一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，公開了一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料及其制備方法。所述制備方法為：通過對聚乙二醇?聚己內(nèi)酯嵌段共聚物端基的修飾，合成出含有陽離子鏈段的多嵌段聚合物，然后將此聚合物與疏水藥物溶液混合，再進一步與核酸復(fù)合，得到藥物基因聚合物復(fù)合物膠束；進一步將此膠束溶液與α?環(huán)糊精溶液混合后攪拌，室溫下靜置，得到水凝膠。該水凝膠可用于制備可注射藥物基因載體。本發(fā)明具有操作簡單、凝膠強度和凝膠化時間可調(diào)、室溫成型、不涉及化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)以及有機溶劑的使用、獲得的凝膠具備溫度敏感性、良好的生物相容性和明顯的轉(zhuǎn)染效果等優(yōu)勢，有望在生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
【專利說明】
一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]藥物與基因的結(jié)合治療是目前用于癌癥以及先天性免疫系統(tǒng)疾病治療的一種新型有效方法。該技術(shù)實施的關(guān)鍵是選擇合適的能夠共載藥物和基因的載體以及提高該載體的基因轉(zhuǎn)染效率，進而不僅使藥物能夠在細胞中發(fā)揮作用有效釋放，同時基因能夠在細胞中獲得安全、高效且穩(wěn)定的表達。水凝膠作為一類可用作藥物載體的生物醫(yī)用材料，具有負載率高、可保護大分子藥物免受生物體的降解或清除、以及對藥物分子的可持續(xù)釋放等特性，近年來已被研究用于藥物與基因的負載和控釋。例如，Tabassi等合成了聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯三嵌段共聚物，與環(huán)糊精作用形成超分子水凝膠，應(yīng)用于可控釋放的納洛酮和維生素Bi2兩種藥物的遞送(Journal of Sol-gel Science and Technology 2014,69:166-171) Jahesh等合成出聚酰胺胺-聚乙二醇-聚賴氨酸三嵌段聚合物能夠成功負載基因進入癌細胞、沉默B淋巴細胞瘤-2基因并呈現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性(ACS Nano 2011,5:1877-1887)。Shi等合成的的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚乙烯亞胺(mPEG5K-PCL2K-PEI2K)三嵌段聚合物形成的膠束共載阿霉素和DNA，并證明了藥物基因共載產(chǎn)生了比單獨使用藥物或基因更好的抗癌效果(B1materials2014,35:4536-4547)。然而，這些合成高分子聚合物多數(shù)只能單一載基因或藥物，治療效果不顯著，且載體的通常轉(zhuǎn)染效率不高、毒性較大且藥物載體材料也不能夠緩釋控釋，藥物利用率不高。因此，如何在溫和條件下構(gòu)建生物兼容性良好共載藥物和基因并具有高轉(zhuǎn)染效率的水凝膠藥物基因載體材料，便成為當前生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域亟待解決的重要課題。
[0003]迄今為止，通過聚合物與環(huán)糊精的主客體相互作用原位負載藥物和基因的超分子水凝膠及其應(yīng)用尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過上述方法制備得到的超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料。
[0006]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]—種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，包括如下制備步驟:
[0008](I)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸(HiPEG-PCL-G3-(G3)n)多嵌段聚合物的合成:
[0009]a、將雙Boc (N，N ’ _ 二叔丁氧羰基)保護的賴氨酸Ly s (boc) 2溶解于N, N-二甲基甲酰胺中，加入炔丙胺;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入1-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室溫反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到Boc保護的第一代Gl(boc)2,;將61(130(:)2脫除80(3保護基團得到G1，然后加入Lys(boC)2和N，N-二甲基甲酰胺，并加入三乙胺;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入HOBt和HBTU，在室溫條件下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到Boc保護的第二代G2(boc)2;將G2(boc)2脫除Boc保護基團得到G2，然后加入Lys(boC)2和N，N-二甲基甲酰胺，并加入三乙胺;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入HOBt和HBTU，室溫條件下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到Boc保護的第三代G3(boc)2，脫除Boc保護基團后得到G3;
[0010]b、將聚乙二醇與ε-己內(nèi)酯在氮氣保護下，于50?120°C溫度下進行反應(yīng)，辛酸亞錫做反應(yīng)催化劑，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物(mPEG-PCL);
[0011]C、將聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物溶解于N，N-二甲基甲酰胺，形成反應(yīng)介質(zhì)，加入疊氮乙酸，二環(huán)己基碳二亞胺作為失水劑，4-二甲氨基吡啶作為催化劑，室溫反應(yīng)得mPEG-PCL-N3 ；將mPEG-PCL_N3與G3溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，然后依次加入已溶解的五水硫酸銅(CuSO4.5H20)和抗壞血酸鈉，在氮氣保護下進行點擊化學(xué)方法，反應(yīng)結(jié)束后，透析除去銅離子，冷凍干燥得到聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚賴氨酸多嵌段聚合物(mPEG-PCL-G3);將mPEG-PCL-G3與疊氮乙酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加入HOBt和HBTU，再加入三乙胺，室溫反應(yīng)得到mPEG-PCL-G3-N3 ；將mPEG-PCL_G3-N3和G3溶解于N，N-二甲基甲酰胺，加入五水硫酸銅和抗壞血酸鈉，室溫反應(yīng)得mPEG-PCL-G3-(G3 )n;
[0012](2)將制得mPEG-PCL-G3- (G3) n配成水溶液，冰浴加入疏水抗癌藥物的丙酮溶液，攪拌室溫反應(yīng)，透析冷凍干燥得mPEG-PCL-G3-(G3 )n/抗癌藥物復(fù)合物；
[0013](3)將InPEG-PCL-G3-(G3)n/抗癌藥物復(fù)合物配成水溶液，經(jīng)過濾滅菌后，按N/P值(2-80):1與核酸溶液混合，室溫條件下靜置，得到!1^6-?0^3-(63)11/抗癌藥物/核酸復(fù)合物溶液；
[0014](4)向步驟⑶所得的HiPEG-PCL-G3-(G3)n/抗癌藥物/核酸復(fù)合物溶液中加入α-環(huán)糊精溶液，攪拌混合均勻，室溫條件下靜置，得到所述超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料。
[0015]所述的η表示樹枝狀聚賴氨酸G3的接枝數(shù)量，優(yōu)選地，η為3?8的整數(shù)。
[0016]優(yōu)選地，步驟a所述合成Gl過程中Boc保護的賴氨酸Lys(b0C)2與炔丙胺的摩爾比為1: (I?1.5)，所述HOBt與HBTU的摩爾比為1: (I?2);所述合成G2過程中Gl與Lys(boc)2的摩爾比為1: (1.8?2.5)，所述Lys(b0C)2與三乙胺的摩爾比為1: (2?3);所述G3合成過程中G2與Lys(boc)2的摩爾比為1: (4?5)，所述Lys(boc)2與三乙胺的摩爾比為1: (2?3);所述合成Gl、G2和G3過程中的反應(yīng)時間為24?36小時。
[0017]優(yōu)選地，步驟b所述聚乙二醇分子量為2000?5000，所述ε-己內(nèi)酯的分子量為1000
[0018]優(yōu)選地，步驟c所述聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物溶解于Ν，Ν_二甲基甲酰胺形成質(zhì)量體積比濃度為I?10g/mL;所述聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物與疊氮乙酸的摩爾比為I: (5?10)，所述二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的摩爾比為(I?2):1;所述mPEG-PCL-N3與G3的摩爾比為1: (I?1.5);所述G3與五水硫酸銅的摩爾比為1: (I?2)，所述五水硫酸銅與抗壞血酸鈉的摩爾比為1: (I?4);所述mPEG-PCL-G3與疊氮乙酸的摩爾比為1: (20?25)，所述疊氮乙酸與三乙胺的摩爾比為1:1;所述mPEG-PCL-G3-N3與G3摩爾比為1: (9?10)。
[0019]優(yōu)選地，步驟⑵中所述mPEG-PCL-G3- (G3) n配成水溶液的質(zhì)量體積溶度為I?1 %g/mL；所述疏水抗癌藥物的丙酮溶液的質(zhì)量體積比濃度為I?I Omg/ mL。
[0020]所述的疏水抗癌藥物優(yōu)選為多西紫杉醇(DTX);所述核酸是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)。
[0021]優(yōu)選地，步驟(3)中所述靜置的時間為15?30分鐘;步驟(4)中所述靜置的時間為6?12小時。
[0022]優(yōu)選地，步驟(4)中所述的α-環(huán)糊精溶液是指質(zhì)量濃度為15?20的水溶液或磷酸鹽緩沖溶液。
[0023]—種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料，通過上述方法制備得到。
[0024]本發(fā)明的原理是:聚乙二醇是親水性高分子聚合物，具有良好的生物兼容性;而聚己內(nèi)酯是疏水性聚合物，與聚乙二醇形成兩親性嵌段聚合物，親水部分增加水溶性，疏水性部分能夠通過疏水相互作用結(jié)合疏水性藥物;樹枝狀聚賴氨酸能夠與DNA通過靜電相互作用結(jié)合;本發(fā)明首先利用開環(huán)聚合及點擊化學(xué)合成出聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段共聚物，此聚合物通過與藥物疏水相互作用及與DNA的靜電相互作用，在溶劑中形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物;然后再通過HiPEG-PCL-G3-(G3)n*聚物與α-環(huán)糊精的主客體組裝相互作用，進一步得到了原位包埋藥物和基因的超分子結(jié)構(gòu)水凝膠，聚合物在凝膠體系中起著藥物基因負載和作為凝膠基質(zhì)的雙重作用。水凝膠形成的主要作用力為環(huán)糊精組裝之后的結(jié)晶作用和聚己內(nèi)酯鏈段的疏水作用力。
[0025]本發(fā)明的制備方法及所得到的產(chǎn)物具有如下優(yōu)點及有益效果:
[0026](I)本發(fā)明的制備方法方便快捷，可在室溫下成型，條件溫和，對濃度及溫度要求較低；
[0027](2)本發(fā)明制備方法中，凝膠的形成過程不存在化學(xué)反應(yīng)，有效地避免了化學(xué)反應(yīng)及反應(yīng)副產(chǎn)物對藥物及核酸活性的影響；
[0028](3)本發(fā)明凝膠的強度和凝膠化時間可通過聚合物濃度、環(huán)糊精濃度來調(diào)控，隨著聚合物或者環(huán)糊精濃度的增加，凝膠的彈性模量增加，凝膠化時間縮短；
[0029](4)本發(fā)明聚合物在體系中起著藥物基因載體和凝膠基質(zhì)的雙重作用，可簡化凝膠配方，節(jié)省成本；
[0030](5)本發(fā)明所得材料物理凝膠隨著生物體中液體介質(zhì)的不斷沖刷溶蝕，會逐漸松散直至完全溶解，可以達到對藥物和核酸的100 %的釋放率；
[0031](6)本發(fā)明所得材料中作為凝膠基質(zhì)的mPEG-PCL-G3-(G3 )?聚合物與疏水藥物存在疏水相互作用，有利于凝膠對疏水藥物的控釋進行調(diào)節(jié)；
[0032 ] (7)本發(fā)明所得材料中作為凝膠基質(zhì)的mPEG-PCL-G3- (G3) n聚合物與核酸存在靜電作用，有利于凝膠對核酸的控釋進行調(diào)節(jié)；
[0033](8)本發(fā)明所得超分子水凝膠存在溫度敏感性，在32°C左右(體溫以下)實現(xiàn)模量突變，有利于其作為可注射藥物基因載體。
[0034](9)本發(fā)明所得水凝膠成分簡單，生物兼容性好，能成功負載疏水抗癌藥，基因轉(zhuǎn)染效果明顯，具備良好的剪切變稀的特性，應(yīng)用方便快捷，有望作為可注射的藥物基因載體廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0035]圖1為實施例1所得中間產(chǎn)物及聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段聚合物的紅外光譜譜圖；
[0036]圖2為實施例1、實施例2所得超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料以及DNA進行DNA凝膠電泳迀移實驗結(jié)果圖；其中I為DNA，2為實施例1所得水凝膠載體材料，3為實施例1所得水凝膠載體材料；
[0037]圖3為實施例1所得超分子水凝膠藥物基因雙重載體材料E中藥物(DTX)和基因(DNA)隨時間變化釋放圖；
[0038]圖4為實施例1所得超分子水凝膠藥物基因雙重載體材料E在第24小時的釋放液實施轉(zhuǎn)染后的細胞的熒光照片圖。
【具體實施方式】
[0039]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0040]實施例1
[0041](I)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸(HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8)多嵌段聚合物的合成:
[0042]a、將雙Boc(N，N’_二叔丁氧羰基)保護的賴氨酸Lys(boC)2溶解于N，N_ 二甲基甲酰胺中，加入炔丙胺;Boc保護的賴氨酸Lys(boc)2與炔丙胺的摩爾比為1:1.2;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入1-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，所述1-羥基苯并三唑(HOBt)與苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的比為1:1;室溫反24小時后，將該混合體系用200毫升乙酸乙酯稀釋，然后依次用飽和碳酸氫鈉、硫酸氫鈉、碳酸氫鈉和氯化鈉洗滌;所述碳酸氫鈉的用量為每100暈升有機相中加入I克;所述硫酸氫鈉的用量為每100暈升有機相中加入0.1克;所述氯化鈉的用量為每100毫升有機相中加入0.1克;所得有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，然后在流動相氯仿與甲醇條件下過柱分離;所用氯仿與甲醇的體積比為5:1;得到Boc保護的第一代Gl(boc)2，；將Gl(boc)2溶解于二氯甲烷中，在冰水浴條件下加入三氟乙酸，所述二氯甲烷與三氟乙酸的體積比為3: 2;混合物在室溫條件下攪拌，然后將溶劑除去得到Gl;向所得產(chǎn)物Gl中加入Lys(boc)2和N，N-二甲基甲酰胺，并加入三乙胺;所述Gl與Lys(boc)2的摩爾比為1:2.2;所述Lys(boC)2與三乙胺的摩爾比為1.1:3;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入等摩爾比的1-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，在室溫條件下反應(yīng)24小時；反應(yīng)結(jié)束后，將該體系用200毫升乙酸乙酯稀釋，然后在流動相氯仿與甲醇的條件下過柱分離，所用氯仿與甲醇的體積比為12:1;得到此(3保護的第二代62(130(3)2;將62(130(3)2溶解于二氯甲烷中，在冰水浴條件下加入三氟乙酸，混合物在室溫條件下攪拌，然后將溶劑除去得G2;向所得產(chǎn)物中加入Lys(b0C)2和N，N-二甲基甲酰胺，并加入三乙胺;所述G2與Lys(boc)2的摩爾比為1:4.4;所述1^8(130(3)2與三乙胺的摩爾比為1.1:3;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入等摩爾比的1-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室溫條件下反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后，將該混合體系用200毫升乙酸乙酯稀釋，然后依次用飽和碳酸氫鈉、硫酸氫鈉、飽和碳酸氫鈉和氯化鈉洗滌;所得有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，然后在流動相氯仿與甲醇的條件下過柱分離，所述氯仿與甲醇的體積比為18:1;得到Boc保護的第三代G3(boc)2，脫除Boc保護基團后得到G3;
[0043]b、將聚乙二醇(分子量為2000)與ε-己內(nèi)酯(分子量為1000)在氮氣保護下，所述聚乙二醇與ε-己內(nèi)酯質(zhì)量比為2:1，加入幾滴辛酸亞錫做反應(yīng)催化劑，通入氮氣做保護10分鐘，5分鐘后加熱至50 °C，抽真空10分鐘同時加熱至70°C轉(zhuǎn)通入氮氣10分鐘，并將磁力攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘調(diào)到250轉(zhuǎn)/分鐘;最后加熱至120 °C繼續(xù)反應(yīng)12小時;反應(yīng)結(jié)束后，加入二氯甲烷，所得溶液滴入冰正己烷中，繼續(xù)攪拌I小時，低溫沉淀，用正己烷洗滌，沉淀，棄上清，40°C真空干燥，溶于水，取上清凍干得聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物(mPEG-PCL);
[0044]c、將聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物溶解于30毫升N，N_二甲基甲酰胺，形成反應(yīng)介質(zhì)，加入疊氮乙酸，二環(huán)己基碳二亞胺作為失水劑，4-二甲氨基吡啶作為催化劑，室溫反應(yīng)得mPEG-PCL-N3;所述聚乙二醇-聚己內(nèi)酯聚合物與疊氮乙酸的摩爾比為1:6;二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的摩爾比為2:l;mPEG-PCL-N3與G3溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，通過點擊化學(xué)方法，依次加入已溶解的五水硫酸銅(CuSO4.5H20)和抗壞血酸鈉，所述mPEG-PCL-N3與G3的摩爾比為1: 1.2;所述五水硫酸銅與抗壞血酸鈉的摩爾比為1:4，在氮氣保護下反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后，透析出去銅離子，冷凍干燥得mPEG-PCL-G3 ；將mPEG-PCL_G3與疊氮乙酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加入1-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，再加入三乙胺，所述mPEG-PCL-G3與疊氮乙酸的摩爾比為1:24；所述mPEG-PCL-G3與三乙胺的摩爾比為1:24；室溫反應(yīng)48小時得mPEG-PCL_G3-N3；將摩爾比為1:9.6的mPEG-PCL-G3-N3和G3溶解于N，N-二甲基甲酰胺，加入已溶解的摩爾比為1:4的五水硫酸銅和抗壞血酸鈉，室溫反應(yīng)48小時得mPEG-PCL-G3-(G3)3?8嵌段聚合物A;(其中(G3) 3?8表示所得產(chǎn)物中G3的接枝數(shù)為3?8)
[0045]將本實施例得到的中間產(chǎn)物及聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段聚合物(mPEG-PCL-G3-(G3)n，n = 3?8)溶于重水中進行傅里葉紅外光譜表征，結(jié)果如圖1所示(圖中 a，mPEG-PCL ； b，mPEG_PCL-N3 ； c，mPEG-PCL_G3 ； d，mPEG-PCL-G3-N3 ； e，mPEG_PCL-G3-(G3)n)，化學(xué)位移出現(xiàn)在2100處的峰的變化說明對應(yīng)的點擊反應(yīng)疊氮的峰，說明成功的合成過程。
[0046]所述疊氮乙酸按以下步驟制備得到:溴代乙酸甲酯的DMSO溶液加入疊氮化鈉水溶液在氮氣保護下65°C反應(yīng)24小時；加入200毫升乙醚，依次用水、氯化鈉、水洗滌后旋蒸；加入氫氧化鈉溶液(質(zhì)量體積比濃度為0.1克/毫升)室溫反應(yīng)3小時后，加入無水硫酸鈉，離心取上清;后處理用濃鹽酸調(diào)溶液PH值至O;分三次加入500毫升乙醚萃取，冰水洗滌兩次后旋蒸;再加入無水硫酸鈉磁力攪拌48小時，離心取上清得疊氮乙酸；
[0047](2)在室溫25°C下，將步驟(I)得到的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段聚合物A配制成ImL質(zhì)量體積百分濃度為l%(w/v)的水溶液，冰浴條件下向其中加入濃度為2mg/ml的多西紫杉醇(DTX)丙酮溶液，37°(:磁力攪拌24小時;反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量500透析袋透析三天后過濾，冷凍干燥得mPEG-PCL-G3-(G3)3?s/DTX復(fù)合物B;將得到的mPEG-PCL-G3-(G3 )3?s/DTX的聚合物/藥物復(fù)合物溶溶于甲醇中，通過高效液相色譜法(HPLC)測定11^6-?0^3-(63)3?8載藥量，通過藥物濃度與峰面積做線性回歸，得出其載藥量為1.717微克/暈升；
[0048](3)將步驟(I)得到的HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾除菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置15分鐘，得到mPEG-PCL-G3-(G3)3?s/DNA的聚合物/核酸復(fù)合物溶液C;將步驟(2)中的mPEG-PCL-G3-(G3)3?8/DTX復(fù)合物B溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾滅菌后，按Ν/Ρ值2:l-80:l與DNA溶液混合，室溫條件下靜置;得到的mPEG-PCL-G3-(G3)3?8/DTX/DNA的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液D;
[0049](4)向步驟(3)所得的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液D中加入1.0mL質(zhì)量百分濃度為15%的α-環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置6小時，得到超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料E。
[0050]實施例2
[0051](I)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸(HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8)多嵌段聚合物的合成:
[0052]a、將雙Boc(N，N’_二叔丁氧羰基)保護的賴氨酸Lys(boC)2溶解于Ν，Ν_ 二甲基甲酰胺中，加入炔丙胺;Boc保護的賴氨酸Lys(boc)2與炔丙胺的摩爾比為1:1.2;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入1-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，所述1-羥基苯并三唑(HOBt)與苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的比為1:1;室溫反48小時后，將該混合體系用200毫升乙酸乙酯稀釋，然后依次用飽和碳酸氫鈉、硫酸氫鈉、碳酸氫鈉和氯化鈉洗滌;所述碳酸氫鈉的用量為每100暈升有機相中加入I克;所述硫酸氫鈉的用量為每100暈升有機相中加入0.1克;所述氯化鈉的用量為每100毫升有機相中加入0.1克;所得有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，然后在流動相氯仿與甲醇條件下過柱分離;所用氯仿與甲醇的體積比為5:1;得到Boc保護的第一代Gl(boc)2,;將Gl(boc)2溶解于二氯甲烷中，在冰水浴條件下加入三氟乙酸，所述二氯甲烷與三氟乙酸的體積比為I: I;混合物在室溫條件下攪拌，然后將溶劑除去得到Gl;向所得產(chǎn)物Gl中加入Lys(boc)2和N，N-二甲基甲酰胺，并加入三乙胺;所述Gl與Lys(boc)2的摩爾比為1:2.2;所述Lys(boC)2與三乙胺的摩爾比為1.1:3;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入等摩爾比的1-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，在室溫條件下反應(yīng)24小時；反應(yīng)結(jié)束后，將該體系用200毫升乙酸乙酯稀釋，然后在流動相氯仿與甲醇的條件下過柱分離，所用氯仿與甲醇的體積比為12:1;得到此(3保護的第二代62(130(3)2;將62(130(3)2溶解于二氯甲烷中，在冰水浴條件下加入三氟乙酸，混合物在室溫條件下攪拌，然后將溶劑除去得G2;向所得產(chǎn)物中加入Lys(b0C)2和N，N-二甲基甲酰胺，并加入三乙胺;所述G2與Lys(boc)2的摩爾比為1:4.4;所述1^8(130(3)2與三乙胺的摩爾比為1.1:3;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入等摩爾比的1-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，室溫條件下反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后，將該混合體系用200毫升乙酸乙酯稀釋，然后依次用飽和碳酸氫鈉、硫酸氫鈉、飽和碳酸氫鈉和氯化鈉洗滌;所得有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，然后在流動相氯仿與甲醇的條件下過柱分離，所述氯仿與甲醇的體積比為18:1;得到Boc保護的第三代G3(boc)2，脫除Boc保護基團后得到G3;
[0053]b、將聚乙二醇(分子量為2000)與ε-己內(nèi)酯(分子量為1000)在氮氣保護下，所述聚乙二醇與ε-己內(nèi)酯質(zhì)量比為2:1，加入幾滴辛酸亞錫做反應(yīng)催化劑，通入氮氣做保護10分鐘，5分鐘后加熱至50 °C，抽真空10分鐘同時加熱至70°C轉(zhuǎn)通入氮氣10分鐘，并將磁力攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘調(diào)到250轉(zhuǎn)/分鐘;最后加熱至120 °C繼續(xù)反應(yīng)12小時;反應(yīng)結(jié)束后，加入二氯甲烷，所得溶液滴入冰正己烷中，繼續(xù)攪拌I小時，低溫沉淀，用正己烷洗滌，沉淀，棄上清，40°C真空干燥，溶于水，取上清凍干得聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物；
[0054]C、將聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物溶解于30毫升N，N_二甲基甲酰胺，形成反應(yīng)介質(zhì)，加入疊氮乙酸，二環(huán)己基碳二亞胺作為失水劑，4-二甲氨基吡啶作為催化劑，室溫反應(yīng)得mPEG-PCL-N3;所述聚乙二醇-聚己內(nèi)酯聚合物與疊氮乙酸的摩爾比為1:6;二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的摩爾比為2:l;mPEG-PCL-N3與G3溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，通過點擊化學(xué)方法，依次加入已溶解的五水硫酸銅(CuSO4.5H20)和抗壞血酸鈉，所述mPEG-PCL-N3與G3的摩爾比為1: 1.2;所述五水硫酸銅與抗壞血酸鈉的摩爾比為1:4，在氮氣保護下反應(yīng)48小時。反應(yīng)結(jié)束后，透析出去銅離子，冷凍干燥得mPEG-PCL-G3 ；將mPEG-PCL_G3與疊氮乙酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加入1-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，再加入三乙胺，所述mPEG-PCL-G3與疊氮乙酸的摩爾比為1:24；所述mPEG-PCL-G3與三乙胺的摩爾比為1:24；室溫反應(yīng)48小時得mPEG-PCL_G3-N3；將摩爾比為1:9.6的mPEG-PCL-G3-N3和G3溶解于N，N-二甲基甲酰胺，加入已溶解的摩爾比為1:4的五水硫酸銅和抗壞血酸鈉，室溫反應(yīng)48小時得mPEG-PCL-G3-(G3 )3?8嵌段聚合物；
[0055]步驟(2)?(4)的制備方法同實施例1，得到超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料。
[0056]實施例3
[0057](I)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸(HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8)多嵌段聚合物的合成同實施例1
[0058](2)在室溫25°C下，將步驟(I)得到的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段聚合物A配制成ImL質(zhì)量體積百分濃度為10% (w/v)的水溶液，冰浴條件下向其中加入濃度為2mg/ml的多西紫杉醇丙酮溶液，37°C磁力攪拌36小時；反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量500透析袋透析三天后過濾，冷凍干燥得mPEG-PCL-G3-(G3)3?s/DTX復(fù)合物；
[0059](3)將步驟(I)得到的HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾除菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置20分鐘，得到mPEG-PCL-G3-(G3) 3?8/DNA的聚合物/核酸復(fù)合物溶液;將步驟(2)中mPEG-PCL_G3-(G3)3?8/DTX復(fù)合物溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾滅菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置;得到的mPEG-PCL-G3-(G3)3?8/DTX/DNA的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液；
[0060](4)向步驟(3)所得的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液中加入1.0mL質(zhì)量百分濃度為15%的α-環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置6小時，得到超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料。
[0061 ] 實施例4
[0062](I)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸(HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8)多嵌段聚合物的合成同實施例1
[0063](2)在室溫25°C下，將步驟(I)得到的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段聚合物A配制成ImL質(zhì)量體積百分濃度為l%(w/v)的水溶液，冰浴條件下向其中加入濃度為2mg/ml的多西紫杉醇丙酮溶液，37°C磁力攪拌24小時；反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量500透析袋透析三天后過濾，冷凍干燥得mPEG-PCL-G3-(G3)3?s/DTX復(fù)合物；
[0064](3)將步驟(I)得到的HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾除菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置20分鐘，得到mPEG-PCL-G3-(G3) 3?8/DNA的聚合物/核酸復(fù)合物溶液;將步驟(2)中mPEG-PCL_G3-(G3)3?8/DTX復(fù)合物溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾滅菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置;得到的mPEG-PCL-G3-(G3)3?8/DTX/DNA的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液；
[0065](4)向步驟(3)所得的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液中加入1.0mL質(zhì)量百分濃度為20%的α-環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置12小時，得到超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料。
[0066]實施例5
[0067](I)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸(HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8)多嵌段聚合物的合成同實施例1
[0068](2)在室溫25°C下，將步驟(I)得到的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段聚合物A配制成ImL質(zhì)量體積百分濃度為10% (w/v)的水溶液，冰浴條件下向其中加入濃度為2mg/ml的多西紫杉醇丙酮溶液，37°C磁力攪拌36小時；反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量500透析袋透析三天后過濾，冷凍干燥得mPEG-PCL-G3-(G3)3?s/DTX復(fù)合物；
[0069](3)將步驟(I)得到的HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾除菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置15分鐘，得到mPEG-PCL-G3-(G3) 3?8/DNA的聚合物/核酸復(fù)合物溶液;將步驟(2)中mPEG-PCL_G3-(G3)3?8/DTX復(fù)合物溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾滅菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置;得到的mPEG-PCL-G3-(G3)3?8/DTX/DNA的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液；
[0070](4)向步驟(3)所得的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液中加入1.0mL質(zhì)量百分濃度為20%的α-環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置6小時，得到超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料。
[0071 ] 實施例6
[0072](I)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸(HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8)多嵌段聚合物的合成同實施例1
[0073](2)在室溫25°C下，將步驟(I)得到的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段聚合物A配制成ImL質(zhì)量體積百分濃度為l%(w/v)的水溶液，冰浴條件下向其中加入濃度為2mg/ml的多西紫杉醇丙酮溶液，40°C磁力攪拌24小時；反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量500透析袋透析三天后過濾，冷凍干燥得mPEG-PCL-G3-(G3)3?s/DTX復(fù)合物；
[0074](3)將步驟(I)得到的mPEG-PCL-G3-(G3)3?8溶解于純水中配制成10毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾除菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置15分鐘，得到mPEG-PCL-G3-(G3) 3?8/DNA的聚合物/核酸復(fù)合物溶液;將步驟(2)中mPEG-PCL_G3-(G3)3?8/DTX復(fù)合物溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾滅菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置;得到的mPEG-PCL-G3-(G3)3?8/DTX/DNA的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液；
[0075](4)向步驟(3)所得的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液中加入1.0mL質(zhì)量百分濃度為20%的α-環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置12小時，得到超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料。
[0076]實施例7
[0077](I)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸(HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8)多嵌段聚合物的合成同實施例1
[0078](2)在室溫35°C下，將步驟(I)得到的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段聚合物A配制成ImL質(zhì)量體積百分濃度為10% (w/v)的水溶液，冰浴條件下向其中加入濃度為2mg/ml的多西紫杉醇丙酮溶液，40°C磁力攪拌36小時；反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量500透析袋透析三天后過濾，冷凍干燥得mPEG-PCL-G3-(G3)3?s/DTX復(fù)合物；
[0079](3)將步驟(I)得到的HiPEG-PCL-G3-(G3)3?8溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾除菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置15分鐘，得到mPEG-PCL-G3-(G3) 3?8/DNA的聚合物/核酸復(fù)合物溶液;將步驟(2)中mPEG-PCL_G3-(G3)3?8/DTX復(fù)合物溶解于純水中配制成I毫克/毫升的溶液，經(jīng)0.2μπι的過濾頭過濾滅菌后，按Ν/Ρ值2:1-80:1與DNA溶液混合，室溫條件下靜置;得到的mPEG-PCL-G3-(G3)3?8/DTX/DNA的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液；
[0080](4)向步驟(3)所得的聚合物/藥物/核酸復(fù)合物溶液中加入1.0mL質(zhì)量百分濃度為15%的α-環(huán)糊精水溶液，攪拌混合均勻，室溫下靜置12小時，得到超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料。
[0081]性能測試:
[0082](I)實施例1所得超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料E進行流變表征，跟蹤其模量隨溫度的變化曲線，并與步驟(I)得到的多嵌段聚合物A的質(zhì)量百分濃度為12%的水溶液相對比。結(jié)果顯示質(zhì)量百分濃度為12%的多嵌段聚合物A水溶液在43°C左右才開始出現(xiàn)相轉(zhuǎn)變，而且體系的模量很小，不足以達到凝膠敷料的力學(xué)強度。而組裝成凝膠之后的超分子水凝膠基因載體材料E的相轉(zhuǎn)變溫度約為32°C，而且模量顯著提高，有利于其作為可注射藥物基因載體得到應(yīng)用。
[0083](2)將實施例1(圖中編號2)、實施例2(圖中編號3)所得超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料以及DNA(圖中編號I)進行DNA凝膠電泳迀移實驗，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，在實驗條件的濃度范圍內(nèi)，本發(fā)明的水凝膠載體材料都能與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，DNA不會從電場中迀出(見圖2中的2、3);而DNA則在電場作用下迀出(見圖2中的I)。
[0084](3)將實施例1所得超分子水凝膠藥物基因雙重載體材料E在磷酸鹽緩沖溶液PBS環(huán)境下進行體外釋放實驗，其在第12、24和48小時釋放出的聚合物/藥物/基因復(fù)合物的粒徑分別為181.911111、188.211111和177.2111110
[0085](4)取200微升實施例1所得超分子水凝膠藥物基因雙重載體材料E置于樣品瓶中，向樣品瓶中加入800微升磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，將其置于37°C的水浴中進行體外釋放實驗。每隔一段時間，從上層清液中小心取出500微升釋放液，然后將新鮮的500微升磷酸鹽緩沖液補加到燒杯中。取出的釋放液用200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心分離，除去釋放液中的懸浮物。多西紫杉醇(DTX)藥物的含量通過紫外-可見分光光度計測得，DNA的含量通過酶聯(lián)免疫吸附試驗測定(ELISA試劑盒)，釋放結(jié)果如圖3所示。
[0086](5)將實施例1所得的超分子水凝膠藥物基因雙重載體材料E在磷酸鹽緩沖溶液PBS環(huán)境下進行體外釋放實驗，釋放出的聚合物/DNA復(fù)合物定量后用于對乳腺癌細胞(MCF-7)的轉(zhuǎn)染實驗，超分子水凝膠基因雙重載體材料E在第24小時的釋放液實施轉(zhuǎn)染后的細胞的熒光照片如圖4所示。陽性對照組PEI/DNA表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率，達到約46%;而陰性對照裸DNA的轉(zhuǎn)染效率近乎為0%;超分子水凝膠基因載體材料E在第12、24和48小時釋放出的聚合物/pEGFP復(fù)合物樣品的轉(zhuǎn)染效率分別為12 %、18 %和14%，表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)染效果。通過與新制備的聚合物/DNA復(fù)合物膠束的轉(zhuǎn)染效率(18%)比較，可以確定在凝膠的制備、保存以及釋放過程中，凝膠以及聚合物對PEGFP的活性起到了良好的保護作用，DNA結(jié)構(gòu)的完整性和膠體穩(wěn)定性得到了較好地保持。
[0087]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，其特征在于包括如下制備步驟: (1)聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-樹枝狀聚賴氨酸多嵌段聚合物的合成: a、將雙Boc保護的賴氨酸Lys(boc)2溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加入炔丙胺;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入HOBt和HBTU，室溫反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到Boc保護的第一代Gl(boc)2，；將61(130(:)2脫除80(3保護基團得到G1，然后加入Lys(boC)2和N，N-二甲基甲酰胺，并加入三乙胺；將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入HOBt和HBTU，在室溫條件下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到Boc保護的第二代G2(boc)2;將G2(boc)2脫除Boc保護基團得到G2，然后加入Lys(boC)2和N，N-二甲基甲酰胺，并加入三乙胺;將體系置于冰水浴中并同時通入氮氣保護;然后向體系中加入HOBt和HBTU，室溫條件下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到Boc保護的第三代G3(boc)2，脫除Boc保護基團后得到G3; b、將聚乙二醇與ε-己內(nèi)酯在氮氣保護下，于50?120°C溫度下進行反應(yīng)，辛酸亞錫做反應(yīng)催化劑，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物； c、將聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物溶解于N，N-二甲基甲酰胺，形成反應(yīng)介質(zhì)，加入疊氮乙酸，二環(huán)己基碳二亞胺作為失水劑，4-二甲氨基吡啶作為催化劑，室溫反應(yīng)得mPEG-PCL-N3 ；將mPEG-PCL-N3與G3溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，然后依次加入已溶解的五水硫酸銅和抗壞血酸鈉，在氮氣保護下進行點擊化學(xué)方法，反應(yīng)結(jié)束后，透析除去銅離子，冷凍干燥得到聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚賴氨酸多嵌段聚合物mPEG-PCL-G3;將HiPEG-PCL-G3與疊氮乙酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加入HOBt和HBTU，再加入三乙胺，室溫反應(yīng)得到mPEG-PCL-G3-N3 ；將mPEG-PCL-G3-N3和G3溶解于N，N-二甲基甲酰胺，加入五水硫酸銅和抗壞血酸鈉，室溫反應(yīng)得 mPEG-PCL-G3-(G3 )n; (2)將制得mPEG-PCL-G3-(G3) n配成水溶液，冰浴加入疏水抗癌藥物的丙酮溶液，攪拌室溫反應(yīng)，透析冷凍干燥得mPEG-PCL-G3-(G3 )n/抗癌藥物復(fù)合物； (3)將mPEG-PCL-G3-(G3)n/抗癌藥物復(fù)合物配成水溶液，經(jīng)過濾滅菌后，按N/P值(2-80):1與核酸溶液混合，室溫條件下靜置，得到mPEG-PCL-G3-(G3)n/^t癌藥物/核酸復(fù)合物溶液； (4)向步驟(3)所得的mPEG-PCL-G3-(G3) n/抗癌藥物/核酸復(fù)合物溶液中加入α-環(huán)糊精溶液，攪拌混合均勻，室溫條件下靜置，得到所述超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，其特征在于:所述η為3?8的整數(shù)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，其特征在于:步驟a所述合成Gl過程中Boc保護的賴氨酸Lys(boC)2與炔丙胺的摩爾比為1: (I?1.5)，所述HOBt與HBTU的摩爾比為1: (I?2);所述合成G2過程中Gl與Lys(boc)2的摩爾比為1: (1.8?2.5)，所述Lys(boc)2與三乙胺的摩爾比為1: (2?3);所述G3合成過程中G2與1^8(1300)2的摩爾比為1: (4?5)，所述Lys(boc)2與三乙胺的摩爾比為1: (2?3);所述合成Gl、G2和G3過程中的反應(yīng)時間為24?36小時。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，其特征在于:步驟b所述聚乙二醇分子量為2000?5000，所述ε-己內(nèi)酯的分子量為1000。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，其特征在于:步驟c所述聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物溶解于N，N-二甲基甲酰胺形成質(zhì)量體積比濃度為I?10g/mL;所述聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段聚合物與疊氮乙酸的摩爾比為1: (5?10)，所述二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的摩爾比為(I?2):1;所述mPEG-PCL-N3與G3的摩爾比為1: (I?1.5);所述G3與五水硫酸銅的摩爾比為1: (I?2)，所述五水硫酸銅與抗壞血酸鈉的摩爾比為1: (I?4);所述mPEG-PCL-G3與疊氮乙酸的摩爾比為1: (20?25)，所述疊氮乙酸與三乙胺的摩爾比為I: I;所述mPEG-PCL-G3-N3與G3摩爾比為1: (9?10)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，其特征在于:步驟⑵中所述mPEG-PCL-G3-(G3 )?配成水溶液的質(zhì)量體積溶度為I?1 % g/mL;所述疏水抗癌藥物的丙酮溶液的質(zhì)量體積比濃度為I?10mg/mL。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，其特征在于:所述的疏水抗癌藥物是指為多西紫杉醇;所述核酸是指核糖核酸或脫氧核糖核酸。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述靜置的時間為15?30分鐘;步驟(4)中所述靜置的時間為6?12小時。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料的制備方法，其特征在于:步驟(4)中所述的α-環(huán)糊精溶液是指質(zhì)量濃度為15?20的水溶液或磷酸鹽緩沖溶液。10.一種超分子水凝膠藥物與基因雙重載體材料，其特征在于:通過權(quán)利要求1?9任一項所述的方法制備得到。
【文檔編號】A61K48/00GK105920614SQ201610471978
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】譚紹早, 楊雨萌, 胡家彩
【申請人】佛山市高明綠化納新材料有限公司