針對(duì)prrs和胞內(nèi)勞森氏菌的豬疫苗的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬疫苗，具體地一種包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌的組合的疫苗，其用于保護(hù)豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染。本發(fā)明還涉及使用該疫苗保護(hù)豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染的方法?！緦＠f明】針對(duì)PRRS和胞內(nèi)勞森氏菌的豬疫苗[0001]-般
技術(shù)領(lǐng)域：
[0002]本發(fā)明一般地涉及豬的健康領(lǐng)域。豬易于受到很多病原微生物。通常通過對(duì)豬圈和飼料進(jìn)行管理，使用藥物如抗病毒藥和抗生素進(jìn)行治療，或者使用疫苗進(jìn)行預(yù)防性治療，來控制感染。[0003]發(fā)明目的[0004]對(duì)于豬的健康管理，持續(xù)需要方便、安全且有效的方法。[0005]發(fā)明概述[0006]為了達(dá)到本發(fā)明的目的，設(shè)計(jì)了一種使豬針對(duì)各種致病微生物感染進(jìn)行聯(lián)合保護(hù)的新疫苗，該疫苗包含活的減毒PRRS(豬繁殖與呼吸綜合征)病毒以及滅活的胞內(nèi)勞森氏菌(Lawsoniaintracellularis)抗原的組合。由于它們對(duì)豬健康的負(fù)面影響，PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌均造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管針對(duì)這兩種類型的微生物的藥物以及疫苗是已知的且可以商購獲得，但是還得不到適合為針對(duì)這些病原體的感染或臨床疾病提供聯(lián)合保護(hù)的聯(lián)合疫苗，所述疫苗有效、質(zhì)量高(例如穩(wěn)定，沒有抗原干擾)不是同時(shí)可安全用于年幼動(dòng)物。如通常所知，并非所有預(yù)期或建議的抗原組合都可以得到安全有效的聯(lián)合疫苗。事實(shí)上，關(guān)于聯(lián)合疫苗的穩(wěn)定性、安全性和有效性，有高水平的不確定性，即使單個(gè)(單價(jià))疫苗安全且有效時(shí)。[0007]要指出的是，術(shù)語"聯(lián)合"并不排除抗原僅在施用于受試動(dòng)物(例如通過在一個(gè)注射部位注射兩個(gè)單獨(dú)的疫苗)之后，以活的PRRS病毒和死的全細(xì)胞胞內(nèi)勞森氏菌的組合形式被提供。[0008]歐洲藥品評(píng)價(jià)局（EuropeanAgencyfortheEvaluationofMedicinalProducts)(EMEA)的獸藥產(chǎn)品委員會(huì)在其出版物"Noteforguidance:requirementsforcombinedveterinaryproducts"（EMEA，2000，CVMP/IWP/52/97_終版）中陳述（第2頁/6頁），"聯(lián)合疫苗的開發(fā)不是簡(jiǎn)單直接的。每種組合都應(yīng)當(dāng)分別在質(zhì)量、安全性和功效方面被開發(fā)和研究"。該委員會(huì)進(jìn)一步指出尋找好的聯(lián)合疫苗通常包括聯(lián)合疫苗中單獨(dú)組分之間的穩(wěn)定性和相容性，包括例如防腐劑、賦形劑和穩(wěn)定劑、滅活劑以及佐劑。在第3頁的第一段中，其陳述，"在聯(lián)合疫苗中，多于一種組分的存在經(jīng)常引起相互作用，導(dǎo)致與一個(gè)或多個(gè)特定組分單獨(dú)施用相比，對(duì)單個(gè)組分的應(yīng)答的減弱或增強(qiáng)......本質(zhì)上此類相互作用通常是免疫學(xué)的，但也可能是由其它對(duì)免疫系統(tǒng)直接影響較小的因素所引起的"，并且"當(dāng)使用佐劑來增加對(duì)聯(lián)合疫苗的免疫反應(yīng)時(shí)，可能出現(xiàn)特殊問題。"[0009]美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部（U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)、食品藥品監(jiān)督管理局（FoodandDrugAdministration)，生物制品審評(píng)和研究中心（CenterforBiologiesEvaluationandResearch)，于1997年4月公布的"GuidanceforIndustry,fortheevaluationofcombinationvaccinesforpreventablediseases：Production，TestingandClinicalStudies"，該指南陳述（第3頁，在"組分的相容性"下），"經(jīng)驗(yàn)已經(jīng)表明，聯(lián)合單價(jià)疫苗所產(chǎn)生的新聯(lián)合可能不如理想中安全或有效。有時(shí)，滅活疫苗的組分可以對(duì)一種或多種活性組分起到不利的作用"，這表明尤其是滅活的疫苗可能對(duì)活疫苗的功效產(chǎn)生負(fù)面的影響，如例如將活百日咳疫苗和滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗進(jìn)行組合時(shí)發(fā)生的，其導(dǎo)致疫苗的百日咳效價(jià)降低。這表示疫苗中任何附加組分都可能會(huì)使最終產(chǎn)品的安全和效價(jià)與單獨(dú)的疫苗相比更復(fù)雜。[0010]世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization)(WHO)已經(jīng)公布了稱為"疫苗安全性基礎(chǔ)(VaccineSafetyBasics)"的電子學(xué)習(xí)教程，其在模塊2(M0DULE2)中關(guān)注聯(lián)合疫苗。該模塊開頭說"獲得許可的聯(lián)合疫苗在國(guó)家當(dāng)局批準(zhǔn)之前要進(jìn)行廣泛的測(cè)試，以確保產(chǎn)品安全、有效以及擁有可接受的質(zhì)量。"該文還陳述到，"對(duì)于所有的組合，生產(chǎn)商因而必須評(píng)估每種抗原組分的效價(jià)，當(dāng)組合以誘導(dǎo)免疫時(shí)疫苗組分的有效性，可能恢復(fù)毒性的風(fēng)險(xiǎn)，以及與其他疫苗組分的反應(yīng)。"[0011]本發(fā)明，在疫苗本身之后，還涉及用于保護(hù)豬免于感染PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的方法，其包括施用所述疫苗。[0012]定義[0013]疫苗是防止接種疫苗后感染病原微生物的組成物，即預(yù)防或減少微生物感染，或預(yù)防或減少感染導(dǎo)致的臨床疾病的組成物，通常是通過干擾微生物本身，例如通過抗體，在接種疫苗的宿主中。因此接種疫苗可以預(yù)防，或至少減少，感染的水平和/或預(yù)防，或至少減少，感染所導(dǎo)致的臨床疾病的水平。[0014]野生型細(xì)菌的滅活抗原為除活細(xì)菌本身外的任意物質(zhì)或化合物，針對(duì)其的免疫應(yīng)答會(huì)被激發(fā)，作為該免疫應(yīng)答的結(jié)果，使得相應(yīng)的毒性細(xì)菌或一種或多種其毒性因子將會(huì)被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別，并且最終至少被部分中和。野生型細(xì)菌的滅活抗原的通常例子是死的全細(xì)菌(術(shù)語"全"不排除在殺死的過程中細(xì)菌細(xì)胞至少部分的破裂，或者在"死的全細(xì)胞細(xì)菌"疫苗中實(shí)際上提供死的全細(xì)胞細(xì)菌的提取物或勻漿作為抗原），細(xì)菌的亞單位如表面表達(dá)蛋白，以及毒素。后兩者可以或者可以不被重組表達(dá)。對(duì)于胞內(nèi)勞森氏菌，幾種類型的滅活抗原在本領(lǐng)域是已知的，且例如從W02009/144088(死的全細(xì)胞細(xì)菌，實(shí)施例1和2)、W02005/070958(亞單位）和W097/20050(死的全細(xì)胞）已知。[0015]活的減毒病毒是能夠自我復(fù)制，但不能引起通常與其毒性(通常是野生型)病原對(duì)應(yīng)物相關(guān)的疾病的全套癥狀的病毒。通常，活病毒不在目標(biāo)宿主內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，或復(fù)制速度不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞顯著有害，或不引起有害的宿主應(yīng)答。對(duì)于PRRS病毒，幾種疫苗在本領(lǐng)域是已知的，其包含衍生自野生型病毒的減毒活病毒，其毒性經(jīng)過在體外培養(yǎng)的宿主細(xì)胞系中多次傳代被減弱，如例如P〇rcilis?PRRS(MSDAnimalHealth)、IngelvaC?PRRSMLV(BoehringerIngelheim)、Amervac_PRRS(HipraLaboratories)、Pyrsvac-183?(HipraLaboratories)以及F〇stem?PRRS(Zoetis)。在本領(lǐng)域中其它活的減毒PRRS病毒已例如在VeterinaryMicrobiology，volume138，issues1_2,2July2009，，第34-40頁；VeterinaryImmunologyandImmunopathology,volume106,issues3_4，15July2005，第309-319頁以及Vaccine，volume26，issues29-30,4July2008,第3594-3600頁中描述。[0016]本發(fā)明的實(shí)施方案[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中疫苗用于在單次施用后保護(hù)豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染。有利的發(fā)現(xiàn)，該疫苗甚至僅在單次施用后即可保護(hù)豬免受兩種病原體的感染。該實(shí)施方案不排除給予后續(xù)疫苗接種，例如第一次接種疫苗后6到12個(gè)月以延續(xù)保護(hù)的水平。該后續(xù)疫苗接種不同于初免-加強(qiáng)接種方案中的加強(qiáng)接種，后者僅在加強(qiáng)接種后才能獲得保護(hù)。在初免-加強(qiáng)方案中，兩次疫苗接種通常間隔2-3周。[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中疫苗包含佐劑。發(fā)現(xiàn)通常用于改善滅活抗原的免疫應(yīng)答的佐劑不會(huì)負(fù)面干擾活的減毒PRRS病毒，也不會(huì)過分增加對(duì)其它抗原的反應(yīng)性，盡管WHO在其疫苗安全性基礎(chǔ)課程(參見上文)的第1頁最后兩行（"聯(lián)合疫苗"章節(jié)）中明確警告了這類干擾和反應(yīng)性。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中佐劑包括礦物油，例如飽和烴油，其可從ExxonMobil?購得(Marcol?52)。[0019]在還另一個(gè)實(shí)施方案中，滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原包括死的全細(xì)胞胞內(nèi)勞森氏菌，優(yōu)選負(fù)載量使得每劑量該疫苗包含相當(dāng)于lxio7胞內(nèi)勞森氏菌的胞內(nèi)勞森氏菌抗原。此實(shí)施方案不排除更高的抗原負(fù)載，其可正向影響保護(hù)的水平和免疫力的持續(xù)時(shí)間。[0020]關(guān)于疫苗的PRRSv負(fù)載，在一個(gè)實(shí)施方案中每劑量疫苗包含4.01ogl0(4單位的101〇g)TCID5Q的減毒PRRS病毒。此實(shí)施方案不排除更高的抗原負(fù)載，其可正向影響保護(hù)的水平和免疫力的持續(xù)時(shí)間。[0021]將使用以下實(shí)施例和附圖進(jìn)一步解釋本發(fā)明。[0022]實(shí)施例1描述了對(duì)PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌聯(lián)合疫苗的一項(xiàng)研究[0023]圖1顯示激發(fā)后體溫[0024]圖2顯示激發(fā)后平均日增重(ADWG)[0025]圖3顯示激發(fā)后PPRS病毒血清學(xué)[0026]圖4顯示激發(fā)后胞內(nèi)勞森氏菌血清學(xué)[0027]圖5顯示激發(fā)后PRRS病毒病毒血癥[0028]實(shí)施例2描述了對(duì)PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌聯(lián)合疫苗的另一項(xiàng)研究[0029]實(shí)施例1[0030]研究設(shè)計(jì)[0031]五只母豬的后代（23只仔豬）用于該試驗(yàn)。當(dāng)仔豬約兩周齡時(shí)對(duì)它們接種疫苗如下：[0032]-第一組（組I，8只動(dòng)物）接種（頂)使用DiluvacF〇rte?(MSDAnimalHealth)溶解的冷凍干燥的P〇rcilis?PRRS疫苗（購自MSDAnimalHealth，Boxmeer，TheNetherlands)。單劑量為2ml(注射劑量）中包含計(jì)算量為41og10TCID5Q的病毒，頸部右側(cè)給藥。[0033]-第二組（組2,9只動(dòng)物）接種溶解于即用型胞內(nèi)勞森氏菌疫苗[參見W02009/127684，抗原的實(shí)施例2:死的全細(xì)胞，在本實(shí)驗(yàn)中配制成水包油乳液，包含12.5%v/v(=油的體積比上疫苗的總體積）的礦物油Marco〗?52(ExxonMobi1)，0.75%w/v的維生素E醋酸酯和0.80%的聚山梨酯80(吐溫80;SigmaAldrich)以及注射用水]的相同的PRRS疫苗。該疫苗在室溫下混合，施用前放置長(zhǎng)達(dá)30分鐘。單劑量為2ml(注射劑量）中包含計(jì)算量為41〇g1QTCID5Q的病毒和2xl07細(xì)菌細(xì)胞，頸部右側(cè)給藥。[0034]_第三組(組3,6只動(dòng)物）中的仔豬未接受疫苗接種而是作為未接種的激發(fā)對(duì)照。激發(fā)感染在疫苗接種后4周使用毒性PRRS激發(fā)病毒通過鼻內(nèi)途徑完成。[0035]接種和激發(fā)后，每天觀察所有仔豬的臨床體征。在感染前一天和當(dāng)天以及之后10天的每天測(cè)量體溫。在激發(fā)前一天，激發(fā)后10天以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天(激發(fā)后27天)確定體重。激發(fā)時(shí)及3、5、7、10、14、21和28天后收集血樣。[0036]實(shí)驗(yàn)程序[0037]獸醫(yī)檢查[0038]在接種疫苗的前一天，對(duì)仔豬進(jìn)行一般健康檢查。[0039]觀察臨床體征[0040]所有豬在到達(dá)當(dāng)天即開始每天觀察臨床體征。激發(fā)當(dāng)天開始記錄個(gè)體的可能的全身性反應(yīng)例如食欲不振、不愿移動(dòng)、傾向于躺下、倦怠或瞌睡、發(fā)抖、毛發(fā)豎立以及可能的水月中(尤其在眼部周圍）、嘔吐和腹瀉或呼吸急促和腹式呼吸。[0041]測(cè)量體溫[0042]在激發(fā)前一天和當(dāng)天以及之后10天的每天(每天的相同時(shí)刻），記錄所有動(dòng)物的體溫。[0043]測(cè)量體重[0044]激發(fā)前一天，激發(fā)后10和27天，測(cè)量仔豬的體重。[0045]血液采樣[0046]在疫苗接種前一天采集所有母豬的血液樣品以確認(rèn)陰性狀態(tài)。激發(fā)時(shí)及激發(fā)后3、5、7、10、14、21和28天采集仔豬血樣。血清樣品被用于檢測(cè)?1?1?病毒的可能存在以及?1?1?￥特異性抗體和胞內(nèi)勞森氏菌特異性抗體的可能存在。[0047]結(jié)果[0048]臨床體征[0049]在實(shí)驗(yàn)過程中，疫苗接種或激發(fā)后未觀察到臨床反應(yīng)。除了礦物油是非常刺激的佐劑，尤其是對(duì)于豬，其可能導(dǎo)致嚴(yán)重的局部反應(yīng)，看起來將該佐劑用于新的聯(lián)合疫苗是安全的。因此對(duì)于任何更溫和的佐劑，安全性可理解為完全沒有問題。[0050]體溫[0051]計(jì)算每組激發(fā)前一天和當(dāng)天所測(cè)量的平均激發(fā)前體溫。圖1顯示與激發(fā)前平均體溫相比直到10天平均體溫的升高。未接種疫苗的對(duì)照仔豬組中只有激發(fā)后第2天平均體溫升高了rc。其它所有激發(fā)后時(shí)間點(diǎn)在接種疫苗組和對(duì)照組仔豬中均未檢測(cè)到升高。[0052]體重和體重增加[0053]實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將仔豬隨機(jī)分組，不考慮起始體重和性別。如圖2所示，趨勢(shì)是組2的聯(lián)合疫苗提供的ADWG(平均日增重)與單獨(dú)的PRRSV疫苗相同，高于對(duì)照組。[0054]PRRSV血清學(xué)[0055]只有接受PRRS疫苗的豬受到激發(fā)時(shí)為陽性。如圖3所示(結(jié)果表示為"樣品比陽性或S/P"比例，使用IDEXXPRRSX3ELISA)，抗PRRS抗體效價(jià)似乎未受到勞森氏菌抗原的負(fù)面影響。相反，對(duì)PRRS抗體效價(jià)似乎還有意料之外的正面影響，因?yàn)樵诿總€(gè)時(shí)間點(diǎn)接受了聯(lián)合疫苗的動(dòng)物的PRRS效價(jià)都更高。這暗示由于某些還未理解的原因，勞森氏菌抗原增強(qiáng)了對(duì)活PRRS病毒的免疫反應(yīng)。[0056]胞內(nèi)勞森氏菌血清學(xué)[0057]圖4給出了勞森氏菌血清學(xué)的結(jié)果。如圖所示，組1中的動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均保持陰性。組2中動(dòng)物的80-90%得到了良好的血清抗體陽轉(zhuǎn)率，與動(dòng)物被保護(hù)免于毒性勞森氏菌激發(fā)的陽轉(zhuǎn)率相當(dāng)。[0058]激發(fā)后PRRSV病毒血癥[0059]如通常所知，病毒血癥是保護(hù)免于PRRS病毒感染及其導(dǎo)致的臨床疾病的主要讀出方式。結(jié)果在圖5中給出。組1和2在病毒血癥方面均有非常高且相當(dāng)?shù)臏p少。[0060]實(shí)施例2[0061]研究設(shè)計(jì)[0062]設(shè)計(jì)該研究以確定該聯(lián)合疫苗不依賴于佐劑的類型和活PRRS毒株的類型。為此，使用了替代佐劑DiluvacForte(可購自MDSMDSAnimalHealth，Boxmeer，TheNetherlands)以及卡波普(可以是卡波普974P，購自Lubrizol，Cleveland，Ohio，USA)。替代PRRSv毒株為2型毒株（而不是在實(shí)施例1中使用的1型毒株），存在于市售疫苗PrimePacPRRS(可購自MerckAnimalHealth，Millsboro，Delaware，USA)2*。[0063]幾只母豬的后代被用于分配15只仔豬于3個(gè)5只仔豬的治療組。在大約1周齡時(shí)，組1和2的仔豬被接種重構(gòu)于DiluvacForte(DF)或卡波普(0.8%w/v)中的凍干滅活勞森氏菌疫苗(與實(shí)施例1中使用的抗原相同，但現(xiàn)在是凍干的因而與凍干穩(wěn)定劑結(jié)合），如下文表1中所列。疫苗于頸部左側(cè)肌肉內(nèi)（IM)施用。在約5周齡時(shí)，仔豬被(再次)接種兩種不同的活PRRSV毒株和勞森氏菌抗原，通過重構(gòu)抗原于DF或卡波普（0.8%w/v)組合成一個(gè)疫苗。PRRSV2型疫苗PrimePacPRRS被溶解為2ml中含有104'5TCID5Q的病毒而PRRSV1型疫苗PorcilisPRRS被溶解為2ml中含有IO^TCIDm的病毒。對(duì)于第二次疫苗接種，疫苗于頸部右側(cè)肌肉內(nèi)（頂)施用。組3的仔豬不接種疫苗且作為未接種對(duì)照。[0064]表1疫苗接種方案[0066]初次疫苗接種后每天觀察仔豬的臨床體征。初次疫苗接種之前，二次疫苗接種之前，以及二次疫苗接種之后的二、四和六周采集所有仔豬的血液樣品。檢測(cè)血清樣品中針對(duì)PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的抗體。[0067]結(jié)果[0068]在實(shí)驗(yàn)過程中未觀察到臨床反應(yīng)。二次疫苗接種當(dāng)天所有動(dòng)物的胞內(nèi)勞森氏菌和PRRS抗體均為陰性。二次疫苗接種后六周，除了對(duì)照，所有動(dòng)物的勞森氏菌和PRRSv特異性抗體均為陽性。這證明該聯(lián)合疫苗是安全的并引起了針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌和PRRS病毒的主動(dòng)免疫?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種疫苗，其包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的組合。2.-種疫苗，其包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的疫苗的組合，用于保護(hù)豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染。3.-種疫苗，其包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的疫苗的組合，用于保護(hù)豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染所導(dǎo)致的臨床疾病。4.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于所述疫苗用于在單次施用后保護(hù)豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌的感染。5.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于所述疫苗包含佐劑。6.權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于所述佐劑包含礦物油。7.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于所述滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原包括死的全細(xì)胞胞內(nèi)勞森氏菌。8.權(quán)利要求7的疫苗，其特征在于所述疫苗每劑量包含相當(dāng)于IX107胞內(nèi)勞森氏菌的胞內(nèi)5?森氏囷抗原。9.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于所述疫苗每劑量包含4.Olog10TCID50的減毒PRRS病毒。10.保護(hù)豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌感染的方法，其包括給動(dòng)物施用包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的組合的疫苗。11.保護(hù)豬免于PRRS病毒和胞內(nèi)勞森氏菌感染的方法，其包括給動(dòng)物施用包含活的減毒PRRS病毒和滅活的胞內(nèi)勞森氏菌抗原的組合的疫苗。12.權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于所述方法在單次疫苗注射后帶來保護(hù)。【文檔編號(hào)】A61K39/02GK105873604SQ201480066510【公開日】2016年8月17日【申請(qǐng)日】2014年12月2日【發(fā)明人】C·德雷克斯勒,A·A·C·賈科布斯【申請(qǐng)人】英特維特國(guó)際股份有限公司