(d，J=9.8Hz，3H)，1.41(s，2H).
[0022] 13C 匪R(125MHz，DMS0-d6)Sl71.81(s),106.71(s)，79.95(s)，74.33(s),69.81 (s),66.68(s),44.21(s),35.56(s),33.28(s),25.85(s),21.88(s).
[0023] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci4Hi7BrN〇4:342.0341 ；found 342.0343.
[0025] 實施例3 Virosaine A的0_(哌嗪基）乙基衍生物（III)的合成 [0026] 將化合物II(17lmg，0.5mmo 1)溶于20mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg， 5.0mmol)，碘化鉀（168mg，1 .Ommol)和無水哌嗪（3446mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應 結束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100: l.〇，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物III的淡棕色固體(123.2mg，71 % )。
[0027] MMR(500MHz，DMS0-d6)S5.90(s，lH)，4.04(s，lH)，3.59(s，lH)，3.50(s，2H)， 3.40(d，J=65.9Hz，lH)，2.64(s，4H)，2.54(s，2H)，2.31(s，4H)，2.22(s，lH)，1.62(s，2H)， 1.56(s，lH)，1.43(s，2H)，0.97(s，lH).
[0028] 13C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl71.84(s)，106.72(s)，79.94(s)，74.33(s)，66.72(d， J=9.2Hz),54.45(s),54.16(s),45.25(s),44.20(s),35.56(s),25.86(s),21.87(s).
[0029] HRMS(ESI):m/z[M+H].calcd for Ci8H26N3〇4:348.1923;found:348.1927。
[0032] 實施例4 Virosaine A的0_(咪唑基）乙基衍生物（IV)的合成
[0033] 將化合物II(17lmg，0.5mmo 1)溶于25mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg， 5 ? Ommo 1)，碘化鉀（2 5 2mg，1 ? 5mmo 1)和咪唑（8 7 Omg，1 Ommo 1)，混合物加熱回流2h。反應結束 后將反應液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100:0.3，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物IV的淡棕色固體(144. lmg，71 % )。
[0034] XH NMR(500MHz,DMS0-d6)87.86(s,lH),7.12(s,lH),6.71(s,lH),5.99(s,lH), 4.09(s,lH),3.89(d,J=16.4Hz,2H),3.80(s,2H),3.58(s,lH),3.35(s,lH),2.31(s,lH), 1.68(s,lH),1.58(s,2H),1.44(s,2H).
[0035] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)13C 匪R(125MHz，Common 匪R Solvents)Sl71.82(s), 139.64(s),128.67(s),119.31(s),106.70(s),79.92(s),74.31(s),67.61(s),66.66(s), 44.20(s),43.75(s),35.52(s),25.85(s),21.86(s).
[0036] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for Ci7H2〇N3〇4:330.1454;found:330.1458。
[0038]實施例5組合物抗急性痛風炎癥實驗 [0039] 1、溶液配制
[0040] 5g尿酸加1000ml蒸餾水煮沸，加5%NaOH溶液調PH 7.4，攪拌，冷卻析晶制成尿酸 鈉結晶(MSU)。將制好的MSU 10mg高壓滅菌，加不含血清的DMEM培養(yǎng)液10ml，研磨配成lmg/ ml的DMEM溶液。實驗時，此溶液再加DMEM培養(yǎng)液配成不同濃度DMEM的MSU溶液。
[00411 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的45mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的55mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物， 使用時用水溶解這l00mg的組合物即得到組合物的溶液。
[0042] 組合物、化合物III或者化合物IV 2.5mg，用二甲基亞砜(DMS0)溶解，DMS0終濃度〈 0.02 %，再加無血清的DMEM培養(yǎng)液，配制成濃度25ug/ml。
[0043] 2、血管內皮細胞的體外培養(yǎng)
[0044]人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC株由南京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院提供，細胞經(jīng)支原 體檢測，無支原體污染，細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，含10 %小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和， 離心（1000r/min X 6min)，去上清液，加含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，移入細胞培養(yǎng)瓶中， 放37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。
[0045] 3、對MSU刺激HUVEC活力的影響
[0046] HUVEC在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待生長至70 %~80 %融合時，以0.25%胰蛋白酶消化、離 心，10 %小牛血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，用10 %小牛血清DMEM培養(yǎng)液調成4 X 104/ml細胞懸 液，植入96孔板(每孔200ul)，培養(yǎng)24小時后輕吸出原培養(yǎng)液，進行以下實驗，每組各8孔，具 體分組及加液如下：對照組（200ul DMEM培養(yǎng)液）、模型組（100ug/ml MSU溶液）、干預組 (100ug/ml MSU溶液+25ug/ml的組合物或者化合物），加液后繼續(xù)放37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)24小時，收集上清液，剩余的HUVEC用于測定細胞活性，每孔再加5mg/ml MTT液20ul，繼 續(xù)放37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后，棄MTT液，加入二甲基亞砜200ul溶解，震蕩，于酶 標儀讀取吸光度值，波長490nm〇
[0047] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理，細胞活力（％ )=實驗組吸光度值/對照組吸光度值X 100 %，結 果見表1。
[0048]與對照組相比，模型組細胞活力顯著減小(P〈0.05)，組合物干預后細胞活力顯著 提高(P〈0.05)，并強于對照組，而化合物III和化合物IV無此活性。
[0049] 表1組合物對MSU刺激的血管內皮細胞活力的影響（X)
[0052] 注:與模型組相比，*P〈0.05;與對照組相比，AP〈0.05
[0053] 4對ICAM-1表達影響
[0054]將處于對數(shù)生長期的HUVEC用0.25 %的胰蛋白酶消化，輕輕吹打，制成細胞懸液， 調整細胞密度為5 X 109/L，接種于細胞培養(yǎng)瓶中。待細胞長滿后(約24h)，棄去上清液，分為 下列組:對照組、模型組（l〇〇ug/ml MSU溶液）、干預組（100ug/ml MSU溶液+25ug/ml組合物 或者化合物），繼續(xù)培養(yǎng)24小時，PBS收集細胞，離心去上清，加入⑶54單克隆抗體，30min后， PBS洗滌，重懸細胞，應用流式細胞儀檢測其陽性細胞百分率(n= 10000 )，重復3次，結果見 表2。
[0055] 表2組合物對MSU刺激的血管內皮細胞ICAM-1表達的影響（歹）
[0057] 注:與模型組相比，*P〈0.05;與對照組相比，AP〈0.05
[0058] 結果顯示，空白組HUVEC幾乎無ICAM-1表達，模型組ICAM-1的表達最高，與模型組 相比，組合物對I CAM-1的表達有顯著的抑制作用，而化合物III和化合物IV無顯著的抑制作 用。
[0059] 結論：用MSU致HUVEC損傷的急性痛風模型評價顯示，組合物可保護MSU致HUVEC損 傷，減少細胞凋亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風炎癥的活性，組合物可 用于制備治療急性痛風炎癥藥物。而化合物III和化合物IV不能保護MSU致HUVEC損傷，不能 減少細胞凋亡，不能提高細胞活性，不能抑制ICAM-1表達，不具有抗急性痛風炎癥的活性， 不能用于制備治療急性痛風炎癥藥物。
[0060] 實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0061] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
[0062] 實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0063] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權項】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質量百分數(shù)分別為45%和55%，2. 如權利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質量百分數(shù)分別為45 %和55 %充分混合。3. 如權利要求1所述的一種組合物在治療急性痛風藥物中的應用。4. 如權利要求3所述的組合物在治療急性痛風藥物中的應用，其特征為:所述急性痛風 是由尿酸鈉誘導的。5. 如權利要求3所述的組合物在治療急性痛風藥物中的應用，其特征為:組合物減少人 血管內皮細胞的損傷，提高人血管內皮細胞的活性。6. 如權利要求3所述的組合物在治療急性痛風藥物中的應用，其特征為:組合物減少急 性痛風過程中ICAM-1的表達。
【文檔編號】A61P29/00GK105853428SQ201610278425
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】蔣登旭
【申請人】鎮(zhèn)江瑪珂蕘生物醫(yī)藥科技有限公司