一種自組裝靶向納米藥物載體粒子及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種自組裝靶向納米藥物載體粒子的制備方法，包括：八臂羧基聚乙二醇與雙氫青蒿素進行酯化反應(yīng)，得到八臂聚乙二醇?雙氫青蒿素結(jié)合物；八臂聚乙二醇?雙氫青蒿素結(jié)合物用NHS活化；活化后的結(jié)合物進一步與靶向分子轉(zhuǎn)鐵蛋白利用酰胺鍵進行化學連接；將轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的八臂聚乙二醇?雙氫青蒿素結(jié)合物用透析的方法除去雜質(zhì)，過濾后冷凍干燥；自組裝得到轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的納米藥物載體粒子。該納米粒子具有雙層結(jié)構(gòu)，外層為親水性的聚乙二醇，內(nèi)層為疏水的小分子藥物雙氫青蒿素。本發(fā)明的優(yōu)點：采用八臂羧基聚乙二醇大大的提高了載藥量；可以實現(xiàn)藥物對腫瘤細胞的靶向作用以及腫瘤細胞內(nèi)的pH敏感釋放；靶向治療減少對正常組織的毒副作用；制備工藝簡單，易于操作。
【專利說明】
-種自組裝卽向納米藥物載體粒子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種自組裝祀向納米藥物載體粒子的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥已成為危害人類健康的主要疾病，治療癌癥的重要手段之一是化學藥物治 療，然而許多抗癌藥物存在著難溶于水、穩(wěn)定性差等缺陷。此外，抗癌藥物的選擇性差、不良 反應(yīng)大W及腫瘤存在抗藥性等極大地影響了腫瘤治療的療效，嚴重的毒性反應(yīng)甚至常常迫 使治療中斷。因此，如何增溶難溶性抗癌藥物、提高對癌細胞的選擇性和降低藥物的不良反 應(yīng)顯得非常重要。
[0003] 目前采用親水性的聚乙二醇來修飾難溶性的藥物能極大的提高藥物的溶解性及 穩(wěn)定性。聚乙二醇(P〇lyethyleneglyool，PEG)是用環(huán)氧乙燒與水或乙二醇逐步加成聚合得 到的分子量較低的水溶性聚酸，其重復(fù)單元為氧乙締基，端基為兩個徑基，呈線性或支化鏈 狀結(jié)構(gòu)。陽G是迄今為止已知高分子中蛋白和細胞吸收水平最低的高分子，由于無毒及良好 的生物相容性，PEG已被抑A批準為體內(nèi)注射用高分子。藥物的聚乙二醇修飾即聚乙二醇化， 通常是將活化的聚乙二醇通過化學方法偶聯(lián)到蛋白質(zhì)、多膚、小分子藥物和脂質(zhì)體上。1977 年Abuchowski等首次將甲氧基聚乙二醇(metho巧polyethylene glyeol，m陽G)共價連接 到蛋白質(zhì)上，獲得療效優(yōu)于未修飾原型藥物的mPEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物之后，PEG修飾技術(shù)逐漸 受到重視，已成為目前藥物化學修飾的研究熱點。聚乙二醇修飾的藥物與未修飾的藥物相 比，具有W下突出的優(yōu)點：（1)溶解性提高；（2)對腫瘤有更強的被動祀向作用；（3)半衰期 延長；（4)最大血藥濃度降低；（5)血藥濃度波動較??；（6)酶降解作用減少；（7)免疫原性及 抗原性減??；（8)毒性降低；（9)生物活性增強；（10)用藥頻率減少。
[0004] 為提高藥物對腫瘤細胞的選擇性，減少對正常組織細胞的毒副作用，通過配體-受 體介導(dǎo)的主動祀向藥物傳遞系統(tǒng)已經(jīng)成為癌癥治療研究的熱點。轉(zhuǎn)鐵蛋白是是一種非血紅 素結(jié)合鐵的0-球蛋白，廣泛分布于脊椎動物的體液及細胞中，分血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，卵轉(zhuǎn)鐵蛋 白，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白Ξ種。不同種類的轉(zhuǎn)鐵蛋白有不同的物理，化學和免疫特性，但均為具有兩 個化結(jié)合位點的單膚鏈糖蛋白，其中W血清轉(zhuǎn)鐵蛋白含量最多，廣泛分布且提供絕大多數(shù) 組織器官所需的鐵。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是一種跨膜糖蛋白，分子量約170~200 kD。腫瘤細胞表面 的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是正常細胞的2~7倍，腫瘤細胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體親和力是正 常細胞的10倍~100倍。惡性腫瘤表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的超量表達提供了轉(zhuǎn)鐵蛋白作為導(dǎo)向基 團的可能性。
[0005] 本發(fā)明的目的是建立一種祀向納米藥物載體粒子的制備方法，首先通過八臂簇基 聚乙二醇與小分子疏水藥物雙氨青葛素進行化學連接，增大藥物的溶解性、穩(wěn)定性W及半 衰期;進一步采用祀向分子轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾，提高對腫瘤細胞的選擇性，減少對正常組織細胞 的毒副作用;最后通過自組裝形成祀向納米藥物載體粒子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是建立一種祀向納米藥物載體粒子的制備方法，該藥物載體粒子具 有W下優(yōu)點:載藥量高;穩(wěn)定性好;可實現(xiàn)藥物對癌細胞的祀向傳遞及癌細胞內(nèi)pH敏感性釋 放。
[0007] 合成的轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物通過自組裝形成的祀向納米藥物 載體粒子具有雙層結(jié)構(gòu)，外層為親水性的八臂簇基聚乙二醇，進一步通過祀向分子轉(zhuǎn)鐵蛋 白修飾；內(nèi)層為疏水的小分子藥物雙氨青葛素。
[0008] 所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚乙二醇-雙氨青葛素聚結(jié)合物為W下的結(jié)構(gòu)：
其中： 聚乙二醇為八臂簇基聚乙二醇； 本發(fā)明的技術(shù)方案： 1) 八臂聚乙二醇修飾雙氨青葛素
2) 轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾活化的八臂聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物
3) 納米粒子的制備 用沉淀法自組裝制備納米粒子。具體方法:將合成的轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚乙二醇-雙氨青葛素 聚結(jié)合物溶于DMS0中，逐滴加入到輕微攬拌水溶液中，純水透析化;過濾后，冷凍干燥得到 祀向納米藥物粒子。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點： 1) 通過聚乙二醇的改性可對雙氨青葛素的結(jié)合藥物提供保護，提高了其穩(wěn)定性和水溶 性，降低了毒性，并延長了雙氨青葛素在生物體中的循環(huán)半衰期，同時具有多個官能團的八 臂聚乙二醇有較大的載藥量，保證了適當?shù)乃幬餄舛群吞峁┚忈尮δ埽?2) 自組裝祀向納米藥物載體粒子具有祀向釋放藥物功能，可有效的減少藥物對正常組 織細胞的毒副作用； 3)制備工藝簡單，易于操作。
【具體實施方式】
[0010]下面給出的實例對本發(fā)明進行具體描述，但不限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍由權(quán)利 要求限定。
[00川實施例1: 八臂聚乙二醇（10邸a)-雙氨青葛素結(jié)合物的合成：向50ml干燥的Ξ口瓶中持續(xù)通入 化;在化的保護下將0.2?雙氨青葛素，1.25g八臂簇基聚乙二醇(Mw 10，000)溶于15ml二氯 甲燒中，再添加0.19g邸C，0.12g DMAP，0 °C下攬拌溶解，攬拌反應(yīng)1小時，然后室溫攬拌反 應(yīng)2地；待反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去溶劑，100ml冰乙酸沉淀，過濾后得到八臂聚乙二醇-雙氨 青葛素結(jié)合物粗品；用20ml DMF^PA (l:4(v/v))重結(jié)晶，濾去不溶物，產(chǎn)物用100ml乙酸沉 淀，過濾，產(chǎn)物真空干燥，得到純度95%W上的八臂聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物； 轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇（10 KDa)-雙氨青葛素結(jié)合物的合成:0.05g八臂聚乙二醇-雙 氨青葛素結(jié)合物溶于20ml水溶液中，加入lOmg抓C，5mg NHS，3mg DMAP活化化；隨后加入轉(zhuǎn) 鐵蛋白0.36g室溫下伴隨輕微的攬拌反應(yīng)化;反應(yīng)后的溶液移至透析袋中透析化除去未反 應(yīng)的試劑，過濾后冷凍干燥得到轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的八臂聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物； 納米粒子的制備：用沉淀法來制備納米粒子;50mg轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇-雙氨青葛 素結(jié)合物溶解于0.2ml DMS0中，逐滴加入到3.8ml輕微攬拌的水溶液中；然后將轉(zhuǎn)鐵蛋白- 八臂聚乙二醇-雙氨青葛素溶液移至透析袋中透析化，濾膜過濾后，冷凍干燥得到祀向納米 藥物載體粒子。
[0012]實施例2: 八臂聚乙二醇(20邸a)-雙氨青葛素結(jié)合物的合成：向50ml干燥的Ξ口瓶中持續(xù)通入 化;在化的保護下將0.14g雙氨青葛素，1.25g八臂簇基聚乙二醇(Mw 20，000)溶于15ml四氨 巧喃中，再添加0.10g邸C，0.06g DMAP，0 °C下攬拌溶解，攬拌反應(yīng)1小時，然后室溫攬拌反 應(yīng)2地；待反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去溶劑，100ml冰乙酸沉淀，過濾后得到八臂聚乙二醇-雙氨 青葛素結(jié)合物粗品；用20ml DMF^PA (l:4(v/v))重結(jié)晶，濾去不溶物，產(chǎn)物用100ml乙酸沉 淀，過濾，產(chǎn)物真空干燥，得到純度95%W上的八臂聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物； 轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇（20邸a)-雙氨青葛素結(jié)合物的合成：0.05g八臂聚乙二醇- 雙氨青葛素結(jié)合物溶于20ml水溶液中，加入lOmg抓C，5mg N服，3mg DMAP活化化;隨后加入 轉(zhuǎn)鐵蛋白0.1?室溫下伴隨輕微的攬拌反應(yīng)化;反應(yīng)后的溶液移至透析袋中透析化除去未 反應(yīng)的試劑，過濾后冷凍干燥得到轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的八臂聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物； 納米粒子的制備：用沉淀法來制備納米粒子;50mg轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇-雙氨青葛 素結(jié)合物溶解于0.2ml DMS0中，逐滴加入到3.8ml輕微攬拌的水溶液中；然后將轉(zhuǎn)鐵蛋白- 八臂聚乙二醇-雙氨青葛素溶液移至透析袋中透析化，濾膜過濾后，冷凍干燥得到祀向納米 藥物粒子。
[001引實施例3: 八臂聚乙二醇(40邸a)-雙氨青葛素結(jié)合物的合成：向50ml干燥的Ξ口瓶中持續(xù)通入 化;在化的保護下將0. Hg雙氨青葛素，2.50g八臂簇基聚乙二醇(Mw 40，000)溶于20ml 1，3- 二氧六環(huán)中，再添加 O.lOg抓C，0.06g DMAP，0 °C下攬拌溶解，攬拌反應(yīng)1小時，然后室溫攬 拌反應(yīng)24h;待反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去溶劑，100ml冰乙酸沉淀，過濾后得到八臂聚乙二醇- 雙氨青葛素結(jié)合物粗品；用20ml DMF^PA (l:4(v/v))重結(jié)晶，濾去不溶物，產(chǎn)物用100ml乙 酸沉淀，過濾，產(chǎn)物真空干燥，得到純度95%W上的八臂聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物； 轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇(40 KDa)-雙氨青葛素結(jié)合物的合成:0.05g八臂聚乙二醇-雙 氨青葛素結(jié)合物溶于20ml水溶液中，加入lOmg抓C，5mg NHS，3mg DMAP活化化；隨后加入轉(zhuǎn) 鐵蛋白0.09g室溫下伴隨輕微的攬拌反應(yīng)化;反應(yīng)后的溶液移至透析袋中透析化除去未反 應(yīng)的試劑，過濾后冷凍干燥得到轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的八臂聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物； 納米粒子的制備：用沉淀法來制備納米粒子;50mg轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇-雙氨青葛 素結(jié)合物溶解于0.2ml DMS0中，逐滴加入到3.8ml輕微攬拌的水溶液中；然后將轉(zhuǎn)鐵蛋白- 八臂聚乙二醇-雙氨青葛素溶液移至透析袋中透析化，濾膜過濾后，冷凍干燥得到祀向納米 藥物粒子。
[0014] 實施例4: 八臂聚乙二醇（10邸a)-雙氨青葛素結(jié)合物的合成：向50ml干燥的Ξ口瓶中持續(xù)通入 化;在化的保護下將〇.2始雙氨青葛素，1.25g八臂簇基聚乙二醇(Mw !0,000)溶于15ml 1,4- 二氧六環(huán)中，再添加〇.19g EDC，0.12g DMAP，0 °C下攬拌溶解，攬拌反應(yīng)1小時，然后室溫攬 拌反應(yīng)2地；待反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去溶劑，100ml冰乙酸沉淀，過濾后得到八臂聚乙二醇- 雙氨青葛素結(jié)合物粗品；用20ml DMF^PA (l:4(v/v))重結(jié)晶，濾去不溶物，產(chǎn)物用100ml乙 酸沉淀，過濾，產(chǎn)物真空干燥，得到純度95%W上的八臂聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物； 轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇（10邸a)-雙氨青葛素結(jié)合物的合成：0.05g八臂聚乙二醇- 雙氨青葛素結(jié)合物溶于20ml水溶液中，加入lOmg抓C，5mg N服，3mg DMAP活化化;隨后加入 轉(zhuǎn)鐵蛋白0.3?室溫下伴隨輕微的攬拌反應(yīng)化;反應(yīng)后的溶液移至透析袋中透析化除去未 反應(yīng)的試劑，過濾后冷凍干燥得到轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的八臂聚乙二醇-雙氨青葛素結(jié)合物； 納米粒子的制備：用沉淀法來制備納米粒子;50mg轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇-雙氨青葛 素結(jié)合物溶解于0.2ml DMS0中，逐滴加入到3.8ml輕微攬拌的水溶液中；然后將轉(zhuǎn)鐵蛋白- 八臂聚乙二醇-雙氨青葛素溶液移至透析袋中透析化，濾膜過濾后，冷凍干燥得到祀向納米 藥物粒子。
【主權(quán)項】
1. 一種自組裝革G向納米藥物載體粒子及其制備方法，其結(jié)構(gòu)特征在于：由粒徑為100~ 200 nm的納米粒子組成，由轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇-雙氫青蒿素結(jié)合物通過自組裝形成， 所述的納米藥物載體粒子的制備步驟如下： (1) 八臂聚乙二醇-雙氫青蒿素結(jié)合物的制備：以雙氫青蒿素為原料，在N2保護下，將雙 氫青蒿素、八臂聚乙二醇溶于有機溶劑中，〇 °C下加入有機堿作為催化劑反應(yīng)1小時，然后 移至室溫下反應(yīng)24 h;待反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去溶劑，冰乙醚沉淀，過濾后得到八臂聚乙二 醇-雙氫青蒿素結(jié)合物粗品；二甲基甲酰胺(DMF)-異丙醇(IPA)重結(jié)晶、過濾，冰乙醚沉淀過 濾后真空干燥，然后得到純度95%以上的八臂聚乙二醇-雙氫青蒿素結(jié)合物； (2) 將（1)所述的八臂聚乙二醇-雙氫青蒿素結(jié)合物利用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)進行 活化，然后將靶向分子轉(zhuǎn)鐵蛋白在有機堿的作用下與活化后的八臂聚乙二醇-雙氫青蒿素 結(jié)合物在水溶液中進行化學連接，得到轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇-雙氫青蒿素結(jié)合物，進一 步采用透析的方法除去雜質(zhì)； (3) 采用沉淀法制備納米粒子，將轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇-雙氫青蒿素結(jié)合物溶解于 二甲基亞砜(DMSO)中，逐滴加入到輕微攪拌的水溶液中；然后將轉(zhuǎn)鐵蛋白-八臂聚乙二醇-雙氫青蒿素結(jié)合物溶液移至透析袋中純水透析3h，濾膜過濾后，冷凍干燥得到靶向納米藥 物粒子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述自組裝靶向納米藥物載體粒子及其制備方法，其特征在于，所述 的有機溶劑為二氯甲烷、四氫呋喃、1，3-二氧六環(huán)、1，4-二氧六環(huán)中的一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述自組裝靶向納米藥物載體粒子及其制備方法，其特征在于，所述 的八臂聚乙二醇為八臂羧基聚乙二醇，分子量為10000~40000道爾頓。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述自組裝靶向納米藥物載體粒子及其制備方法，其特征在于，所述 的有機堿為可溶于水的碳二亞胺(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述自組裝靶向納米藥物載體粒子及其制備方法，其特征在于，所述 的有機堿EDC和DMAP與雙氫青蒿素的摩爾比都為1:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述自組裝靶向納米藥物載體粒子及其制備方法，其特征在于，所述 的的DMF與IPA的比例為1:4。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述自組裝靶向納米藥物載體粒子及其制備方法，其特征還在于，所 述的納米粒子具有雙層結(jié)構(gòu)，外層為親水性的八臂聚乙二醇，內(nèi)層為疏水的小分子藥物雙 氫青蒿素。
【文檔編號】A61K31/366GK105879050SQ201610337766
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月22日
【發(fā)明人】雷建都, 劉刻峰, 何靜
【申請人】北京林業(yè)大學