TNFR:Fc融合多肽的替代配方的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一類水中穩(wěn)定的制藥組合物，可以實(shí)現(xiàn)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的FC融合多肽的儲(chǔ)存。
【專利說明】
TNFR: Fc融合多肽的替代配方
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一類水中穩(wěn)定的制藥組合物，可以在無需某些特定氨基酸的狀態(tài)下實(shí) 現(xiàn)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的FC融合多肽的儲(chǔ)存。
【背景技術(shù)】
[0002] 多肽制劑在使用前通常需儲(chǔ)存。然而，液態(tài)多肽在長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存時(shí)會(huì)很不穩(wěn)定，特別 是在沒有精氨酸等穩(wěn)定劑存在的時(shí)候。液態(tài)儲(chǔ)存的一種替代方法是將多肽制備成凍干形 式。然而，凍干多肽的復(fù)原常常導(dǎo)致凝聚或變性，而凝聚會(huì)讓多肽產(chǎn)生免疫原性，這是不希 望看到的。
[0003] 依那西普(商品名ENBREL?)是一種市售可溶性、融合有FC結(jié)構(gòu)域的腫瘤壞死因子 (TNF)受體。作為TNF抑制劑，依那西普有可以干擾TNF的作用。它是一種二聚體融合多肽，由 人的75kDa(P75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的細(xì)胞外配體結(jié)合部分與人類IgGl的Fc部分融 合而成，目前，該二聚體融合多肽的生產(chǎn)中采用L-精氨酸和/或L-半胱氨酸作為凝聚抑制 劑，以防止多肽的凝聚（參見EP1478394B1)。
[0004] 然而，精氨酸在某些人身上可能會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的副作用。注射精氨酸后，會(huì)引發(fā)一種 口 Hi型超敏反應(yīng)的嚴(yán)重過敏反應(yīng)，以及惡心、胃痙攣等胃部不適癥狀或大便次數(shù)增加。其他 潛在的副作用包括低血壓，以及血液中大量化學(xué)物質(zhì)和電解質(zhì)發(fā)生紊亂，如出現(xiàn)高鉀、高 氯、低鈉、低磷酸鹽、高血尿素氮和高肌酸酐等。理論上，精氨酸可能會(huì)增加出血風(fēng)險(xiǎn)，抬高 血糖、血鉀水平，并可能使鐮狀紅細(xì)胞貧血癥患者的癥狀惡化。
[0005] 半胱氨酸是一個(gè)非必需氨基酸，與胱氨酸密切相關(guān)，因?yàn)殡装彼嵊蓛蓚€(gè)半胱氨酸 分子結(jié)合而成。半胱氨酸不穩(wěn)定，很容易轉(zhuǎn)化為胱氨酸。而過多胱氨酸在體內(nèi)積聚可引起一 種罕見的疾病一一胱氨酸貯積癥，從而在身體內(nèi)產(chǎn)生胱氨酸結(jié)晶，形成膀胱結(jié)石或腎結(jié)石。 此外，半胱氨酸補(bǔ)充劑可增加糖尿病和胱氨酸尿癥患者并發(fā)癥也是眾所周知的。
[0006] 專利W020 13/006454公開了一類不含精氨酸的多肽組合物，其配方與專利 EP1478394B1所公開的配方相似，但用鹽取代了后項(xiàng)專利所使用的精氨酸。根據(jù)該專利所提 供的實(shí)例，這種鹽的濃度是140mM(參見實(shí)施例1)。該專利未對(duì)多肽組合物高溫下的穩(wěn)定性 做出說明，不過實(shí)際上，專利中公開的組合物是以2-8°C的液態(tài)或冰凍狀態(tài)儲(chǔ)存的。
[0007] 本發(fā)明通過提供一種新型穩(wěn)定的溶液配方解決了上述問題。該配方可實(shí)現(xiàn)TNFR: Fc多肽的液態(tài)存儲(chǔ)。并且，發(fā)明人意外地觀察到，本專利所公開的穩(wěn)定的水溶液配方完全不 需要精氨酸和半胱氨酸就能夠制備出來，并且高溫下仍然穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明的第一部分
[0009] 本發(fā)明的第一部分內(nèi)容是基于以下發(fā)現(xiàn):存在于分離的多肽（亦即由人的75kDa月中 瘤壞死因子受體的細(xì)胞外配體結(jié)合部分與人類IgGl的Fc部分融合組成的多肽)溶液中一定 量的鹽，可以增加蛋白質(zhì)在5°C以上高溫下的穩(wěn)定性。此外，選擇的鹽濃度與生理鹽水濃度 接近。
[0010] 因此，本發(fā)明涉及一種水溶液組合物，包括：
[0011] -種分離的多肽，是由人的P75腫瘤壞死因子受體的細(xì)胞外配體結(jié)合部分與人類 IgGl的Fc部分融合而成；
[0012] -種鹽，其濃度為80-130mM;
[0013] -種賦形劑，選自海藻糖和蔗糖或它們的組合；
[0014] 該水溶液組合物的特征在于，在其組份中既不含精氨酸也不含半胱氨酸。
【附圖說明】
[0015] 圖1為各樣品在330-310nm處的熒光比條件下的帶有誤差線的相對(duì)展開溫度 (T_et/°C)的柱狀圖。
[0016] 圖2A和2B為各種配方初始時(shí)pH值和滲透壓的柱狀圖。
[0017]圖3A顯示在所有時(shí)間（0至14天)及相關(guān)條件(-20°C、25°C、50°C、3次冷凍/解凍(-2(rC/25°C條件下)和攪動(dòng)3天)下測(cè)量出的蛋白質(zhì)濃度(280nm處的吸光度）。
[0018] 圖3B顯示配方F3在6個(gè)月（0、1、3和6個(gè)月）時(shí)間內(nèi)及相關(guān)條件下（_20°C、2-8°C、25 °C、1、2、4次冷凍/解凍(-20°C/25°C條件下））測(cè)量出的蛋白質(zhì)濃度(280nm處的吸光度）。
[0019] 圖4A顯示在所有時(shí)間（0至14天）及相關(guān)條件下（-20°C、25°C、50°C條件下、3次冷 凍/解凍(_2〇°C/25°C條件下)及攪動(dòng)3天)測(cè)量出的濁度值(330nm處的吸光度）。
[0020] 圖4B (1)顯示配方F3在6個(gè)月（0、1、3和6個(gè)月）時(shí)間內(nèi)及相關(guān)條件下(-20 °C、2-8 °C、 25°C、1、2、4次冷凍/解凍循環(huán)(-20°C/25°C條件下））測(cè)量出的濁度值(330nm處的吸光度）。 [0021] 圖4B(2)顯示配方FI、F5、F6和F8在3個(gè)月（分別是0、1和3個(gè)月）時(shí)間內(nèi)、在-20°(：、2- 8 °C、25 °C條件下進(jìn)行1、2和4次冷凍/解凍(-20 °C /25 °C條件下)操作測(cè)量出的濁度值(330nm 處的吸光度），并與創(chuàng)新組(在25°C下放置0和3個(gè)月）進(jìn)行比較。
[0022]圖5A顯示了 HIAC儀器的亞可見粒子分析，使用標(biāo)準(zhǔn)杜克計(jì)數(shù)儀測(cè)定配方F1、F2、F3 和F4在所有條件下(-20°C、25°C、50°C、3次冷凍/解凍(-20°C/25°C條件下)及攪動(dòng)3天）。 [0023]圖5B顯示了 HIAC儀器的亞可見粒子分析，使用標(biāo)準(zhǔn)杜克計(jì)數(shù)儀測(cè)定配方F3在0、1 和3個(gè)月，以及-20°C、2-8°C和25°C、1、2次冷凍/解凍（lx、2xFzTh，在-20°C/25°C條件下）。 [0024]圖5C(1)顯示了 HIAC的亞可見粒子分析，使用標(biāo)準(zhǔn)杜克計(jì)數(shù)儀測(cè)定配方F1、F3、F5、 F6、F8在0、1和3個(gè)月(F3加做6個(gè)月），以及-20°C和2-8°C條件下。
[0025] 圖5C(2)顯示了 HIAC的亞可見粒子分析，對(duì)配方？1^3^5小6、？8在25°(：條件下，在 〇、1和3個(gè)月(F3加做6個(gè)月），以及在-20°C/25°C條件下冷凍/解凍(1X、2X、4X(1、2、4))。
[0026] 圖6A顯示了配方？1(厶）、？2(8)、？3(〇、？4(0)在所有條件下（0至14天內(nèi)，-20°(：、25 °(：、50°(：、3次冷凍/解凍（-20°(：/25°(：條件下）及攪動(dòng)3天）用考馬斯染色法處理后的305-PAGE凝膠。
[0027] 圖6B(1)顯示了配方F3在-20 °C、2-8°C和25 °C以及進(jìn)行2次冷凍/解凍(-20 °C/25 °C 條件下)條件下孵化3個(gè)月后用考馬斯染色法處理后的SDS-PAGE凝膠。
[0028] 圖6B(2)顯示了配方F3在-20°C、2-8°C和25°C以及進(jìn)行2次冷凍/解凍(-20°C/25°C 條件下)條件下孵化6個(gè)月后用考馬斯染色法處理后的SDS-PAGE凝膠。
[0029] 圖6C顯示了配方F5、F6和F7以及創(chuàng)新組(對(duì)照組)在0個(gè)月和在-20°C/25°C條件下1 次冷凍/解凍后用考馬斯染色法處理后的SDS-PAGE凝膠。
[0030] 圖6D顯示了配方F8、F9和F1以及創(chuàng)新組(對(duì)照組)在0個(gè)月和在-20°C/25°C條件下1 次冷凍/解凍循環(huán)后用考馬斯染色法處理后的SDS-PAGE凝膠。
[0031] 圖6E(1)顯示了配方F1、F5在1個(gè)月和在-20°c、2-8°c和25°C條件下以及在-20°c/ 25°C的條件下進(jìn)行2次冷凍/解凍循環(huán)后用考馬斯染色法處理后的SDS-PAGE凝膠。
[0032] 圖6E(2)顯示了配方F1、F5在3個(gè)月和在-20°C、2-8°C和25°C條件下以及在_20°C/ 25°C的條件下進(jìn)行4次冷凍/解凍循環(huán)后用考馬斯染色法處理后的SDS-PAGE凝膠。
[0033] 圖6F(1)顯示了配方F6、F8在1個(gè)月和在-20°C、2-8°C和25°C條件下以及在_20°C/ 25°C的條件下進(jìn)行2次冷凍/解凍循環(huán)后用考馬斯染色法處理后的SDS-PAGE凝膠。
[0034] 圖6F(2)顯示了配方F6、F8在3個(gè)月和在-20°C、2-8°C和25°C條件下以及在_20°C/ 25°C的條件下進(jìn)行4次冷凍/解凍循環(huán)后用考馬斯染色法處理后的SDS-PAGE凝膠。
[0035] 圖7A-7D顯示了所有配方在所有條件下(在_20°(：(74)、25°(：(78)、50°(：(7〇、3次冷 凍/解凍及攪動(dòng)3天(7D)條件下的所有時(shí)間點(diǎn)）分子排阻(凝膠過濾)HPLC色譜圖；測(cè)量的波 峰百分?jǐn)?shù)如表所示。
[0036] 圖7E(1)顯示在-20°C、2-8°C和25°C以及進(jìn)行2次冷凍/解凍（_20°C/25°C條件下 2xFzTh)條件下3個(gè)月時(shí)配方F3的分子排阻(凝膠過濾)HPLC色譜圖。
[0037] 圖7E(2)顯示在-20°C、2-8°C和25°C以及進(jìn)行4次冷凍/解凍（_20°C/25°C條件下 2xFzTh)條件下6個(gè)月時(shí)配方F3的分子排阻HPLC色譜圖。
[0038] 圖7F顯示了在25 °C條件下，配方F3在0、1、3、6個(gè)月和創(chuàng)新組(對(duì)照)在3個(gè)月時(shí)的分 子排阻HPLC(凝膠過濾)色譜圖。
[0039]圖7G(1)顯示了在25°C條件下，配方F3在0、3個(gè)月時(shí)的分子排阻(凝膠過濾)HPLC色 譜圖以及與創(chuàng)新組(對(duì)照)在0個(gè)月時(shí)的對(duì)比。
[0040]圖7G(2)顯示了在25°C條件下，創(chuàng)新組(對(duì)照)在0、3個(gè)月時(shí)的分子排阻(凝膠過濾） HPLC色譜圖。
[0041 ] 圖7H顯示了用分子排阻HPLC色譜長(zhǎng)時(shí)間研究配方F3在條件-20 °C、2-8°C和25 °C以 及進(jìn)行1次和2次冷凍/解凍（lx及2xFzTh，-20 °C/25 °C條件下)條件下孵化0、1、3個(gè)月時(shí)的表 格結(jié)果圖。
[0042] 圖71顯示在0個(gè)月時(shí)，配方FI、F5、F6、F7、F8、F9和創(chuàng)新組(對(duì)照）的分子排阻HPLC色 譜圖。
[0043] 圖7J顯示在-20°C/25°C條件下1次冷凍/解凍后，配方？1、？5、？6小7、？8小9和創(chuàng)新 組(對(duì)照組）的分子排阻HPLC色譜圖。
[0044]圖7K(1)顯示了在-20°C條件下，1個(gè)月時(shí)配方？1{5、？6、？8的分子排阻(凝膠過濾） HPLC色譜圖。
[0045] 圖7K(2)顯示在3個(gè)月和-20°C下，配方？113 4516 48的分子排阻（凝膠過濾） HPLC色譜圖。
[0046] 圖7L(1)顯示在1個(gè)月和2-8°C下，配方？1、？5小6、？8的分子排阻(凝膠過濾)1^(：色 譜圖。
[0047] 圖7L(2)顯示在3個(gè)月和2-8°C下，配方？113 4516 48的分子排阻（凝膠過濾） HPLC色譜圖。
[0048] 圖7M(1)顯示在1個(gè)月和25 °C下，配方F1、F5、F6、F8的分子排阻（凝膠過濾)HPLC色 譜圖。
[0049] 圖7M( 2)顯示在3個(gè)月和25 °C下，配方FI、F3、F5、F6、F8和創(chuàng)新組(對(duì)照）的分子排阻 HPLC色譜圖。
[0050] 圖7N(1)顯示在1個(gè)月和25°C下，配方F1、F5、F8的分子排阻（凝膠過濾)HPLC色譜 圖。
[0051 ] 圖7N(2)顯示在3個(gè)月和25 °C下，配方FI、F3、F5、F8和創(chuàng)新組（對(duì)照組）的分子排阻 (凝膠過濾)HPLC色譜圖。
[0052] 圖70顯示在1個(gè)月和25°C下，配方？1、？3、？5、？8的分子排阻（凝膠過濾）冊(cè)1(：色譜 圖。
[0053] 圖7P顯示在-20°C/25°C經(jīng)歷2次冷凍/解凍過程后，配方？1{5、？6小8的分子排阻 (凝膠過濾)HPLC色譜圖。
[0054] 圖7Q、7R、7S顯示了配方F1、F3、F5、F6、F8在以下條件的分子排阻HPLC色譜圖集：-20°C(圖7Q)、2-8°C(7R)和25°C(7S) ;時(shí)間上對(duì)配方F3是6個(gè)月，對(duì)配方F1、F5、F6和F8是3個(gè) 月。測(cè)量了波峰百分?jǐn)?shù)并加以標(biāo)示（％峰前值，％主峰值和％峰后值）。
[0055] 圖7T顯示了配方？1小3、？5小6、？8在0個(gè)月，-20°(：/25°(：的條件下經(jīng)歷1和2次冷凍/ 解凍循環(huán)（lx和2x FzTh)后的分子排阻(凝膠過濾)HPLC色譜圖集。測(cè)量了波峰的百分?jǐn)?shù)并 加以標(biāo)示（％峰前值，％主峰值和％峰后值）。柱狀圖按以下配方順序列出：每個(gè)條件（即0個(gè) 月，lxFzTh或2x FzTh)下的順序?yàn)椋?小3、？5小6和卩8。
[0056] 圖7U顯示了配方F3在-20°C、2-8°C和25°C條件下儲(chǔ)存0、1、3、6個(gè)月后的分子排阻 (凝膠過濾)HPLC色譜圖集。
[0057] 圖8A-8D顯示了所有配方在所有條件下（在-20°C(8A)、25°C(8B)、50°C(8C)』*， 凍/解凍及攪動(dòng)3天(8D)條件下的所有時(shí)間點(diǎn))基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定分析(相對(duì)效價(jià)％，相比 于參考標(biāo)準(zhǔn)的效力）。
[0058] 圖8E顯示了配方F3在在6個(gè)月（分別是0、1、3和6個(gè)月）時(shí)間內(nèi)、在-20°C、2-8°C、25 °C條件下進(jìn)行l(wèi)x、2x和4x冷凍/解凍(_20°C/25°C條件下）后基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定分析圖（相 對(duì)效價(jià)％，相比于參考標(biāo)準(zhǔn)的效力），在隨圖附表中也有顯示。
[0059] 圖8F顯示了配方？^3小5、？6和?8在25°(：下3個(gè)月后$3還經(jīng)過6個(gè)月后)基于細(xì)胞 的效價(jià)測(cè)定分析(相對(duì)效價(jià)％，相比于參考標(biāo)準(zhǔn)的效力），并與25°C下3個(gè)月后的創(chuàng)新組作對(duì) 比。此處25 °C條件下相應(yīng)結(jié)果，包括-20 °C、2-8 °C下以-20 °C /25 °C %經(jīng)歷4次凍融循環(huán)的相 對(duì)效價(jià)值，在隨圖附表中也有顯示。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 本發(fā)明涉及一種水溶液組合物，包括：
[0061] -種分離的多肽，是由人的P75腫瘤壞死因子受體的細(xì)胞外配體結(jié)合部分與人類 IgGl的Fc部分融合而成；
[0062] 一種鹽，其濃度為80-130mM;
[0063] -種賦形劑，選自海藻糖和蔗糖，或是它們的組合；
[0064] 該水溶液組合物的特征在于，其組份中既不含精氨酸也不含半胱氨酸。
[0065] 該水溶液組合物的進(jìn)一步特征在于，其組份中不含有游離氨基酸。例如，所述組合 物既不包含精氨酸，也不含半胱氨酸，也不含脯氨酸，也不含甘氨酸，也不含蛋氨酸，也不含 組氨酸，也不含絲氨酸，也不含纈氨酸，也不含賴氨酸，也不含谷氨酸。
[0066] 本文所提到的術(shù)語(yǔ)"組合物"可以指包含適用于以注射和/或其它給藥方式用于所 需人群的某種或某類多肽配方。"組合物"也可以被稱做"制藥組合物"。在某些實(shí)施方案中， 本文提供的組合物基本上是無菌的，不含有對(duì)接受者有毒性或感染性的成分。此外，本文所 提到的溶液或水溶液組合物可以指含有一種或多種溶解在適宜溶劑里(如，水和/或其他溶 劑，例如，有機(jī)溶劑)或互溶性的溶劑里的化學(xué)物質(zhì)。此外，本文提到的術(shù)語(yǔ)"大約"是指所標(biāo) 示的值的± 5 %范圍內(nèi)，最好就是標(biāo)示值本身（± 0 % )。
[0067] 注意，按照本發(fā)明的內(nèi)容，盡管組合物組份中不包含精氨酸或半胱氨酸(或任何其 他的氨基酸，例如脯氨酸，甘氨酸，甲硫氨酸，組氨酸，絲氨酸，纈氨酸，賴氨酸，谷氨酸)或它 們的組合，但是多肽本身在其鏈中可能含有精氨酸或半胱氨酸(或任何其它氨基酸如脯氨 酸，甘氨酸，甲硫氨酸，組氨酸，絲氨酸，纈氨酸，賴氨酸，谷氨酸)的氨基酸殘基。
[0068] 在某些實(shí)施方案中，含有多肽的Fc結(jié)構(gòu)域通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化。當(dāng)含有多肽的 Fc結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時(shí)，顆粒碎片可以通過離心或超濾的方式進(jìn)行移除。當(dāng)多肽被分泌 到培養(yǎng)基中，這種表達(dá)系統(tǒng)的上清液可以事先使用標(biāo)準(zhǔn)的多肽濃縮過濾器進(jìn)行濃縮。也可 通過加入蛋白酶抑制劑抑制蛋白水解以及加入抗生素抑制微生物的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案 中，包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的多肽可以使用以下方式進(jìn)行純化，例如，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透 析和親和層析，以及任何已知或尚待發(fā)明的純化技術(shù)的組合。例如，若含F(xiàn)C結(jié)構(gòu)域的多肽是 基于人體伽瑪1、伽瑪2或伽瑪4重鏈構(gòu)建，則可用蛋白A進(jìn)行純化(Lindmark等人，1983,《免 疫學(xué)方法雜志》62:1-13)。
[0069]根據(jù)具體需要，其它多肽純化技術(shù)如離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀法、反相HPLC 法、硅膠色譜法、肝素SEPHAR0SET?層析色譜法、陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂(例如，使用聚天 冬氨酸柱)法、層析聚焦SDS-PAGE法和硫酸銨沉淀法均可加以運(yùn)用。另外，其它未及的多肽 純化技術(shù)均可使用。
[0070] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，鹽的濃度為80至130mM，優(yōu)選為90至130mM，例如可以是 105至130mM，例如也可以是90mM、100mM或125mM。優(yōu)選地，鹽的濃度（優(yōu)選NaCl)濃度為90mM。 無論鹽濃度如何，鹽的種類優(yōu)選NaCl，雖然其他的鹽類也可以使用，例如氯化鉀、檸檬酸鈉、 硫酸鎂、氯化鈣、次氯酸鈉、硝酸鈉、硫化汞、鉻酸鈉和二氧化鎂。這個(gè)特定的鹽濃度的范圍 可保障本發(fā)明在高溫(甚至高達(dá)50°C)下仍可獲得穩(wěn)定組合物。此外，相比于現(xiàn)有技術(shù)所提 到的數(shù)值(例如140mM)，本發(fā)明所確定的這個(gè)濃度值范圍更接近人體生理滲透壓，因而可以 配制更多適用于諸如皮下給藥的組合物。
[0071] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的多肽是依那西普。依那西普的Fc組分包含恒 重2(CH 2)結(jié)構(gòu)域，恒重3(CH 3)結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)，但是并非人源性IgGl恒重1 (CH1)結(jié)構(gòu)域。 依那西普可以通過DNA重組技術(shù)在中國(guó)倉(cāng)鼠（黑線倉(cāng)鼠）卵巢(CH0)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系 統(tǒng)內(nèi)生產(chǎn)。它由934個(gè)氨基酸組成，表觀分子量為150千道爾頓（《醫(yī)師案頭參考》 (Physicians'Desk Reference)2002年，醫(yī)學(xué)經(jīng)濟(jì)公司（Medical Economics Company Inc))〇
[0072] 分離的多肽，其濃度優(yōu)選為10至100mg/mL，在20至60mg/mL之間更好，在大約25mg/ mL或約50mg/mL時(shí)最好。優(yōu)選濃度為約50mg/mL。
[0073]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，賦形劑是海藻糖，其濃度是10至80mg/mL，優(yōu)選為30至 65mg/mL，最好的濃度是60mg/mL，優(yōu)選的海藻糖最好為海藻糖二水合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，賦形劑為鹿糖，其濃度優(yōu)選為5至80mg/mL，優(yōu)選的鹿糖濃度為10至40mg/mL。在另 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蔗糖的最優(yōu)濃度為10mg/mL。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蔗糖的 最優(yōu)濃度為34mg/mL。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，賦形劑是蔗糖和海藻糖的組合物，濃度 范圍分別為5至80mg/mL和10至80mg/mL。賦形劑優(yōu)選鹿糖，濃度約為34mg/mL，進(jìn)一步優(yōu)選的 鹿糖濃度為(約）1 〇mg/mL。
[0074] 按照本
【發(fā)明內(nèi)容】
，組合物可以進(jìn)一步包含一個(gè)水溶性緩沖液。所述的水溶性緩沖 液優(yōu)選磷酸鈉、磷酸鉀、鈉或鉀的檸檬酸鹽、馬來酸、乙酸銨、3-羥甲基-氨基甲烷(TRIS )、乙 酸鹽、琥珀酸鹽、二乙醇胺、組氨酸或它們的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，水溶性緩沖液 是磷酸鈉。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，水溶性緩沖液是琥珀酸鹽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，選擇的水溶性緩沖液是組氨酸。
[0075] 無論在本發(fā)明所述組合物中所使用的緩沖液是單獨(dú)使用或是聯(lián)合使用，其濃度優(yōu) 選為15mM到100mM之間，例如從20至30mM。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的濃度為20mM和 100mM之間，優(yōu)選在25mM至50mM的范圍內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的濃度為（約） 22mM或25mM。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的濃度為(約)50mM。優(yōu)選的緩沖液是磷酸鈉 和琥珀酸鹽緩沖液(例如琥珀酸鈉），最優(yōu)的緩沖液是(約)22mM的琥珀酸。
[0076] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，不管是否存在水溶性緩沖液，本發(fā)明所公布的組合物，除了 已經(jīng)包含的賦形劑(海藻糖和/或蔗糖)外，還可以進(jìn)一步包含一種或多種賦形劑。在某些實(shí) 施方案中，組合物中所述的一種或多種賦形劑的濃度約為0.001至5% (重量百分比），而在 其它一些實(shí)施例中，組合物中所述的一種或多種賦形劑的濃度約為0.1至2% (重量百分 比）。賦形劑均為本領(lǐng)域熟知品種，可以由已知方法配制或購(gòu)自供應(yīng)商。優(yōu)選的所述賦形劑 包括乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人血清白蛋 白（SA)、重組血凝素(HA)、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯亞胺、 明膠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羥乙基纖維素(HEC)、聚乙二醇、乙二醇、二甲基亞砜(DMS0)、 二甲基甲酰胺(DMF )、L-脯氨酸、L-絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、肌氨酸、伽馬氨 基丁酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸鈉（SDS )、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚 物、磷酸鉀、乙酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、三甲胺N-氧化物、甜菜堿、鋅離子、銅離子、鈣 離子、錳離子、鎂離子、3_[(3_?；缺?-二甲基銨]-1-磺酸丙烷(CHAPS)、蔗糖、單月桂 酸酯或它們的組合。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，賦形劑是聚山梨酯20。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方 案中，聚山梨酯20的濃度為0.1%。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，賦形劑是甘氨酸，在甚至 更優(yōu)選的實(shí)施方案中，甘氨酸的濃度為0.5%。
[0077]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物的pH值在6.0至7.0之間，可以為6.1、6.2、 6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8和6.9任一 pH值。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物的pH值為約 6.3〇
[0078]在一個(gè)具體方案，本發(fā)明的組合物包含50mg/ml的依那西普，25mM的磷酸鈉緩沖 液，10mg/ml蔗糖，125mM的氯化鈉，其中組合物的pH值是6.3。
[0079]在另一個(gè)具體方案中，本發(fā)明的組合物包含50mg/ml的依那西普，25mM的磷酸鈉緩 沖液，1 Omg/ml鹿糖，1 OOmM的氯化鈉，其中組合物的pH值是6.3。
[0080]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含50mg/ml的依那西普，50mM磷酸鈉緩沖 液，60mg/ml的海藻糖二水合物，0.1 %聚山梨醇酯20，其中組合物的pH值為約pH 6.2。
[00811在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含50mg/ml的依那西普，25mM磷酸 鈉，34mg/ml鹿糖，90mM的氯化鈉，其中組合物的pH值是6.3。
[0082]在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含50mg/ml的依那西普，25mM磷酸 鈉，1 Omg/ml鹿糖，90mM的氯化鈉，0.5 %的甘氨酸，其中組合物的pH值是6.3。
[0083]在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含50mg/ml依那西普、50mM琥珀酸 鹽、10mg/ml的鹿糖、90mM氯化鈉;所述組合物的pH值為6.3。優(yōu)選地，該組合物（除了構(gòu)成依 那西普的氨基酸之外）不含額外氨基酸。優(yōu)選地，該組合物中既不含精氨酸和半胱氨酸，也 不含賴氨酸、脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蛋氨酸。
[0084]在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括或可替代性含有50mg/ml依那 西普、22mM琥泊酸鹽、10mg/ml的鹿糖、90mM氯化鈉;所述組合物的pH值為6.3。優(yōu)選地，該組 合物(除了構(gòu)成依那西普的氨基酸之外）不含額外氨基酸。優(yōu)選地，該組合物中既不含精氨 酸和半胱氨酸，也不含賴氨酸、脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蛋氨酸。
[0085] 本發(fā)明所公開的組合物可以腸胃外給藥，例如通過皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦 脊液內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)及/或鞘內(nèi)等方式給藥。
[0086] 構(gòu)成本發(fā)明所公開組合物中分離的多肽的已知療效包括可用于但不限于治療以 下疾病:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀肩病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、肉芽腫病、克羅恩病、慢性阻塞性肺 病、丙型肝炎、子宮內(nèi)膜異位癥、哮喘、惡病質(zhì)、牛皮癬或特應(yīng)性皮炎、或其它炎性或自身免 疫相關(guān)性疾病、功能障礙或病癥。足夠劑量(例如，治療有效量)的所述組合物可用于相應(yīng)病 癥的治療(減輕癥狀、停止或延緩進(jìn)展）。
[0087] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明，而不應(yīng)被理解為對(duì)于本發(fā)明范圍的限定。 [0088] 實(shí)施例
[0089] 組合物的制備
[0090]以下組成通過簡(jiǎn)單的混合得到：
[0091] 原材料：
[0092 ] 6 2 ? 5mg/mL的依那西普、1 ? 2mg/mL的Tr i S溶液、40mg/mL的甘露糖醇、1 Omg/mL的鹿 糖。溶液pH值為7.4，-20 °C下儲(chǔ)存。
[0093] 以市售同一批次ENBREU;商業(yè)制劑作為對(duì)照樣本(在此設(shè)定為"Enbrel組"或"創(chuàng) 新組"）。市售Enbrel制劑含有50mg/mL的依那西普、25mM磷酸鈉、25mM的精氨酸、100mM的氯 化鈉、1 Omg/mL的鹿糖、溶液pH值6.3。
[0094]在例如Enbre 1制劑這樣的相同制劑中，依那西普被用作內(nèi)部對(duì)照成分(50.9mg/mL 的依那西普、25mM磷酸鈉、25mM的精氨酸、100mM的NaCl、10mg/mL蔗糖、溶液pH值6.3)。這種 制劑被稱為F1。
[0095] 候選配方：
[0096] F2 :依那西普的水溶性制劑（49.4mg/mL依那西普、2 5mM磷酸鈉、10OmM氯化鈉、 1 Omg/mL鹿糖，pH值6 ? 3)。
[0097] F3 :依那西普的水溶性制劑（49.5mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、125mM氯化鈉、 1 Omg/mL鹿糖，pH值6 ? 3)。
[0098] F4:依那西普的水溶性制劑(50.9mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉、，60mg/mL海藻糖二 水合物、〇. 1 %聚山梨醇酯20，pH值6.2)。
[0099] F5:依那西普的水溶性制劑(50.0 mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、90mM氯化鈉、34mg/ mL鹿糖，pH 值6.3)。
[0100] F6:依那西普的水溶性制劑(50.0 mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、90mM氯化鈉、1 Omg/ mL鹿糖、0 ? 5 % (5mg/mL)甘氨酸，pH值6 ? 3)。
[0101] F7:依那西普的水溶性制劑(50.0 mg/mL依那西普、28mM組氨酸/鹽酸、90mM氯化鈉、 1 Omg/mL鹿糖、6mg/mL甘氨酸，pH值6 ? 3)。
[0102] F8:依那西普的水溶性制劑（50.0 mg/mL依那西普、22mM琥珀酸鹽、90mM氯化鈉、 1 Omg/mL蔗糖、pH值6.3)。所述的琥珀酸鹽緩沖液由22mM的琥珀酸制備并用氫氧化鈉(NaOH) 調(diào)節(jié)pH值至6.3。
[0103] 實(shí)施例1
[0104] 內(nèi)在蛋白熒光發(fā)射光譜和靜態(tài)光散射
[0105] 內(nèi)在蛋白的熒光發(fā)射光譜在266nm處激發(fā)獲得，靜態(tài)光散射數(shù)據(jù)在266nm和473nm 獲得。每個(gè)樣品裝入微量比色皿陣列(MCA)并放入Optim 1000來說明膠體和構(gòu)象穩(wěn)定性的 差異。在這項(xiàng)研究中熱斜坡實(shí)驗(yàn)溫度從15到95°C每次升高1°C，樣品在每個(gè)溫度下維持60秒 以達(dá)到熱平衡。在等溫的實(shí)驗(yàn)中，溫度固定在62°C，樣品在一個(gè)60秒內(nèi)被重復(fù)測(cè)量200次。
[0106] 樣品被266和473nm激光源照射的時(shí)長(zhǎng)稱為曝光時(shí)間。曝光時(shí)間的選擇取決于很多 因素，如熒光發(fā)射的強(qiáng)度和樣品褪色的靈敏度。此處所述所有樣品的曝光時(shí)間均設(shè)定為1 秒。
[0107] 隨著曝光時(shí)間的變化，物理縫隙的大小可以調(diào)節(jié)以控制進(jìn)入檢測(cè)器的光量。增大 這一開口的大小會(huì)增加測(cè)量的熒光信號(hào)，但儀器的光譜分辨率隨之降低。
[0108] Optim 1000儀器進(jìn)行的分析包括兩個(gè)層次，主要的和次要的。Optim 1000軟件提 供了自動(dòng)化的主次分析。正如任何一個(gè)自動(dòng)化的數(shù)據(jù)擬合軟件，必須采取合理措施以確保 輸入數(shù)據(jù)具有良好的質(zhì)量，使自動(dòng)功能得以輸出可靠的結(jié)果。并且，所有的結(jié)果已經(jīng)由一位 專業(yè)熟練的分析師手動(dòng)驗(yàn)證過。
[0109]原發(fā)性熒光發(fā)射和光散射數(shù)據(jù)的主要分析提取光譜參數(shù)如下：
[0110] ? Optim可以借助數(shù)學(xué)函數(shù)提供基礎(chǔ)信息如期望的波長(zhǎng)(也被稱為質(zhì)心平均數(shù)）， 該參數(shù)在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)越來越常用。它著眼于在平均發(fā)射波長(zhǎng)(或質(zhì)量中心），是一種很 好的消除光譜數(shù)據(jù)中各種噪聲的方法。 ?散射光的強(qiáng)度由260和270nm之間（瑞利散射紫外激發(fā)光）的綜合強(qiáng)度計(jì)算而來。 散射效率高度依賴波長(zhǎng):波長(zhǎng)越短，溶液中的分子散射光的效能就能越高。266nm處的激光 的散射可以敏銳地探測(cè)出平均分子量的細(xì)微變化。
[0112]在本項(xiàng)研究中，350和330nm之間的熒光強(qiáng)度比值已被用于研究抗體的熱展開， 266nm和473nm激光的散射光強(qiáng)度被用于測(cè)量熱誘導(dǎo)的樣品聚集。
[0113]次要分析借助初步分析得出的參數(shù)來確定樣本的熔融溫度"Tm"和聚集起始溫度 "Tagg"，如果此兩項(xiàng)指標(biāo)存在的話。熔融溫度的確定表現(xiàn)為根據(jù)主要分析數(shù)據(jù)繪制而成的 溫度函數(shù)上的拐點(diǎn)值。聚集溫度的起點(diǎn)的確定表現(xiàn)為在該溫度下的散射光強(qiáng)度隨數(shù)據(jù)中的 噪聲增大而超越某一閾值。從測(cè)量到的最低的溫度，每一個(gè)測(cè)量的散射強(qiáng)度值被添加到所 有先前測(cè)量值的數(shù)據(jù)集。分析進(jìn)程中的每一個(gè)點(diǎn)使用線性擬合并確定擬合優(yōu)度。如果數(shù)據(jù) 明顯從一條直線偏離(直線意義由數(shù)據(jù)中的噪聲確定），那么這就被定義為聚集起始溫度。 如果沒有明顯偏離，那么在數(shù)據(jù)集的下一個(gè)點(diǎn)上進(jìn)行核算，再次檢驗(yàn)該偏離。這種方法已經(jīng) 測(cè)試過各種各樣的蛋白質(zhì)和條件，并且被證明是有效的。在存在大型聚集體形成和沉淀的 極端情況下，如果懸浮液中的顆粒離開入射激光的焦距，光散射信號(hào)實(shí)際上會(huì)降低。然而， 不管后來出現(xiàn)何種沉淀，最初的起點(diǎn)仍然可以重現(xiàn)。
[0114]在所有的靜態(tài)光散射數(shù)據(jù)的情況下，無論樣品中有無沉淀析出，所有的點(diǎn)均被包 含。相同的樣品在不同的重復(fù)實(shí)驗(yàn)有時(shí)會(huì)沉淀，有時(shí)不會(huì)，但在每一種情況下聚合過程的開 始都可以重現(xiàn)。
[0115] 結(jié)論
[0116]所有樣品的Tagg和Tonset數(shù)據(jù)非常相似。
[0117] ?在F1 緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為63 ? 7 ±0 ? 3。(：，Tagg為66 ? 8±0 ? 3。(：。
[0118] ?在F2緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為63 ? 2 ±0 ? 1。(：，Tagg為65 ? 9 ±0 ? 1。(： ?
[0119] ?在F3緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為63 ? 4±0 ? 3°C，Tagg為65 ? 6±0 ? 4°C ?
[0120] ?在F4緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為63 ? 3±0 ? 1。(：，Tagg為64? 8±0 ? 1。(： ?
[0121] ?在F5緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為64? 5±0 ? 4°C，Tagg為63 ? 0±0 ? 6°C
[0122] ?在F6緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為63 ? 9 ±0 ? 5°C，Tagg為65 ? 4±0 ? 2°C ?
[0123] ?在F7緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為61 ? 0 ±0 ? 7°C，Tagg為63 ? 6 ±0 ? 1°C ?
[0124] ?在F8緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為64 ? 0 ±0 ? 0°C，Tagg為66 ? 2 ±0 ? 8°C ?
[0125] ?創(chuàng)新藥 Enbrel 本身的熒光 Tonset 為 63.4±0.rC，Tagg 為 65.6±0.rC.
[0126] 因此，該數(shù)據(jù)指示所有試樣間的膠體及構(gòu)形穩(wěn)定性高度類似。
[0127] 圖1顯示了配方？1、？5、？6、？7、？8和創(chuàng)新藥（對(duì)照）的結(jié)果，其趨勢(shì)為？5沖8汗6沖1> Enbrel>F7〇
[0128] 在熱升溫實(shí)驗(yàn)后，實(shí)施等溫實(shí)驗(yàn)。在分析及綜述熱升溫結(jié)果后，似乎所有試樣皆具 有約64°C之Tagg值，且因此選擇62°C之溫度用于等溫實(shí)驗(yàn)，即其僅低于Tagg，且其接近到足 夠使試樣在合理時(shí)段內(nèi)經(jīng)歷構(gòu)形及膠體改變。
[0129] 發(fā)現(xiàn)熒光的T起始值系介于63.2°C與63.7°C之間，且平均值63.4°C及相對(duì)低的0.3 °C的標(biāo)準(zhǔn)偏差，從而指示5個(gè)試樣(F1至F4及Enbrel液體配方)間具有高度可比性。
[0130] 所有試樣的穩(wěn)定性仍然皆可視為極其相當(dāng)。
[0131] 實(shí)施例二
[0132] 短壓力穩(wěn)定性研究
[0133] 在實(shí)施長(zhǎng)期研究之前進(jìn)行一項(xiàng)為期約兩個(gè)星期的短期穩(wěn)定性研究實(shí)驗(yàn)，來評(píng)估配 方。此外，F(xiàn)3配方將進(jìn)行6個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究，F(xiàn)5、F6、F8配方進(jìn)行3個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性研 究。
[0134] 九個(gè)配方進(jìn)行測(cè)試：
[0135]
[0136] 除了攪拌和凍融應(yīng)力外，每種配方均被暴露在兩種人為高溫(25 °C和50°C)和一種 實(shí)時(shí)溫度下，以評(píng)價(jià)其在實(shí)驗(yàn)開始后〇、3、7、14天時(shí)的穩(wěn)定性。
[0137] 配方F3的穩(wěn)定性除了在_20°C凍/25°C融的條件下進(jìn)行1、2、4次凍融循環(huán)以評(píng)估其 凍融應(yīng)力外，還在試驗(yàn)開始后〇、1、3、6個(gè)月的時(shí)候通過暴露于三個(gè)溫度（2-8°C、_20C和25 °C)下進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0138] 配方F5、F6、F8的穩(wěn)定性除了在-20 °C凍/25 °C融的條件下進(jìn)行1、2、4次凍融循環(huán)以 評(píng)估其凍融應(yīng)力外，還在實(shí)驗(yàn)開始后〇、1、3個(gè)月的時(shí)候通過暴露于三個(gè)溫度(2-8 °C、-20C和 25 °C)下進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0139] 每組用以下8項(xiàng)分析測(cè)定指標(biāo)來評(píng)估每個(gè)配方的穩(wěn)定性
[0140] ? pH(僅在0天時(shí)）
[0141] ?滲透壓(僅在0天時(shí)）
[0142] ?蛋白濃度(A28〇nm)
[0143] ?濁度（A330nm)
[0144] ? HIAC
[0145] ? SDS-PAGE (考馬斯亮藍(lán)染色）
[0146] ?分子排阻色譜(SE-HPLC)
[0147] ?基于細(xì)胞的效力
[0148] pH值和滲透壓
[0149] 圖2A and 2B顯示了初始時(shí)候溶液的pH值和滲透壓的柱狀圖。在每種條件下設(shè)置 樣品之前，所有配方的測(cè)定值都在目標(biāo)pH或者理論滲透壓的范圍內(nèi)。
[0150] 蛋白質(zhì)含量/A280
[0151] 圖3A顯示在所有時(shí)間（0至14天）及條件（_20°(：、25°(：、50°(：、3次冷凍/解凍（3\ FzTh)及3天攪動(dòng))下的蛋白質(zhì)濃度量測(cè)值(280nm下的吸光度）。針對(duì)所有試樣在所有時(shí)間點(diǎn) 及條件下獲得的數(shù)據(jù)皆在目標(biāo)值的范圍內(nèi)且在分析的差異性內(nèi)。
[0152] 圖3B顯示配方F3在0個(gè)月、1個(gè)月、3個(gè)月及6個(gè)月及條件(_20°C、2-8°C、25°C、1次、2 次及4次冷凍/解凍（1 X、2 X及4 X FzTh))下的蛋白質(zhì)濃度量測(cè)值(280nm下的吸光度）。對(duì)于 所有條件在至多3個(gè)月，觀察到蛋白質(zhì)濃度自目標(biāo)(50mg/mL)略微增加，但其仍在分析差異 性內(nèi)。用于構(gòu)筑該圖3B的數(shù)據(jù)提供于下表中：
[0154]下面的表總結(jié)了配方？1通、？6、？8和作為對(duì)照的創(chuàng)新藥(創(chuàng)新藥只測(cè)試了25°(：丁 = 〇個(gè)月，T = 3個(gè)月）在0個(gè)月和3個(gè)月時(shí)，在-20°C、2-8°C和25°C條件下，在_20°C/25°C凍融4次 的數(shù)據(jù)。所有配方的蛋白濃度達(dá)到或接近目標(biāo)(50mg/mL)
[0156] 除F1以外，配方F5、F6及F8在時(shí)間=3個(gè)月在所有條件下的蛋白質(zhì)濃度量測(cè)值 (280nm下的吸光度)皆在所有該等配方的目標(biāo)值處(未顯示圖）。
[0157] 濁度/A330
[0158] 圖4A顯示在所有時(shí)間（0至14天）及條件（-20°C、25 °C、50°C、3次冷凍/解凍（3 X FzTh)及3天攪動(dòng)）下的濁度量測(cè)值(330nm下之吸光度）。根據(jù)該等結(jié)果，在50°C條件下檢測(cè) 到濁度顯著增加，且F3隨時(shí)間呈現(xiàn)最低增加。在-20°C、25°C、冷凍-解凍或攪動(dòng)下在任一配 方中觀察到并未發(fā)生顯著改變。
[0159] 圖4B(1)顯示配方F3在時(shí)間t = 0個(gè)月、1個(gè)月及3個(gè)月及條件(-20°C、2-8°C、25°C、1 次冷凍/解凍（IX及2\?2!11(-20/25°(：))下的濁度量測(cè)值（33〇11111下的吸光度）。如在圖48 (1)中可看出，觀察到在25°C下經(jīng)受3個(gè)月儲(chǔ)存的試樣的濁度略微增加。在試樣于-20°C、2-8 °C下儲(chǔ)存3個(gè)月及經(jīng)受2個(gè)冷凍-解凍循環(huán)后，觀察到并未發(fā)生改變。用于構(gòu)筑該圖4B(1)的 數(shù)據(jù)提供于下表中：
[0161] 下表總結(jié)了配方？1小5、？6小7、？8、？9在0個(gè)月和3個(gè)月，以及在-20°(：/25°(：條件下 凍融1、2和4次后的數(shù)據(jù)，創(chuàng)新藥(作為對(duì)照)僅在0個(gè)月，溫度在25°C時(shí)的濁度數(shù)據(jù)。配方F1、 F5和F8在濁度方面沒有大的變化。儲(chǔ)存在25 °C時(shí)F6顯示了最高的濁度變化。
[0163] 如上所述，和0個(gè)月相比（圖4B(2))，在1或3個(gè)月后，配方F5、F8或F1在所有條件下， 濁度沒有觀察到明顯的進(jìn)一步增加。
[0164] HI AC (液體粒子計(jì)數(shù)器)
[0165] 方法:
[0166] 用HIAC 9703液體顆粒計(jì)數(shù)系統(tǒng)做這個(gè)實(shí)驗(yàn)。該計(jì)數(shù)器由取樣器、顆粒計(jì)數(shù)器和 R0Y⑶傳感器組成。該R0YC0傳感器能夠?qū)?wii到lOOwii之間的顆粒測(cè)出尺寸并計(jì)數(shù)。這個(gè)設(shè) 備可計(jì)數(shù)的顆粒< 10000個(gè)/毫升。
[0167] ?樣品體積(mL):0,2
[0168] ?流速 mL/min:10
[0169] 運(yùn)行次數(shù)(每個(gè)樣品）：4(第一次運(yùn)行結(jié)果丟棄）
[0170] 過程:
[0171] ?最初的樣品不經(jīng)過稀釋而直接分析，但由于樣品的高粘度，他們需要被稀釋后 進(jìn)行測(cè)定以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。
[0172] ?樣品放于室溫1小時(shí)。
[0173] ?樣品用適量的配方緩沖液按1:3比例稀釋，脫氣（1.5小時(shí)）并在測(cè)量前仔細(xì)混 合。
[0174] ?標(biāo)準(zhǔn)杜克科學(xué)計(jì)數(shù)儀：系統(tǒng)適用性檢查是用EZY-Cal 5圓和15圓尺寸的顆粒作 為對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)。在開始時(shí)，先對(duì)對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析以驗(yàn)證該傳感器的分辨率。
[0175] 圖5A顯示了 HIAC儀器的亞可見粒子分析，使用標(biāo)準(zhǔn)杜克計(jì)數(shù)儀測(cè)定配方F1、F2、F3 和F4在所有條件下(-20°(：、25°(：、50°(：、3次冷凍/解凍循環(huán)(-20°(：/25°(：條件下)及攪動(dòng)3天） 的。
[0176] 如在圖5A中可看出，針對(duì)F1、F2及F4在50°C條件下測(cè)得亞可視粒子計(jì)數(shù)顯著增加， 且F2早自7天顯示最高增加。
[0177] 針對(duì)任一配方在-20°(：、25°(：、3\?2111或在3(11^攪動(dòng)后觀察到并未發(fā)生顯著改 變。F3配方在所有條件及時(shí)間點(diǎn)下儲(chǔ)存后如與t = 0對(duì)照相比未呈現(xiàn)亞可視粒子有所改變。 [0178]圖5B顯示了 HIAC儀器的亞可見粒子分析，使用標(biāo)準(zhǔn)杜克計(jì)數(shù)儀測(cè)定配方F3在0、1 和3個(gè)月，以及在-20°C、2-8°C和25°C、1、2次冷凍/解凍循環(huán)（lx、2xFzTh，在-20°C/25°C條件 下)。
[0179]如在圖5B中可看出，觀察到對(duì)于25°C條件在3個(gè)月的亞可視粒子計(jì)數(shù)略微進(jìn)一步 增加。-20°C條件截止3個(gè)月時(shí)呈現(xiàn)最顯著的亞可視粒子增加。對(duì)于2-8°C時(shí)間點(diǎn)在3個(gè)月后 或在2個(gè)冷凍-解凍循環(huán)后觀察到自t = 0并未發(fā)生改變。在-20°C條件下觀察到亞可視粒子 計(jì)數(shù)自1個(gè)月略微進(jìn)一步增加。
[0180]用于構(gòu)筑該圖5B的數(shù)據(jù)提供于下表中：
[0182] 圖5C(1及2)結(jié)果顯示了 HIAC儀器的亞可見粒子分析，采用標(biāo)準(zhǔn)杜克科學(xué)計(jì)數(shù)儀分 析配方？1、？3、？5小6和？8在-20°(：、2-8°(：時(shí)放置0、1個(gè)月和3個(gè)月（圖50(1))，以及在25°(：時(shí) 進(jìn)行1、2、3和4次凍融(在-20°C/25°C時(shí)，1倍、2倍、3倍和4倍的FzTh)時(shí)（圖5C( 2))的亞可見 粒子。
[0183] 圖5C(1)數(shù)據(jù)如下表中
[0185] 圖5C( 2)顯示是HIAC儀器的亞可見粒子分析，針對(duì)配方FI、F5、F6及F8在t = 0、t = 1 個(gè)月及t = 3個(gè)月及1次、2次及4次冷凍/解凍（1 X、2 X及4 XFzTh)(在-20°C/25°C下）下使用 標(biāo)準(zhǔn)杜克計(jì)數(shù)儀量測(cè)。
[0186] 用于構(gòu)筑圖5C(2)之?dāng)?shù)據(jù)提供于下表中。
[0188] 可以在圖5C看出，配方FI、F3、F5F6和F8從t = 0到2-8°C放置3個(gè)月后，亞可見粒子 計(jì)數(shù)無明顯變化。另外，在25°C下的性能類似的F1及F6的亞可視粒子隨至多3個(gè)月的時(shí)間有 所增加。配方F8在25°C放置一段時(shí)間，亞可見粒子計(jì)數(shù)無明顯變化，表明該配方的穩(wěn)定性。 對(duì)照組樣本(創(chuàng)新藥)亞可見顆粒的數(shù)目在25°C時(shí)3個(gè)月后無顯著變化。與配方F1、F3、F5、F6 和F8相比，創(chuàng)新產(chǎn)品表現(xiàn)出了最高的粒子數(shù)，見下表）。
_〇] 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
[0191] 圖6A顯示在所有條件(-20 °C、25 °C、50 °C、3次冷凍/解凍及3天攪動(dòng)）下在時(shí)間0天 及14天培育的利用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。(A)中為F1試樣，（B)中為F2試樣，（C)中為 F3試樣且(D)中為F4試樣。
[0192] 在所有配方中針對(duì)50°C條件在所有時(shí)間點(diǎn)皆觀察到顯著改變，其中第14天試樣顯 示可能共價(jià)改質(zhì)的高分子量(HMW)物質(zhì)，如由所存在的其他HMW條帶（>約250kDa)及低分子 量(LMW)分解物質(zhì)（<50kDa)所證實(shí)，該等對(duì)于所有配方在50°C下早自3天即存在。
[0193] 在任一配方中針對(duì)所有其他條件及時(shí)間點(diǎn)且如與參考標(biāo)準(zhǔn)相比觀察到并未發(fā)生 改變。
[0194] 圖6B(1)顯示針對(duì)配方F3在t = 3個(gè)月在所有條件(-20 °C、2-8 °C、25 °C、2次冷凍/解 凍(在-20 °C /25 °C下））下培育利用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
[0195] 在25°C下在3個(gè)月后觀察到改變，且出現(xiàn)約lOOkDa及約140kDa處的額外條帶，且在 約50kDa及約30kDa處的LMW(低分子量)分解條帶的強(qiáng)度有所增加。
[0196] 在2個(gè)冷凍-解凍循環(huán)(_20°C/25°C)后觀察到改變，且約30kDa及約50kDa的條帶變 黑。
[0197] 圖6B(2)顯示針對(duì)配方F3在t = 6個(gè)月在所有條件(-20°C、2-8°C、25°C、4次冷凍/解 凍(在-20 °C /25 °C下））下培育利用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
[0198] 針對(duì)F3在25°C下在6個(gè)月后觀察到改變，且出現(xiàn)約lOOkDa處的額外條帶，且在約 50kDa及約30kDa處的LMW分解條帶的強(qiáng)度有所增加。
[0199] 圖6C顯示針對(duì)配方F5、F6及F7及創(chuàng)新藥（對(duì)照）在t = 0及在1次冷凍/解凍（在-20 °C /25 °C下)后，利用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
[0200] 配方F5、F6、F7及創(chuàng)新藥(對(duì)照)在t = 0與參考標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)。
[0201] 配方F5、F6、F7在1個(gè)冷凍-解凍循環(huán)(在-20 °C /25 °C下）后與參考標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)。
[0202] 圖6D顯示針對(duì)配方F8、F9及F1及創(chuàng)新藥（對(duì)照）在t = 0及在1次冷凍/解凍（在-20 °C/25°C下）的條件下利用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
[0203] 配方F8、F9、F1在t = 0及在1個(gè)冷凍-解凍循環(huán)(在-20°C/25°C下）后與參考標(biāo)準(zhǔn)相 當(dāng)。
[0204] 圖6E(1)顯示針對(duì)配方F1及F5在t = l個(gè)月在-20°C、2-8°C及25°C下及在2個(gè)冷凍/ 解凍循環(huán)(在_20°C/25°C下)后的條件下利用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
[0205]配方F1及F5在所有條件下在1個(gè)月時(shí)間點(diǎn)與參考標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)。
[0206] 在25 °C下在1個(gè)月后顯示配方F5的其他約1 OOkDa條帶的少量證據(jù)。
[0207] 圖6E(2)顯示針對(duì)配方F1及F5在t = 3個(gè)月在-20°C、2-8°C及25°C下及在4個(gè)冷凍/ 解凍循環(huán)(在_20°C/25°C下)后的條件下利用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。
[0208] F5在25 °C下在3個(gè)月后且如與F1在25°C下在3個(gè)月后相比，略微證實(shí)約lOOkDa、約 50kDa及約30kD處的極微弱條帶的出現(xiàn)，此亦顯示該等其他條帶。
[0209] 圖6F(1)顯示配方F6和F8在-20°C、2-8°C和25°C時(shí)放置1個(gè)月以及在_20°C/25°C2 次凍融循環(huán)條件下的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠電泳圖。
[0210] 配方F6、F8在-20°C和2-8°C放置一個(gè)月后以及在_20°C/25°C兩次凍融循環(huán)條件下 與參考標(biāo)準(zhǔn)具有可比性。
[0211] 在25°C1個(gè)月后配方F6顯示整個(gè)主帶以及幾個(gè)額外的低分子量的擊穿帶幾乎完全 喪失。
[0212] 圖6F(2)示配方F6和F8在-20°C、2-8°C和25°C時(shí)放置3個(gè)月以及在-20°C/25°C2次 凍融循環(huán)條件下的考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠電泳圖。
[0213] 配方F6在25°C放置3個(gè)月后發(fā)生了顯著的變化。150KD帶消失了，出現(xiàn)一些低分子 量的擊穿帶。在F6和F8中僅在~50kDa和~30kD顯示出微弱的電泳帶。
[0214] SE HPLC(尺寸排阻高效液相色譜法，又稱凝膠高效液相色譜法)
[0215] 條件:
[0216] ?色譜柱：superSW3000色譜柱4.6x300mm，4ym(Tosoh，18675)CV = 2.5 毫升
[0217] ?柱溫：25°C
[0218] ?流動(dòng)相:0.2M磷酸緩沖液，pH值6.8
[0219] ?流速:0.35mL/min
[0220] ?運(yùn)行時(shí)間：20分鐘
[0221] ?樣品量：37.6yg
[0222] ?自動(dòng)采樣器溫度:4°C
[0223] 圖7顯示在所有配方中針對(duì)所有條件(-20 °C (7A)、25 °C (7B)、50 °C (7C)、3次冷凍/ 解凍及3天攪動(dòng)(7D))在所有時(shí)間點(diǎn)的尺寸排阻HPLC的層析圖。已量測(cè)峰％且示于表中。 [0224]在所有配方中針對(duì)50°C條件在所有時(shí)間點(diǎn)皆觀察到顯著改變，其中F2的總體性能 最差，且前峰聚集早在3天即急劇增加（分別為26.3%及22.7%) A1及F3顯示在50°C下在3 天后的前峰聚集增加相對(duì)更緩和(分別為11.9%及9.3%)，但所有四種配方在14天后的前 峰聚集皆增加至>50 %。
[0225] 25°C條件亦使得所有配方在7天后的主峰面積％及前峰％略微改變，在14天進(jìn)一 步增加，其中在此條件下F4顯示最高的前峰聚集增加(0.5%)且F3顯示最低的總體聚集增 加。
[0226] 在任一配方中在暴露于攪動(dòng)及冷凍-解凍的條件或在-20°C下儲(chǔ)存至多14天時(shí)觀 察到并未發(fā)生顯著改變。
[0227] 圖7E(1)顯示配方F3針對(duì)t = 3個(gè)月在-20°C、2-8°C、25°C及2次冷凍/解凍（2X FxTh)(在-20°C/25°C下)條件下的尺寸排阻HPLC的層析圖。
[0228]對(duì)于此配方于25°C暴露3個(gè)月且如與所有其他條件相比，觀察到顯著前峰聚集及 后峰降解。
[0229] 圖7E(2)顯示配方F3針對(duì)t = 6個(gè)月在-20°(：、2-8°(：、25°(：及4次冷凍/解凍（4\ FxTh)(在-20°C/25°C下)條件下的尺寸排阻HPLC的層析圖。
[0230]對(duì)于此配方于25°C暴露6個(gè)月且如與所有其他條件在6個(gè)月后及在4個(gè)冷凍-解凍 循環(huán)后相比，觀察到顯著前峰聚集及后峰降解。
[0231]圖7F顯示配方F3針對(duì)t = 0個(gè)月、1個(gè)月、3個(gè)月及6個(gè)月在25°C下及配方創(chuàng)新藥在25 °C下在t = 3個(gè)月后的尺寸排阻HPLC之層析圖。
[0232] 如與1個(gè)月及3個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)相比，配方F3顯示前峰聚集及后峰聚集進(jìn)一步增加。
[0233] 創(chuàng)新藥在25°C下保持3個(gè)月顯示最高的總體前峰％且其系如與F3在所有其他測(cè)試 條件(包括25 °C在6個(gè)月）下相比。
[0234] 圖7G(1)顯示配方F3針對(duì)t = 0個(gè)月及3個(gè)月在25°C下及與創(chuàng)新藥(對(duì)照）在t = 0下 相比的尺寸排阻HPLC的層析圖。
[0235] 創(chuàng)新藥(對(duì)照）在t = 0較F3在25°C下在3個(gè)月后呈現(xiàn)的總體前峰聚集顯著更高，但 后峰降解產(chǎn)物更少。
[0236] 圖7G(2)顯示配方創(chuàng)新藥在t = 0及3個(gè)月在25°C下的尺寸排阻HPLC的層析圖。
[0237] 如與創(chuàng)新藥在t = 0相比，觀察到創(chuàng)新藥在3個(gè)月后在25°C下之前峰聚集及后峰降 解產(chǎn)物二者有所增加。
[0238] 圖7H提供在配方F3中針對(duì)t = 0在-20 °C、2-8 °C、25 °C及1次及2次冷凍/解凍（1 X及 2XFxTh)(在-20°C/25°C下）的條件下利用尺寸排阻HPLC較長(zhǎng)期研究的表格式結(jié)果。
[0239] 配方F3顯示前峰聚集顯著進(jìn)一步增加(0.9%，自t=l個(gè)月在25°C下）且后峰降解 產(chǎn)物略微進(jìn)一步增加（自1個(gè)月LMW-1峰進(jìn)一步增加0.1 % )。
[0240] 圖71顯示配方？1、？5小6、？7、？8、？9和創(chuàng)新藥(對(duì)照組)在0個(gè)月時(shí)尺寸排阻高效液 相色譜法的色譜圖。
[0241] 在0個(gè)月時(shí)，所有這些配方都顯示出具有可比的色譜圖。
[0242] 配方F9在t = 0較？1^6^6^7及?8呈現(xiàn)略微更高的前峰。
[0243] 在0個(gè)月時(shí)，相比于配方FI、F5、F6、F7、F8和F9，創(chuàng)新藥(對(duì)照組）顯示出較高的峰前 和峰后百分?jǐn)?shù)。
[0244] 圖7J顯示配方FI、F5、F6、F7、F8和F9在-20 °C/25 °C 1次凍融循環(huán)后的尺寸排阻HPLC 色譜圖。
[0245] 1次凍融循環(huán)后，配方？1、？5、？6、？7和?8是具有可比性的。其中？9顯示略微更高的 前峰％ (然而自t = 0未進(jìn)一步增加）。
[0246] 下表提供了配方FI、F5、F6、F7、F8、F9和新藥（對(duì)照組）在0個(gè)月以及在-20 °C/25 °C 條件下1次循環(huán)凍融后（lx FzTh)的用尺寸排阻色譜法進(jìn)行的長(zhǎng)期研究的結(jié)果。
[0248] 在0個(gè)月時(shí)，與配方F1、F5、F6、F7、F8和F9相比，對(duì)照組(創(chuàng)新藥）顯示出最高的峰前 百分比總量。
[0249] 圖7K(1)顯示配方？1^5^6^8在_20°(：條件下1個(gè)月時(shí)的尺寸排阻1^(：色譜圖。 [0250]在-20°C條件下存儲(chǔ)1個(gè)月，配方之間沒有顯著性差異。僅配方F5前峰值略低。
[0251] 圖7K(2)顯示？1、？3、？5、？6、？8在-20°(：條件下存儲(chǔ)3個(gè)月時(shí)的尺寸排阻冊(cè)1(：色譜 圖。
[0252] 配方F1、F5、F6和F8在-20°C條件下貯存3個(gè)月后沒有顯著差異。配方F3在-20°C條 件下3個(gè)月后相比其他配方具有更高的峰前和峰后值。
[0253] 圖7L(1)顯示配方？1^5^6^8在2_8°(：條件下存儲(chǔ)1個(gè)月時(shí)尺寸排阻1^(：色譜圖。 [0254]配方在2_8°C條件下貯存1個(gè)月后沒有顯著性差異。配方F5峰后值稍稍降低。
[0255] 圖7L( 2)顯示配方FI、F3、F5、F6、F8在2-8°C條件下貯存3個(gè)月時(shí)尺寸排阻HPLC色譜 圖。
[0256] 配方在2_8°C條件下貯存3個(gè)月后沒有顯著差異。配方F3在2_8°C條件下3個(gè)月后相 比其他配方具有更高的峰前和峰后值。
[0257] 圖7M(1)顯示配方？1、？1、？5小6、？8在25°(：條件下貯存1個(gè)月時(shí)尺寸排阻冊(cè)^：色譜 圖。
[0258] 配方F6在25°C條件下貯存1個(gè)月后發(fā)生戲劇性的變化，主峰完全缺失，導(dǎo)致峰值后 下降。其他配方(F1、F5、F8)在25°C條件下貯存1個(gè)月后中無顯著變化。
[0259] 圖7M(2)s顯示配方？1小3、？5小6、？8和創(chuàng)新藥在25°(：條件下貯存3個(gè)月時(shí)尺寸排阻 HPLC色譜圖。
[0260] 配方？1{3{5{6{8在25°(：條件下存儲(chǔ)3個(gè)月后，配方之間沒有顯著性差異，配方 F5峰后值略減少。25°C條件下存儲(chǔ)3個(gè)月后創(chuàng)新藥峰前和峰后值最高。配方F6發(fā)生了戲劇性 的變化，其主峰完全消失。
[0261] 圖7N(1)顯示配方F1、F5、F8在25°C條件下存儲(chǔ)1個(gè)月時(shí)尺寸排阻HPLC色譜圖。
[0262] 圖7N(2)顯示配方？1小3、？5小8和創(chuàng)新藥在25°(：條件下存儲(chǔ)3個(gè)月時(shí)尺寸排阻即^： 色譜圖。
[0263] 配方F1、F3F5和F8配方在25C條件下貯存3個(gè)月后沒有顯著性差異。創(chuàng)新藥相比其 他配方具有明顯的峰前聚集和峰后值降解。
[0264] 圖70顯示配方？1^3^5^8在25°(：條件下貯存1個(gè)月時(shí)尺寸排阻1^(：色譜圖。
[0265] 配方F3在25°C條件下貯存1個(gè)月后顯示出最高的峰前聚集百分比。
[0266] 圖7P顯示配方？115、？618在-20°(：/25°(：進(jìn)行2次凍融循環(huán)條件下的尺寸排阻 HPLC色譜圖。
[0267] 配方在-20°C/25°C2次凍融循環(huán)后沒有顯著差異。只有配方F5峰后值稍稍降低。
[0268] 下表提供了配方F1在-20°(：、2-8°(：、25°(：條件下，儲(chǔ)存0、1和3個(gè)月時(shí)，以及在-20 °C/25°C條件下進(jìn)行1、2、4次凍融循環(huán)后（lx、2x和4x FzTh)采用尺寸排阻高效液相色譜進(jìn) 行的長(zhǎng)期研究結(jié)果。
[0270] 下表提供了配方F5在-20°(：、2-8°(：、25°(：條件下，儲(chǔ)存0、1和3個(gè)月以及在-20°(：/25 °C條件下進(jìn)行1、2、4次凍融循環(huán)后（lx、2x and 4x FzTh)采用尺寸排阻高效液相色譜進(jìn)行 長(zhǎng)期研究的結(jié)果。
[0272] 下表提供了配方F6在-20°C、2-8°C、25°C條件下儲(chǔ)存0、1和3個(gè)月以及在-20°C/25 °C條件下進(jìn)行1、2、4次凍融循環(huán)后（lx、2x and 4x FzTh)采用尺寸排阻高效液相色譜進(jìn)行 長(zhǎng)期研究的結(jié)果。
[0274] 下表提供了配方F8在-20°C、2-8°C、25°C條件下儲(chǔ)存0、1和3個(gè)月以及在-20°C/25 °C條件下進(jìn)行1、2、4次凍融循環(huán)后（lx、2x and 4x FzTh)采用尺寸排阻高效液相色譜進(jìn)行 長(zhǎng)期研究的結(jié)果。
[0276] 圖7Q、7R和7S顯示配方？1小3、？5、？6和？8在以下條件下尺寸排阻色譜圖的色譜圖 形匯總：_20°C (圖7Q)、2-8°C(7R)和25°C(7S)，配方F3放樣到6個(gè)月，配方F1、F5、F6和F8放樣 到3個(gè)月。峰值百分比被測(cè)定（％峰前值，％主峰值和％峰后值）。
[0277] 圖7T顯示配方？1小3、？5、？6和?8在0個(gè)月時(shí)以及在_20°(：/25°(：條件下1次和2次凍 融循環(huán)（lx和2x FzTh)后尺寸排阻色譜圖的圖形匯總。峰值百分比被測(cè)定（％峰前值，％主 峰值和％峰后值）。條形圖是按下面配方的順序排列:每個(gè)條件下都是配方？1』3、？5、？6和 F8(SP〇個(gè)月時(shí)，lxFzTh或2x FzTh)。
[0278] 下表提供了25°C條件下儲(chǔ)存0個(gè)月，創(chuàng)新藥采用尺寸排阻高效液相色譜圖進(jìn)行的 長(zhǎng)期研究的結(jié)果。
[0280] 下表提供在配方F3中針對(duì)t = 0個(gè)月、1個(gè)月、3個(gè)月及6個(gè)月在-20°C、2-8°C及25°C 儲(chǔ)存條件下及在1次、2次及4次冷凍/解凍（1 X、2 X及4 X FxTh)(在-20°C/25°C下）后的條件 下，利用尺寸排阻HPLC的較長(zhǎng)期研究結(jié)果。
[0282] 結(jié)果顯示于圖7U中。F3顯示在6個(gè)月前峰聚集顯著進(jìn)一步增加(在25°C下自t = 3個(gè) 月增加1.1 % )且后峰降解產(chǎn)物略微進(jìn)一步增加（自3個(gè)月后峰進(jìn)一步增加2.1 % )。
[0283] 基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定
[0284] 方法:
[0285] -短時(shí)間點(diǎn)（0、3、7和14天）
[0286] ?兩批樣品進(jìn)行測(cè)試(在第0和3天后和在第7和14天后）。
[0287] ?除了對(duì)照樣品外，所有的樣品都由同一個(gè)分析師進(jìn)行一次生物測(cè)定。對(duì)照樣品 連續(xù)6天，每一天都要測(cè)試一次。
[0288] ?在280nm處測(cè)量吸光度來確定最初的稀釋制劑和隨后的樣品的精確濃度。
[0289] ?整體的檢測(cè)性能是可以接受的。由53個(gè)板測(cè)得的106個(gè)劑量-反應(yīng)曲線中，3條曲 線需要對(duì)一個(gè)孔進(jìn)行2種不同濃度的封板處理，以滿足孔間變異性分析標(biāo)準(zhǔn)。
[0290] ?孔與孔之間的差異CV% < 20%
[0291] ?檢測(cè)窗口（D/A)2 6
[0292] ? R2> 0.98
[0293] 測(cè)定了 47個(gè)測(cè)試樣品的相對(duì)效價(jià)，對(duì)照組測(cè)定了 6個(gè)不同的時(shí)間。對(duì)照組的平均相 對(duì)效價(jià)為100.2%，95%可信區(qū)間為96.9%~103.6%。
[0294] ?對(duì)照組六次獨(dú)立測(cè)定的方法變異性（％GCV)為3.2%。這種方法的低檢測(cè)變異性 表明，單一測(cè)定獲得的測(cè)試樣品的相對(duì)效價(jià)是可以接受的。
[0295] ?基于單一測(cè)定結(jié)果，大部分的測(cè)試樣品的相對(duì)效價(jià)接近100% (與參考標(biāo)準(zhǔn)具有 可比性）。
[0296] ?在50°C下貯存3天，試驗(yàn)樣品開始失去效價(jià)，在稍后的時(shí)間點(diǎn)效價(jià)逐步降低。
[0297] -長(zhǎng)期時(shí)間（3個(gè)月和6個(gè)月）
[0298] ?對(duì)一個(gè)批次樣品進(jìn)行了測(cè)試，包括配方F3放置6個(gè)月的時(shí)間以及其他所有樣品 和條件下放置3個(gè)月的時(shí)間。
[0299] ?所有的樣品都由同一個(gè)分析師進(jìn)行一次生物測(cè)定，所使用的參考標(biāo)準(zhǔn)為E16ADS Lot DC-4168-85.
[0300] ?在280nm處測(cè)定吸光度以確定最初的稀釋制劑和隨后的樣品的精確濃度。
[0301] ?整體的檢測(cè)性能是可以接受的。所有的劑量-反應(yīng)曲線（即6個(gè)板中的12個(gè)劑量- 反應(yīng)曲線)符合孔間變異性分析標(biāo)準(zhǔn)，無需對(duì)任何孔做封孔處理。TME 0498-01規(guī)定的檢測(cè) 驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0302] ?孔間變異性百分比CV% < 20%
[0303] ?檢測(cè)窗口（D/A)2 6
[0304] ? R2> 0.98
[0305] ?劑量_反應(yīng)曲線的檢測(cè)窗口范圍從4到4.5。劑量-反應(yīng)曲線的所有關(guān)鍵參數(shù)(A、 B、C和D)都處在正常范圍內(nèi)。此前也已證明，較小的檢測(cè)窗口（ >3)不會(huì)影響測(cè)定方法的準(zhǔn) 確性，因此，該試驗(yàn)的結(jié)果能被接受。
[0306] 在本例中，SoftMax Pro V5.2被用來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以驗(yàn)證檢測(cè)驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。如果必 要的話，可以對(duì)部分孔做封孔處理。
[0307]基于細(xì)胞的生物測(cè)定結(jié)果：
[0308] 圖8顯示包括在所有配方中針對(duì)所有條件(_20°C(8A)、25°C(8B)、50°C(8C)』*， 凍/解凍及3天攪動(dòng)(8D))在所有時(shí)間點(diǎn)基于細(xì)胞的效能分析(相對(duì)效能％，如與參考標(biāo)準(zhǔn)的 效能相比）的分析圖形。
[0309] 在所有配方中在50°C條件下檢測(cè)效能差異(如與參考標(biāo)準(zhǔn)的效能相比），且所有測(cè) 試試樣早在3天皆失去效能且是由在50°C下儲(chǔ)存14天顯著增加。
[0310] F3顯示在14天后在50°C下的效能最高，且剩余42.2%相對(duì)效能。
[0311]除冷凍_解凍及RT攪動(dòng)條件以外，在-20°C、25°C及50°C下所有配方的相對(duì)效能皆 接近100 %。
[0312] 圖8E顯示包括在配方F3中針對(duì)下列條件:-20 °C、2-8°C、25°C在時(shí)間點(diǎn)t = 0、t = 1 個(gè)月、t = 3個(gè)月及t = 6個(gè)月及在1X、2X及4X冷凍/解凍(在-20°C/25°C下）后的基于細(xì)胞 效能分析(相對(duì)效能％，如與參考標(biāo)準(zhǔn)的效能相比）的分析圖形。亦在圖旁提供數(shù)據(jù)表。 [0 313]配方F3在至多6個(gè)月及在4個(gè)冷凍-解凍循環(huán)(在-20°C/25°C下）后的所有條件下皆 顯示相對(duì)效能％，該等相對(duì)效能％與參考標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)且在分析差異性內(nèi)（< 20% )。針對(duì)F3在 25°C下在3個(gè)月后測(cè)得最低相對(duì)效能值％ (89.5%)。
[0314] 圖8F顯示包括與創(chuàng)新藥在3個(gè)月后在25°C下相比配方？1』3小5小6及?8在3個(gè)月后 (且對(duì)于F3，在6個(gè)月后)在-20 °C、2-8 °C、25 °C下及在-20 °C/25 °C下4 X冷凍/解凍后的基于 細(xì)胞效能分析(相對(duì)效能％，如與參考標(biāo)準(zhǔn)的效能相比）的分析圖形。亦在圖旁提供數(shù)據(jù)表。
[0315] 與創(chuàng)新藥在所有條件下相比，觀察到F1、F3、F5及F8間的相對(duì)效能％無顯著差異。 所有試樣的相對(duì)效能皆與參考標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)。F6在3個(gè)月后在25°C下無剩余效能。
[0316] 所有試樣的相對(duì)效能皆與參考標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)。
[0317] 全面總結(jié)
[0319] 配方F5 (25mM磷酸鈉、90mM氯化鈉、34毫克/毫升蔗糖，pH值6.3)和F8 (50毫摩爾琥 珀酸/氫氧化鈉、90毫摩爾氯化鈉、10mg/mL蔗糖，pH值6.3)從分析來看具有最高穩(wěn)定性和相 對(duì)效力，被確定為主導(dǎo)配方。并且如上表所示，配方F8相當(dāng)或優(yōu)于F1(創(chuàng)新藥的液體配方）， 也優(yōu)于配方F3和F6。
[0320] 項(xiàng)目
[0321] 1. 一種水溶液組合物，其包含：
[0322] -種分離的多肽，是由人的P75腫瘤壞死因子受體的胞外配體結(jié)合部分與人類 IgGl的Fc部分融合而成；
[0323] 一種濃度范圍在為90mM至130mM的鹽；
[0324] -種賦形劑，選自海藻糖和蔗糖或它們的組合；
[0325] 其特征在于其組份中既不含精氨酸也不含半胱氨酸。
[0326] 2.如項(xiàng)目1的組合物，所述的鹽的濃度為105mM至130mM。
[0327] 3.如項(xiàng)目1或2中任一項(xiàng)的組合物，所述的鹽的濃度為125mM。
[0328] 4.如項(xiàng)目1至3中任一項(xiàng)的組合物，所述的鹽為氯化鈉。
[0329] 5.如項(xiàng)目1至4中任一項(xiàng)的組合物，所述的分離的多肽為依那西普。
[0330] 6.如項(xiàng)目1至5中任一項(xiàng)的組合物，所述的賦形劑為濃度為20mg/mL至80mg/mL的海 藻糖。
[0331 ] 7.如項(xiàng)目1至6中任一項(xiàng)的組合物，所述的賦形劑為濃度5mg/mL至80mg/mL的鹿糖。
[0332] 8.如項(xiàng)目1至7中任一項(xiàng)的組合物，所述的組分中還包括水溶性緩沖液。
[0333] 9.如項(xiàng)目8之組合物，所述的水溶性緩沖液為磷酸鈉、磷酸鉀、鈉或鉀的檸檬酸鹽、 琥珀酸、馬來酸、乙酸銨、3-羥甲基-氨基甲烷(TRIS)、乙酸鹽、二乙醇胺、組氨酸或其組合。
[0334] 10.如項(xiàng)目8或9中任一項(xiàng)的組合物，所述的水溶性緩沖液的濃度為20mM至lOOmM。
[0335] 11.如項(xiàng)目1至10中任一項(xiàng)的組合物，其組分中還含有一種或多種賦形劑。
[0336] 12.如項(xiàng)目11的組合物，所述的賦形劑可為乳糖、丙三醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露 醇、麥芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血凝素、重組右旋糖酐、聚乙烯醇、 羥丙甲纖維素、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯吡咯烷酮羥乙基纖維素、聚乙二醇、乙二醇、二甲 亞砜、二甲基甲酰胺、脯氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、肌氨酸、Y-氨基丁 酸、聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-80、十二烷基硫酸鈉、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物、鉀磷 酸鹽、醋酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氧化三甲胺、甜菜堿、鋅離子、銅離子、鈣離子、錳離 子、鎂離子、3_[(3_丙基乙醇胺)-二甲胺]1-丙烷硫酸鹽、蔗糖單月桂酸酯或它們的混合物。
[0337] 13.如項(xiàng)目1至12中任一項(xiàng)的組合物，所述的組合物溶液的pH值在6.0至7.0之間。
[0338] 14.如項(xiàng)目1至13中任一項(xiàng)的組合物，其包含50mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉緩沖 液、1 Omg/mL鹿糖、125mM氯化鈉，該組合物的pH值為6.3。
[0339] 15.如項(xiàng)目1至13中任一項(xiàng)的組合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉緩沖 液、60mg/mL海藻糖二水合物、0.1 %聚山梨醇酯20，該組合物的pH值為6.2。
[0340] 16.如項(xiàng)目1至13中任一項(xiàng)的組合物，其包含50mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉緩沖 液、90mM氯化鈉、24mg/mL鹿糖，該組合物的pH值為6.3。
[0341] 17.如項(xiàng)目1至13中任一項(xiàng)的組合物，其包含50mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉緩沖 液、90mM氯化鈉、1 Omg/mL鹿糖、5mg/mL甘胺酸，該組合物的pH值為6.3。
[0342] 18 .如項(xiàng)目1至13中任一項(xiàng)的組合物，其包含5Omg/mL依那西普、22mM琥珀酸鹽、 90mM NaCl、10mg/mL鹿糖，該組合物的pH值為6.3。
[0343]發(fā)明的第二部分
[0344] 本發(fā)明第二部分系關(guān)于適于儲(chǔ)存含有TNFR:Fc的多肽且不含一些所選胺基酸及一 些所選鹽的穩(wěn)定水溶液組合物。
[0345] 本發(fā)明第二部分系基于以下發(fā)現(xiàn):根據(jù)下文所揭示技術(shù)特征的水溶液組合物可使 得蛋白質(zhì)在高溫(高于5°C)下穩(wěn)定性增加。
[0346] 因此，本發(fā)明的第二部分關(guān)于一種水溶液組合物，包括：
[0347] -種分離的多肽，是由人的P75腫瘤壞死因子受體的胞外配體結(jié)合部分與人類 IgGl的Fc部分融合而成；
[0348]單糖或二糖；
[0349] 水溶性緩沖液；
[0350] 其特征在于該組合物既不含有精胺酸亦不含有半胱胺酸、也不含選自氯化鈉、氯 化鉀、檸檬酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣、次氯酸鈉硝酸鈉、硫化汞、鉻酸鈉及二氧化鎂的鹽類。
[0351] 附圖簡(jiǎn)要說明
[0352] 圖9顯示在初始時(shí)間量測(cè)pH及滲透壓的柱狀圖。
[0353] 圖10顯示在所有時(shí)間（0至14天）及條件（-20°C、25 °C、50°C、3次冷凍/解凍（3 X FzTh)及3天攪動(dòng)）下的蛋白質(zhì)濃度量測(cè)值(280nm下的吸光度）。
[0354] 圖11顯示在所有時(shí)間（0至14天）及條件（-20°C、25 °C、50°C、3次冷凍/解凍（3 X FzTh)及3天攪動(dòng)）下的濁度量測(cè)值(330nm下的吸光度）。
[0355] 圖12顯示通過HIAC，在所有條件（_20°(：、25°(：、50°(：、3次冷凍/解凍（3\?2111)及3 天攪動(dòng))下使用標(biāo)準(zhǔn)杜克計(jì)數(shù)儀測(cè)量的亞可見粒子分析。
[0356] 圖13顯示在所有條件(-20 °C、25 °C、50 °C、3次冷凍/解凍及3天攪動(dòng)）下在時(shí)間0天 及14天培育利用考馬斯染色法處理后的SDS-PAGE凝膠。(A)中為F1試樣且(D)中為F4試樣。
[0357] 圖14顯示在所有配方中針對(duì)以下條件(_20°C (14A)、25°C (14B)、3次冷凍/解凍及3 天攪動(dòng)（14C))在所有時(shí)間點(diǎn)的尺寸排阻HPLC色譜圖；測(cè)量的波峰百分?jǐn)?shù)如表所示。
[0358] 圖15顯示了所有配方在所有條件下(_201€(154)、251€(158)、3次冷凍/解凍及3天 攪動(dòng)（15C))在所有時(shí)間點(diǎn)的基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定分析(相對(duì)效價(jià)％，相比于參考標(biāo)準(zhǔn)的效 力)。
【具體實(shí)施方式】
[0359]
[0360]本發(fā)明的第二部分關(guān)于一種水溶液組合物，包括：
[0361] -種分離的多肽，是由人的P75腫瘤壞死因子受體的胞外配體結(jié)合部分與人類 IgGl的Fc部分融合而成；
[0362]單糖或二糖；
[0363] 水溶性緩沖液，
[0364] 其特征在于該組合物既不含有精胺酸亦不含有半胱胺酸、也不含選自氯化鈉、氯 化鉀、檸檬酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣、次氯酸鈉硝酸鈉、硫化汞、鉻酸鈉及二氧化鎂的鹽類。
[0365] 本發(fā)明的第二部分所提到的術(shù)語(yǔ)"組合物"可以指包含適用于以注射和/或其它給 藥方式用于所需人群的某種或某類多肽配方。"組合物"也可以被稱做"制藥組合物"。在某 些實(shí)施方案中，本文提供的組合物基本上是無菌的，不含有對(duì)接受者有毒性或感染性的成 分。此外，本發(fā)明的第二部分所提到的溶液或水溶液組合物可以指含有一種或多種溶解在 適宜溶劑里（如，水和/或其他溶劑，例如，有機(jī)溶劑)或互溶性的溶劑里的化學(xué)物質(zhì)。此外， 本文提到的術(shù)語(yǔ)"大約"是指所標(biāo)示的值的± 5 %范圍內(nèi)，最好就是標(biāo)示值本身（± 0 % )。
[0366] 注意，按照本發(fā)明的內(nèi)容，盡管組合物組份中不包含單一的精氨酸或半胱氨酸或 它們的組合，但是多肽本身在其鏈中可能含有精氨酸或半胱氨酸的氨基酸殘基。
[0367] 在某些實(shí)施方案中，含有多肽的Fc結(jié)構(gòu)域通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化。當(dāng)含有多肽的 Fc結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時(shí)，顆粒碎片可以通過離心或超濾的方式進(jìn)行移除。當(dāng)多肽被分泌 到培養(yǎng)基中，這種表達(dá)系統(tǒng)的上清液可以事先使用標(biāo)準(zhǔn)的多肽濃集過濾器進(jìn)行濃縮。也可 通過加入蛋白酶抑制劑抑制蛋白水解以及加入抗生素抑制微生物的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案 中，包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的多態(tài)可以使用以下方式進(jìn)行純化，例如，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透 析和親和層析，以及任何已知或尚待發(fā)明的純化技術(shù)的組合。例如，若含F(xiàn)C結(jié)構(gòu)域的多肽是 基于人體伽瑪1、伽瑪2或伽瑪4重鏈構(gòu)建，則可用蛋白A進(jìn)行純化(Lindmark等人，1983,《免 疫學(xué)方法雜志》62:1-13)。
[0368]根據(jù)具體需要，其它多肽純化技術(shù)如離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀法、反相HPLC 法、硅膠色譜法、肝素SEPHAR0SET?層析色譜法、陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂(例如，使用聚天 冬氨酸柱)法、層析聚焦SDS-PAGE法和硫酸銨沉淀法均可加以運(yùn)用。另外，其它未及的多肽 純化技術(shù)均可使用。
[0369]在本發(fā)明第二部分的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的多肽是依那西普。依那西普的 Fc組分包含恒重2(CH 2)結(jié)構(gòu)域，恒重3(CH 3)結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)，但是并非人源性IgGl恒重1 (CH1)結(jié)構(gòu)域。依那西普可以通過DNA重組技術(shù)在中國(guó)倉(cāng)鼠（黑線倉(cāng)鼠）卵巢(CH0)的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)生產(chǎn)。它由934個(gè)氨基酸組成，表觀分子量為150千道爾頓(《醫(yī)師案頭參 考》2002年，醫(yī)學(xué)經(jīng)濟(jì)公司）。
[0370] 分離的多肽，其濃度優(yōu)選為10至100mg/mL，在20至60mg/mL之間更好，在大約25mg/ mL或約50mg/mL時(shí)最好。
[0371] 在本發(fā)明第二部分的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，單糖或二糖是選自海藻糖及蔗糖。優(yōu) 選的，海藻糖濃度為20mg/mL至80mg/mL、更優(yōu)選為40mg/mL至60mg/mL甚至更優(yōu)選為60mg/ mL，且優(yōu)選以海藻糖二水合物的形式存在。優(yōu)選的，鹿糖濃度為10mg/mL至80mg/mL、更優(yōu)選 為40mg/mL至60mg/mL甚至更優(yōu)選為60mg/mL。在本發(fā)明第二部分的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中， 賦形劑是蔗糖與海藻糖的組合。
[0372] 在本發(fā)明第二部分的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物的水溶性緩沖液優(yōu)選磷 酸鈉、磷酸鉀、鈉或鉀的檸檬酸鹽、馬來酸、乙酸銨、3-羥甲基-氨基甲烷(TRIS )、乙酸鹽、二 乙醇胺或它們的組合。無論緩沖液是單獨(dú)或組合用于組合物中，該緩沖液的濃度優(yōu)選介于 20mM與150mM之間，更優(yōu)選該濃度為約50mM且優(yōu)選水溶性緩沖液是磷酸鈉。
[0373] 在本發(fā)明第二部分另一實(shí)施例中，本發(fā)明組合物可進(jìn)一步包含一或多種賦形劑。 在本發(fā)明第二部分的某些實(shí)施例中，組合物中所述的一種或多種賦形劑的濃度約為0.001 至5% (重量百分比），而在本發(fā)明的第二部分的其他實(shí)施例中，組合物中所述的一種或多種 賦形劑的濃度約為0.1至2% (重量百分比）。賦形劑均為本領(lǐng)域熟知品種，可以由已知方法 配制或購(gòu)自供應(yīng)商。優(yōu)選的所述賦形劑包括乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、肌 醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人類血清白蛋白（SA)、重組血球凝集素(HA)、右旋糖酐、聚乙烯 醇(PVA)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羥乙基纖維 素(HEC)、聚乙二醇、乙二醇、二甲基亞砜(DMS0)、二甲基甲酰胺(DMF)、脯氨酸、L-絲氨酸、谷 氨酸、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、肌氨酸、伽馬氨基丁酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、十二 烷基硫酸鈉(SDS )、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物、磷酸鉀、乙酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、 三甲胺N-氧化物、甜菜堿、鋅離子、銅離子、鈣離子、錳離子、鎂離子、3-[(3_?；缺?-二 甲基銨]-1-磺酸丙烷(CHAPS)、蔗糖、單月桂酸酯或其組合。在更優(yōu)選實(shí)施例中，賦形劑為聚 山梨醇酯20,在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚山梨酯20的濃度為0.1%。
[0374] 在本發(fā)明第二部分另一優(yōu)選實(shí)施例中，組合物的pH值在6.0至7.0之間，可以為 6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8和6.9任一口田直。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物的口11 值為約6.2。
[0375] 在本發(fā)明第二部分具體實(shí)施例中，組合物包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉緩沖 液、60mg/mL海藻糖二水合物，其中該組合物pH值為6.2。
[0376] 在本發(fā)明第二部分具體實(shí)施例中，組合物包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉緩沖 液、60mg/mL海藻糖二水合物、0.1 %的聚山梨醇酯20，其中該組合物pH值為6.2。
[0377] 在本發(fā)明之此第二部分具體實(shí)施例中，組合物包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉 緩沖液、60mg/mL蔗糖，其中該組合物pH值為6.2。
[0378] 在本發(fā)明之此第二部分具體實(shí)施例中，組合物包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉 緩沖液、60mg/mL蔗糖、0.1 %聚山梨醇酯20，其中該組合物pH值為6.2。
[0379] 本發(fā)明的第二部分所公開的組合物可以腸胃外給藥，例如通過皮下、肌內(nèi)、靜脈 內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊液內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)及/或鞘內(nèi)等方式給藥。
[0380] 構(gòu)成本發(fā)明第二部分所公開組合物中分離的多肽的已知療效包括可用于但不限 于治療以下疾病:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀肩病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、肉芽腫病、克羅恩病、慢性 阻塞性肺病、丙型肝炎、子宮內(nèi)膜異位癥、哮喘、惡病質(zhì)、牛皮癬或特應(yīng)性皮炎、或其它炎性 或自身免疫相關(guān)性疾病、功能障礙或病癥。足夠劑量(例如，治療有效量)的所述組合物可用 于相應(yīng)病癥的治療(減輕癥狀、停止或延緩進(jìn)展）。
[0381] 以下實(shí)例用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明的第二部分，而不應(yīng)被理解為對(duì)于本發(fā)明范圍的 限定。
[0382] 本發(fā)明第二部分實(shí)例
[0383] 組合物的制備
[0384] 以下組成通過簡(jiǎn)單的混合得到：
[0385] 原材料：
[0386] 62.5mg/mL的依那西普、1 ? 2mg/mL的Tris溶液、40mg/mL的甘露糖醇、10mg/mL的鹿 糖。溶液pH值為7.4，-20 °C下儲(chǔ)存。
[0387] 參考配方(本文稱為「Enbrel」）：
[0388] 以市售同一批次ENBREL?配方作為對(duì)照樣本。市售Enbrel配方含有50mg/mL的依 那西普、25mM磷酸鈉、25mM的精氨酸、1 OOmM的氯化鈉、1 Omg/mL的鹿糖、溶液pH值6.3。
[0389] 候選配方：
[0390] F1 :在例如Enbre 1配方這樣的相同配方中，依那西普被用作內(nèi)部對(duì)照成分 (50.9mg/mL的依那西普、25mM磷酸鈉、25mM的精氨酸、1 OOmM的NaCl、1 Omg/mL鹿糖、溶液pH值 6.3)〇
[0391] F2 :依那西普的水溶性制劑（49.4mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、10OmM氯化鈉、 1 Omg/mL鹿糖，pH值6 ? 3)。
[0392] F3 :依那西普的水溶性制劑（49.5mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉、125mM氯化鈉、 1 Omg/mL鹿糖，pH值6 ? 3)。
[0393] F4:依那西普的水溶性制劑(50.9mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉、，60mg/mL海藻糖二 水合物、〇. 1 %聚山梨醇酯20，pH值6.2)。
[0394] 在一些實(shí)驗(yàn)中，亦使用大量商業(yè)Enbref作為參考(參見上文）。
[0395] 實(shí)施例一
[0396] 內(nèi)在蛋白熒光發(fā)射光譜和靜態(tài)光散射
[0397] 內(nèi)在蛋白的熒光發(fā)射光譜在266nm處激發(fā)獲得，靜態(tài)光散射數(shù)據(jù)在266nm和473nm 獲得。每個(gè)樣品裝入微量比色皿陣列(MCA)并放入Optim 1000來說明膠體和構(gòu)象穩(wěn)定性的 差異。在這項(xiàng)研究中熱斜坡實(shí)驗(yàn)溫度從15到95°C每次升高1°C，樣品在每個(gè)溫度下維持60秒 以達(dá)到熱平衡。在等溫的實(shí)驗(yàn)中，溫度固定在62°C，樣品在一個(gè)60秒內(nèi)被重復(fù)測(cè)量200次。
[0398] 樣品被266和473nm激光源照射的時(shí)長(zhǎng)稱為曝光時(shí)間。曝光時(shí)間的選擇取決于很多 因素，如熒光發(fā)射的強(qiáng)度和樣品褪色的靈敏度。此處所述所有樣品的曝光時(shí)間均設(shè)定為1 秒。
[0399] 隨著曝光時(shí)間的變化，物理縫隙的大小可以調(diào)節(jié)以控制進(jìn)入檢測(cè)器的光量。增大 這一開口的大小會(huì)增加測(cè)量的熒光信號(hào)，但儀器的光譜分辨率隨之降低。
[0400] Optim 1000儀器進(jìn)行的分析包括兩個(gè)層次，主要的和次要的。Optim 1000軟件提 供了自動(dòng)化的主次分析。正如任何一個(gè)自動(dòng)化的數(shù)據(jù)擬合軟件，必須采取合理措施以確保 輸入數(shù)據(jù)具有良好的質(zhì)量，使自動(dòng)功能得以輸出可靠的結(jié)果。并且，所有的結(jié)果已經(jīng)由一位 專業(yè)熟練的分析師手動(dòng)驗(yàn)證過。
[0401]原發(fā)性熒光發(fā)射和光散射數(shù)據(jù)的主要分析提取光譜參數(shù)如下：
[0402] ? Optim可以借助數(shù)學(xué)函數(shù)提供基礎(chǔ)信息如期望的波長(zhǎng)(也被稱為質(zhì)心平均數(shù)）， 該參數(shù)在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)越來越常用。它著眼于在平均發(fā)射波長(zhǎng)(或質(zhì)量中心），是一種很 好的消除光譜數(shù)據(jù)中各種噪聲的方法。
[0403] ?散射光的強(qiáng)度由260和270nm之間（瑞利散射紫外激發(fā)光）的綜合強(qiáng)度計(jì)算而來。 散射效率高度依賴波長(zhǎng):波長(zhǎng)越短，溶液中的分子散射光的效能就能越高。266nm處的激光 的散射可以敏銳地探測(cè)出平均分子量的細(xì)微變化。
[0404] 在本項(xiàng)研究中，350和330nm之間的熒光強(qiáng)度比值已被用于研究抗體的熱展開， 266nm和473nm激光的散射光強(qiáng)度被用于測(cè)量熱誘導(dǎo)的樣品聚集。
[0405] 次要分析借助初步分析得出的參數(shù)來確定樣本的熔融溫度"Tm"和聚集起始溫度 "Tagg"，如果此兩項(xiàng)指標(biāo)存在的話。熔融溫度的確定表現(xiàn)為根據(jù)主要分析數(shù)據(jù)繪制而成的 溫度函數(shù)上的拐點(diǎn)值。聚集溫度的起點(diǎn)的確定表現(xiàn)為在該溫度下的散射光強(qiáng)度隨數(shù)據(jù)中的 噪聲增大而超越某一閾值。從測(cè)量到的最低的溫度，每一個(gè)測(cè)量的散射強(qiáng)度值被添加到所 有先前測(cè)量值的數(shù)據(jù)集。分析進(jìn)程中的每一個(gè)點(diǎn)使用線性擬合并確定擬合優(yōu)度。如果數(shù)據(jù) 明顯從一條直線偏離(直線意義由數(shù)據(jù)中的噪聲確定），那么這就被定義為聚集起始溫度。 如果沒有明顯偏離，那么在數(shù)據(jù)集的下一個(gè)點(diǎn)上進(jìn)行核算，再次檢驗(yàn)該偏離。這種方法已經(jīng) 測(cè)試過各種各樣的蛋白質(zhì)和條件，并且被證明是有效的。在存在大型聚集體形成和沉淀的 極端情況下，如果懸浮液中的顆粒離開入射激光的焦距，光散射信號(hào)實(shí)際上會(huì)降低。然而， 不管后來出現(xiàn)何種沉淀，最初的起點(diǎn)仍然可以重現(xiàn)。
[0406] 在所有的靜態(tài)光散射數(shù)據(jù)的情況下，無論樣品中有無沉淀析出，所有的點(diǎn)均被包 含。相同的樣品在不同的重復(fù)實(shí)驗(yàn)有時(shí)會(huì)沉淀，有時(shí)不會(huì)，但在每一種情況下聚合過程的開 始都可以重現(xiàn)。
[0407] 結(jié)論
[0408]所有樣品的Tagg和Tonset數(shù)據(jù)非常相似。
[0409] ?在F1 緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為63 ? 7 ±0 ? 3°C，Tagg為66 ? 8±0 ? 3°C。
[0410] ?在F2緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為63 ? 2 ±0 ? 1。(：，Tagg為65 ? 9 ±0 ? 1。(： ?
[0411] ?在F3緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為63 ? 4±0 ? 3°C，Tagg為65 ? 6±0 ? 4°C ?
[0412] ?在F4緩沖產(chǎn)品中，熒光Tonset為63 ? 3±0 ? 1。(：，Tagg為64? 8±0 ? 1。(： ?
[0413] ?創(chuàng)新藥 Enbrel 本身的熒光 Tonset 為 63.4±0.rC，Tagg 為 65.6±0.rC.
[0414]因此，該數(shù)據(jù)指示所有試樣間的膠體及構(gòu)形穩(wěn)定性高度類似。
[0415] 發(fā)現(xiàn)熒光的T起始值系介于63.2°C與63.7°C之間，且平均值63.4°C及相對(duì)低的0.3 °C的標(biāo)準(zhǔn)偏差，從而指示5個(gè)試樣(F1至F4及Enbrel液體配方)間具有高度可比性。
[0416] 如所有實(shí)驗(yàn)中所示，F(xiàn)4配方在構(gòu)形及膠體穩(wěn)定性構(gòu)形方面與Enbrel液體配方極為 類似。
[0417] 實(shí)施例二
[0418] 短壓力穩(wěn)定性研究方法
[0419] 在實(shí)施長(zhǎng)期研究之前進(jìn)行一項(xiàng)為期約兩個(gè)星期的短期穩(wěn)定性研究實(shí)驗(yàn)，來評(píng)估配 方。
[0420] 測(cè)試下列4種配方：
[0422] 除了攪拌和凍融應(yīng)力外，每種配方均被暴露在兩種人為高溫(25°C和50°C)和一種 實(shí)時(shí)溫度下，以評(píng)價(jià)其在實(shí)驗(yàn)開始后〇、3、7、14天時(shí)的穩(wěn)定性。
[0423] 每組用以下8項(xiàng)分析測(cè)定指標(biāo)來評(píng)估每個(gè)配方的穩(wěn)定性
[0424] ? pH(僅在0天時(shí)）
[0425] ?滲透壓(僅在0天時(shí)）
[0426] ?蛋白濃度(A280nm)
[0427] ?濁度（A330nm)
[0428] ? HIAC
[0429] ? SDS-PAGE (考馬斯亮藍(lán)染色）
[0430] ?分子排阻色譜（SE-HPLC)
[0431] ?基于細(xì)胞的效力
[0432] pH值及滲透壓
[0433] 圖9顯示了初始時(shí)候溶液的pH值和滲透壓的柱狀圖。在每種條件下設(shè)置樣品之前， 所有配方的測(cè)定值都在目標(biāo)pH或者理論滲透壓的范圍內(nèi)。
[0434] 蛋白質(zhì)濃度/A280
[0435] 圖10顯示在所有時(shí)間（0至14天）及條件（-20°C、25 °C、50°C、3次冷凍/解凍（3 X FzTh)及3天攪動(dòng))下的蛋白質(zhì)濃度量測(cè)值(280nm下的吸光度）。針對(duì)所有試樣在所有時(shí)間點(diǎn) 及條件下獲得的數(shù)據(jù)皆在目標(biāo)值的范圍內(nèi)且在分析的差異性內(nèi)。
[0436] 濁度/A330
[0437] 圖11顯示在所有時(shí)間（0至14天）及條件（-20°C、25 °C、50°C、3次冷凍/解凍（3 X FzTh)及3天攪動(dòng)）下的濁度量測(cè)值(330nm下之吸光度）。根據(jù)該等結(jié)果，在50°C條件下檢測(cè) 到濁度顯著增加，且F3隨時(shí)間呈現(xiàn)最低增加。在-20°C、25°C、冷凍-解凍或攪動(dòng)下在任一配 方中觀察到并未發(fā)生顯著改變。
[0438] HI AC (液體粒子計(jì)數(shù)器)
[0439] 方法:
[0440]用HIAC 9703液體顆粒計(jì)數(shù)系統(tǒng)做這個(gè)實(shí)驗(yàn)。該計(jì)數(shù)器由取樣器、顆粒計(jì)數(shù)器和 R0Y⑶傳感器組成。該R0YC0傳感器能夠?qū)?wii到lOOwii之間的顆粒測(cè)出尺寸并計(jì)數(shù)。這個(gè)設(shè) 備可計(jì)數(shù)的顆粒< 10000個(gè)/毫升。
[0441 ]過程:
[0442] ?最初的樣品不經(jīng)過稀釋而直接分析，但由于樣品的高粘度，他們需要被稀釋后 進(jìn)行測(cè)定以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。
[0443] ?樣品放于室溫1小時(shí)。
[0444] ?樣品用恰量的配方緩沖液按1:3比例稀釋，脫氣（1.5小時(shí)）并在測(cè)量前仔細(xì)混 合。
[0445] ?標(biāo)準(zhǔn)杜克科學(xué)計(jì)數(shù)儀:系統(tǒng)適用性檢查是用EZY-Cal 5wii和15wii尺寸的顆粒作 為對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)。在開始時(shí)，先對(duì)對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析以驗(yàn)證該傳感器的分辨率。
[0446] 圖12顯示了通過HIAC，使用標(biāo)準(zhǔn)杜克計(jì)數(shù)儀測(cè)定配方F1、F2、F3和F4在所有條件下 (-20°C、25 °C、50 °C、3次冷凍/解凍循環(huán)（-20 °C/25°C條件下）及攪動(dòng)3天）的亞可見粒子分 析。
[0447] 針對(duì)F1、F2及F4在50°C條件下測(cè)得亞可視粒子計(jì)數(shù)顯著增加，且F2早自7天顯示最 高增加。
[0448] 針對(duì)任一配方在-20°(：、25°(：、3\?2111或在3(11^攪動(dòng)后觀察到并未發(fā)生顯著改 變。
[0449] F4在所有條件及時(shí)間點(diǎn)下儲(chǔ)存后如與t = 0對(duì)照相比未呈現(xiàn)亞可視粒子有所改變。 [0450] 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
[0451 ]圖13顯示在所有條件(-20 °C、25 °C、50 °C、3次冷凍/解凍及3天攪動(dòng)）下在時(shí)間0天 及14天培育的利用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。(A)中為F1試樣且(D)中為F4試樣。
[0452]在所有配方中針對(duì)50°C條件在所有時(shí)間點(diǎn)皆觀察到顯著改變，其中第14天試樣顯 示可能共價(jià)改質(zhì)的高分子量(HMW)物質(zhì)，如由所存在的其他HMW條帶（>約250kDa)及低分子 量(LMW)分解物質(zhì)（<50kDa)所證實(shí)，該等對(duì)于所有配方在50°C下早自3天即存在。
[0453] 在任一配方中針對(duì)所有其他條件及時(shí)間點(diǎn)且如與參考標(biāo)準(zhǔn)相比觀察到并未發(fā)生 改變。
[0454] SE HPLC(尺寸排阻高效液相色譜法)
[0455] 條件:
[0456] ?色譜柱：superSW3000色譜柱4.6x300mm，4iim(Tosoh，18675)CV = 2.5 毫升
[0457] ?柱溫：25°C
[0458] ?流動(dòng)相:0.2M磷酸緩沖液，pH值6.8
[0459] ?流速:0.35mL/min
[0460] ?運(yùn)行時(shí)間：20分鐘
[0461] ?樣品量:37.6yg
[0462] ?自動(dòng)采樣器溫度:4 X：
[0463] 圖14顯示在所有配方中針對(duì)所有條件(_20°C (14A)、25°C (14B)、3次冷凍/解凍及3 天攪動(dòng)（14C))在所有時(shí)間點(diǎn)的尺寸排阻HPLC的層析圖。已量測(cè)峰％且示于表中。
[0464] 25 °C條件亦使得所有配方在7天后的主峰面積％及前峰％略微改變，在14天進(jìn)一 步增加，其中在此條件下F4顯示最高的前峰聚集增加(0.5%)，但此增加無關(guān)緊要不值得考 慮。
[0465] 在任一配方中在暴露于攪動(dòng)及冷凍-解凍的條件或在_20°C下儲(chǔ)存至多14天時(shí)觀 察到并未發(fā)生顯著改變。
[0466] 基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定
[0467] 方法:
[0468] ?兩批樣品進(jìn)行測(cè)試(在第0和3天后和在第7和14天后）。
[0469] ?除了對(duì)照樣品外，所有的樣品都由同一個(gè)分析師進(jìn)行一次生物測(cè)定。對(duì)照樣品 連續(xù)6天，每一天都要測(cè)試一次。
[0470] ?在280nm處測(cè)量吸光度來確定最初的稀釋制劑和隨后的樣品的精確濃度。
[0471] ?整體的檢測(cè)性能是可以接受的。由53個(gè)板測(cè)得的106個(gè)劑量-反應(yīng)曲線中，3條曲 線需要對(duì)一個(gè)孔進(jìn)行2種不同濃度的封板處理，以滿足孔間變異性分析標(biāo)準(zhǔn)。
[0472] ?孔與孔之間的差異CV% < 20%
[0473] ?檢測(cè)窗口（D/A)2 6
[0474] ? R2> 0.98
[0475] 測(cè)定了 47個(gè)測(cè)試樣品的相對(duì)效價(jià)，對(duì)照組測(cè)定了 6個(gè)不同的時(shí)間。對(duì)照組的平均相 對(duì)效價(jià)為100.2%，95%可信區(qū)間為96.9%~103.6%。
[0476] ?對(duì)照組六次獨(dú)立測(cè)定的方法變異性（％GCV)為3.2%。這種方法的低檢測(cè)變異性 表明，單一測(cè)定獲得的測(cè)試樣品的相對(duì)效價(jià)是可以接受的。
[0477] ?基于單一測(cè)定結(jié)果，大部分的測(cè)試樣品的相對(duì)效價(jià)接近100% (與參考標(biāo)準(zhǔn)具有 可比性）。
[0478] 基于細(xì)胞的生物測(cè)定結(jié)果：
[0479] 圖15顯示包括在所有配方中針對(duì)所有條件(-20￡€(15六）、251€(158)、3次冷凍/解 凍及3天攪動(dòng)（15C))在所有時(shí)間點(diǎn)基于細(xì)胞的效能分析(相對(duì)效能％，如與參考標(biāo)準(zhǔn)的效能 相比）的分析圖形。
[0480]如自圖15可看出，除冷凍/解凍及RT攪動(dòng)條件以外，在-20°C及25°C下所有配方的 相對(duì)效能皆接近100 %。
[0481 ]本發(fā)明的第二部分的項(xiàng)目
[0482] 1. 一種水溶液組合物，其包含：
[0483] -種分離的多肽，是由人的P75腫瘤壞死因子受體的胞外配體結(jié)合部分與人類 IgGl的Fc部分融合而成；
[0484]單糖或二糖；
[0485] 水溶性緩沖液；
[0486] 其特征在于該組合物既不含有精胺酸亦不含有半胱胺酸、也不含選自氯化鈉、氯 化鉀、檸檬酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣、次氯酸鈉硝酸鈉、硫化汞、鉻酸鈉及二氧化鎂的鹽類。
[0487] 2.如項(xiàng)目1的組合物，所述的分離的多肽為依那西普。
[0488] 3.如項(xiàng)目1或2中任一項(xiàng)的組合物，其中該單糖或二糖選自海藻糖、蔗糖及其組合。
[0489] 4.如項(xiàng)目3的組合物，所述的海藻糖的濃度為20mg/mL至80mg/mL。
[0490] 5.如項(xiàng)目3的組合物，所述的鹿糖的濃度為10mg/mL至80mg/mL。
[0491] 6.如項(xiàng)目1至5中任一項(xiàng)的組合物，所述的水溶性緩沖液選自磷酸鈉、磷酸鉀、鈉或 鉀的檸檬酸鹽、馬來酸、乙酸銨、3-羥甲基-氨基甲烷(TRIS )、乙酸鹽、二乙醇胺或其組合。
[0492] 7.如項(xiàng)目6的組合物，其中該水溶性緩沖液濃度20mM至150mM。
[0493] 8.如項(xiàng)目1至7中任一項(xiàng)的組合物，其組分中還含有一種或多種賦形劑。
[0494] 9.如項(xiàng)目8之組合物，所述的賦形劑可為乳糖、丙三醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、 麥芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血凝素、重組右旋糖酐、聚乙烯醇、羥 丙甲纖維素、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯吡咯烷酮羥乙基纖維素、聚乙二醇、乙二醇、二甲亞 砜、二甲基甲酰胺、脯氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、肌氨酸、Y-氨基丁酸、 聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-80、十二烷基硫酸鈉、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物、鉀磷酸 鹽、醋酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氧化三甲胺、甜菜堿、鋅離子、銅離子、鈣離子、錳離子、 鎂離子、3_[(3_丙基乙醇胺)_二甲胺]1-丙烷硫酸鹽、蔗糖單月桂酸酯或它們的混合物。
[0495] 10.如項(xiàng)目1至9中任一項(xiàng)的組合物，所述的組合物溶液的pH值在6.0至7.0之間。
[0496] 11.如項(xiàng)目1至10中任一項(xiàng)的組合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉緩沖 液、60mg/mL海藻糖二水合物，該組合物的pH值為6.2。
[0497] 12.如項(xiàng)目1至10中任一項(xiàng)的組合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉緩沖 液、60mg/mL蔗糖，該組合物的pH值為6.2。
[0498] 13.如項(xiàng)目1至10中任一項(xiàng)的組合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉緩沖 液、60mg/mL海藻糖二水合物、0.1 %聚山梨醇酯20，該組合物的pH值為6.2。
[0499] 14.如項(xiàng)目1至10中任一項(xiàng)的組合物，其包含50mg/mL依那西普、50mM磷酸鈉緩沖 液、60mg/mL蔗糖、0.1 %聚山梨醇酯20，該組合物的pH值為6.2。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水溶液組合物，包括： 一種分離的多肽，是由人P75的腫瘤壞死因子受體的胞外配體結(jié)合部分與人類IgGl的 Fc部分融合而成； 一種濃度范圍在80至130mM的鹽； 一種賦形劑，選自海藻糖和蔗糖或它們的組合； 其特征在于:其組份中既不含精氨酸也不含半胱氨酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的鹽的濃度為90mM。3. 根據(jù)權(quán)利要求1到2中任一所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的鹽為氯化鈉。4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的分離的多肽是 依那西普。5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的賦形劑為濃度 在5至lj 80mg/mL之間的鹿糖。6. 根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的組分中還包括 水溶性緩沖液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的水溶性緩沖液為磷酸鈉、 磷酸鉀、鈉或鉀的檸檬酸鹽、琥珀酸、馬來酸、乙酸銨、3-羥甲基-氨基甲烷(TRIS )、乙酸鹽、 二乙醇胺、組氨酸或其組合。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的水溶性緩沖液的濃度 為15至100mM。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的水溶性緩沖液的濃度在20 至30mM之間。10. 根據(jù)權(quán)利要求6至9中任一所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的水溶性緩沖液 為琥珀酸(琥珀酸鹽）。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一所述的水溶液組合物，其特征在于：其組份中還含有一 種或多種賦形劑。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的水溶液組合物，其特征在于:所述的賦形劑可為乳糖、丙三 醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麥芽糖、肌醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血凝 素、重組右旋糖酐、聚乙烯醇、羥丙甲纖維素、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯吡咯烷酮羥乙基纖 維素、聚乙二醇、乙二醇、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、脯氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨 酸、賴氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸、聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-80、十二烷基硫酸鈉、聚山 梨醇酯、聚氧乙烯共聚物、鉀磷酸鹽、醋酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氧化三甲胺、甜菜堿、 鋅離子、銅離子、鈣離子、錳離子、鎂離子、3-[(3_丙基乙醇胺)-二甲胺]1-丙烷硫酸鹽、蔗糖 單月桂酸酯或它們的混合物。13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一所述的水溶液組合物，其特征在于:所述組合物溶液的 pH值在6.0至7.0之間。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一所述的水溶液組合物，其特征在于：所述組合物包括 50mg/mL依那西普、22mM琥拍酸、90mM氯化鈉、1 Omg/mL鹿糖，溶液的pH值為6 · 3 〇15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一所述的水溶液組合物，其特征在于：所述組合物包括 50mg/mL依那西普、25mM磷酸鈉緩沖液、90mM氯化鈉、34mg/mL鹿糖，溶液的pH值為6 · 3 〇
【文檔編號(hào)】A61K47/02GK105873601SQ201480037939
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年4月29日
【發(fā)明人】卡洛斯·巴納多, 塔瑪爾·拉哈, 塞德里克·貝斯
【申請(qǐng)人】馬柏克辛斯公司