用于抑制/瓦解生物被膜的抑制劑及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于抑制/瓦解生物被膜的抑制劑及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了PslG蛋白及其編碼序列在抑制/瓦解生物被膜方面的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了含有所述的PslG蛋白作為抑制/瓦解生物被膜的活性成分的組合物和制品。實(shí)驗(yàn)表明，PslG蛋白可有效抑制和/或瓦解假單胞菌的生物被膜，因而在醫(yī)藥與環(huán)境保護(hù)方面等多方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
用于抑制/瓦解生物被膜的抑制劑及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物的生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種蛋白在抑制、瓦解或 降解微生物的生物被膜（biofilm)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] "生物被膜"（biofilm) -般是指微生物依附某載體形成的膜性聚合物，是其在自 然界中的一種主要的生存方式。生物被膜中的微生物比單細(xì)胞微生物具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng) 性，它的形成給人類帶來了嚴(yán)重的危害。如在醫(yī)藥領(lǐng)域，據(jù)研究表明，約65%的人類細(xì)菌性 感染疾病與生物被膜有關(guān)，生物被膜中微生物對(duì)抗生素的耐藥性比浮游狀態(tài)時(shí)高成百甚至 上千倍，大大增加了臨床治療的難度。
[0003] 而細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因，除去原菌在抗菌素的脅迫壓力下產(chǎn)生的適應(yīng)性變異之 外，另一方面是因?yàn)樵谡Ｇ闆r下，致病菌會(huì)形成細(xì)菌生物被膜（bacterial biofilm，BF)， 為其提供了保護(hù)屏障。實(shí)為細(xì)菌吸附于惰性物體（如生物醫(yī)學(xué)材料或生物機(jī)體黏膜表面） 后，分泌出的胞外多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白復(fù)合物，使細(xì)菌相互粘連并將自 身菌落聚集纏繞其中形成的膜樣物，使細(xì)菌可以停留在一個(gè)適宜的微環(huán)境中而不會(huì)被沖 散；胞外基質(zhì)還可吸附藥物或影響藥物滲透到細(xì)菌群落中，因而大多數(shù)藥物只能殺滅生物 被膜表面的微生物，而生物被膜內(nèi)部的微生物則是產(chǎn)生變異的主要原因。因而生物被膜的 這種特殊結(jié)構(gòu)可以作為一種屏障保護(hù)細(xì)菌抵御抗菌藥物的殺傷和逃逸宿主免疫系統(tǒng)的清 除，而成為潛在的感染源，導(dǎo)致難治性臨床生物被膜的相關(guān)感染。
[0004] 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA)是一種條件致病菌，其很容易感染 燒傷患者和免疫缺陷病人，也是醫(yī)院內(nèi)感染的典型菌株之一。一旦被該菌感染之后，極易形 成生物被膜，從而造成治療的困難。臨床上，它能引起血病、耳、眼、皮膚及軟組織、骨及關(guān) 節(jié)、心內(nèi)膜和呼吸系統(tǒng)等感染，是人類的三大致病菌之一。它也是引起肺炎的首要致病菌。 由于其具有形成生物被膜等多重耐藥機(jī)制，耐藥率高，經(jīng)常在臨床上引起頑固性、難治性感 染，成為臨床治療的棘手問題。
[0005] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)能夠有效抑制或瓦解銅綠假單胞菌等微生物的生物被 膜的制劑和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供了有效抑制或瓦解銅綠假單胞菌等微生物的生物被膜的制 劑和方法。
[0007] 本發(fā)明的第一方面提供了一種PslG蛋白或其編碼序列的用途，所述PslG蛋白或 其編碼序列用于（i)制備抑制、瓦解或降解生物被膜的制劑；和/或（ii)制備抗菌藥物。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物被膜包括假單胞菌屬生物被膜。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物被膜為銅綠假單胞菌的生物被膜。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的PsIG蛋白為重組蛋白。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的PslG蛋白為分離純化的重組蛋白。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的PslG蛋白為成熟形式的PslG蛋白。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑選自下組：生物被膜清除劑、醫(yī)用導(dǎo)管清潔劑、醫(yī)用插 管清潔劑、醫(yī)用儀器管道清潔劑、醫(yī)用器具消毒劑、人工關(guān)節(jié)清潔劑、抑菌劑、殺菌劑、醫(yī)用 導(dǎo)管護(hù)理劑、醫(yī)用儀器護(hù)理劑、或其組合。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑包括微生物被膜抑制劑。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑包括導(dǎo)管細(xì)菌生物被膜抑制劑、條件性感染相關(guān)微生 物的生物被膜抑制劑。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物被膜位于一種或多種選自下組的物品：醫(yī)藥儀器、導(dǎo) 管、或醫(yī)用器具。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的PslG蛋白選自：
[0018] (i)具有SEQ ID NO. : 2所示氨基酸序列的蛋白；
[0019] (ii)將如SEQ ID NO. :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的、具有對(duì)生物被膜形成產(chǎn)生抑制和/或降解能力的由（i)衍生的蛋白；
[0020] (iii)氨基酸序列與SEQ ID NO. :2所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98%)， 增強(qiáng)蛋白對(duì)生物被膜形成產(chǎn)生抑制或降解能力的蛋白。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的PslG蛋白的編碼序列選自：
[0022] (a)編碼如SEQ ID NO. : 2或所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0023] (b)序列如SEQ ID NO. : 1所示的核苷酸序列；
[0024] (c)核苷酸序列與SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 核苷酸序列；
[0025] (d)如SEQ ID NO. : 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60個(gè)（較 佳地1-30,更佳地1-10個(gè)）核苷酸的核苷酸序列；
[0026] (e)與（a)-(d)任一所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的編碼序列編碼上述選自（i)、（ii)或（iii)的PslG蛋白。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的pslG蛋白或其編碼序列來源于銅綠假單胞菌。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的PslG蛋白是由重組細(xì)胞產(chǎn)生的。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組細(xì)胞包括原核細(xì)胞（如大腸桿菌）或真核細(xì)胞。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述重組細(xì)胞選自：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、 斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri)、焚光假單胞菌（P.fluorescens)、丁香假單胞菌 (Pseudomonas syringae)〇
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的制劑或所述的抗菌藥物用于選自下組的一種或多種用 途：
[0033] (1)抑制假單胞菌生物被膜的形成；
[0034] (2)瓦解和/或降解假單胞菌已經(jīng)形成的生物被膜；
[0035] (3)抑制假單胞菌的生長。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的假單胞菌為假單胞屬（Pseudomonas)微生物。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的假單胞菌選自下組：銅綠假單胞菌、斯氏假單胞菌、熒光 假單胞菌、丁香假單胞菌、或其組合。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述假單胞菌為銅綠假單胞菌。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的制劑或藥物被施用于人或動(dòng)物的傷口或創(chuàng)面。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的施用為體表施用。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述施用的濃度為5-100nM，較佳地10-50nM ;或者所述施用的 劑量為〇· OOOl-lOg，較佳地為〇· 〇〇l-lg。
[0042] 在另一優(yōu)選中，所述的施用方式包括：涂抹、涂覆、噴灑傷口，使用含有效濃度或數(shù) 量的PslG的包扎材料對(duì)傷口進(jìn)行包扎。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的傷口或創(chuàng)面包括燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)、插管等引起的創(chuàng)面和/ 或傷口，尤其適用于施用于易受微生物（尤其是假單胞菌屬、更尤其是銅綠假單胞菌）的感 染和/或表面或內(nèi)部易形成生物被膜（尤其是假單胞菌屬、更尤其是銅綠假單胞菌生物被 膜）的創(chuàng)面和/或傷口。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的制品或藥物的劑型為固體劑型、液體劑型或半固體劑型。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的制品或藥物的劑型選自下組：洗劑、粉劑、膏劑、汀劑、涂 覆料、成膜粘合劑。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑或藥物為液體。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑或藥物為粉劑。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的制劑或藥物還含有抗生素。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗生素選自下組：阿奇霉素、弗洛沙星、環(huán)丙沙星、妥布霉 素、或其組合。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述的制劑為外用制劑，并且還含有選自下組的一種或多種任 選成分：表面活性劑、芳香劑、消毒劑。
[0051] 本發(fā)明第二方面提供了一種生物被膜抑制劑，包括：
[0052] (a)抑制有效量的PslG蛋白、其活性片段和/或其激動(dòng)劑；
[0053] (b)載體；
[0054] (C)任選的助劑。
[0055] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體為溶劑（如水）
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括藥學(xué)上可接受的載體。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述的助劑選自下組：表面活性劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑、或其組 合。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述抑制劑還包括抗生素。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗生素選自下組：阿奇霉素、弗洛沙星、環(huán)丙沙星、妥布霉 素、或其組合。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑用于抑制假單胞菌的生物被膜。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑用于治療或輔助治療與假單胞菌感染相關(guān)的疾 病。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑用于非治療性的、殺滅或輔助殺滅環(huán)境中假單胞 菌。
[0063] 本發(fā)明第三方面提供了一種用于抑制生物被膜的藥物組合物，包括：
[0064] (a)安全有效量的PslG蛋白、其活性片段和/或其激動(dòng)劑；
[0065] (b)藥學(xué)上可接受的載體。
[0066] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物中，PslG蛋白或其活性片段的含量為 0· 0001-99wt%，較佳地為(λ 001-90wt%，更佳地(λ 01-50wt%，按組合物的總重量計(jì)。
[0067] 在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物還包括抗生素。
[0068] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗生素選自下組：阿奇霉素、弗洛沙星、環(huán)丙沙星、妥布霉 素、或其組合。
[0069] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物用于抑制假單胞菌的生物被膜。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物用于治療或輔助治療與假單胞菌感染相關(guān)的疾病。
[0071] 本發(fā)明第四方面提供了一種體外非治療性的抑制和/或瓦解生物被膜的方法，在 需要施用的場合，施用PslG蛋白或本發(fā)明第二方面所述的生物被膜抑制劑，從而抑制和/ 或瓦解生物被膜。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所述的施用濃度為5-100nM，較佳地，施用濃度為10-50nM。
[0073] 在另一優(yōu)選例中，所述施用的劑量為0· OOOl-IOg/每平方米，較佳地為0· OOl-Ig/ 每平方米。
[0074] 在另一優(yōu)選例中，所述生物被膜為假單胞屬（Pseudomonas)微生物的生物被膜。
[0075] 在另一優(yōu)選例中，所述生物被膜為銅綠假單胞菌的生物被膜。
[0076] 在另一優(yōu)選例中，所述抑制劑含有水和/或水性溶劑。
[0077] 本發(fā)明第五方面提供了一種對(duì)單胞菌屬菌株生物被膜的形成能力進(jìn)行改造的方 法，包括步驟：
[0078] (a)提供一單胞菌屬的出發(fā)菌株，
[0079] (b)向所述出發(fā)菌株中導(dǎo)入外源的PslG蛋白編碼序列，從而獲得含有所述PslG蛋 白編碼序列的重組菌株；
[0080] (C)測定上一步驟的所述重組菌株的生物被膜形成能力和/或產(chǎn)生PslG蛋白的能 力，從而選出生物被膜形成能力低于和/或所述產(chǎn)生PslG蛋白能力高于所述出發(fā)菌株的重 組菌株。
[0081 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的"高于"是指，所述改造后重組菌株的PslG蛋白的表達(dá)量 是改造前的出發(fā)菌株的1. 5倍以上（彡），較佳地2倍以上。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，所述的"低于"是指，所述改造后重組菌株的生物被膜的產(chǎn)生量 是改造前出發(fā)菌株的1/2以下（<)，較佳地1/3以下。
[0083] 本發(fā)明第六方面提供了一種用于抑制或瓦解生物被膜的制品，所述制品含有（a) 醫(yī)學(xué)上可接受的基材，和（b)涂覆于或附著于所述基材上的PslG蛋白。
[0084] 在另一優(yōu)選例中，所述的制品包括用于包扎傷口的制品。
[0085] 在另一優(yōu)選例中，所述的傷口包括燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)、插管等引起的創(chuàng)面和/或傷 口等。
[0086] 在另一優(yōu)選例中，所述制品包括人用或獸用的產(chǎn)品
[0087] 在另一優(yōu)選例中，所述制品還包括（C)涂覆于或附著于所述基材上的抗生素。
[0088] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗生素選自下組：阿奇霉素、弗洛沙星、環(huán)丙沙星、妥布霉 素、或其組合。
[0089] 在另一優(yōu)選例中，所述的制品中含有為0· OOOl-IOwt %，較佳地為0· 001-5wt %， 更佳地0. 〇l-2wt%，按制品的總重量計(jì)。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述PslG蛋白與所述抗生素的重量比為1:1000至1000 :1，較 佳地為1:100至100 :1 ;更佳地為1:10至10 :1。
[0091] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0092] 圖1顯示了銅綠假單胞菌PAOl中過表達(dá)PslG抑制PAOl菌株生物被膜的形成；
[0093] 圖2顯示了外加PslG抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成；
[0094] 圖3顯示了 InM PslG對(duì)已形成的銅綠假單胞菌生物被膜的瓦解；
[0095] 圖4顯示了 50nM PslG對(duì)已形成的銅綠假單胞菌生物被膜的瓦解；
[0096] 圖5顯示了 PslG(WT)及其突變蛋白E156Q和E276Q對(duì)生長6個(gè)小時(shí)的銅綠假單 胞菌生物被膜處理30分鐘后的結(jié)果，其中，E156和E276是PslG蛋白的關(guān)鍵活性位點(diǎn)。
[0097] 圖6顯示了 PslG蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)（催化區(qū)域）。
[0098] 圖7顯示了 50nM PslG對(duì)丁香假單胞菌生物被膜的抑制效果。
[0099] 圖8顯示了凍干的PslG蛋白對(duì)生物被膜的抑制效果。
[0100] 圖9顯示了 PslG處理的菌細(xì)胞與浮游菌細(xì)胞對(duì)抗生素敏感性的效果比較圖。其 中，圖9 (a)、9 (c)為浮游菌液對(duì)TOB、CIP的MIC值測定結(jié)果；圖9 (b)、9 (d)為經(jīng)PslG處理 后從生物被膜上游離出的菌細(xì)胞對(duì)TOB、CIP的MIC值測定結(jié)果。
[0101] 圖10顯示了 PslG與抗生素聯(lián)合使用對(duì)銅綠假單胞菌的抑制效果。其中，圖10(a) 為PslG+TOB與單獨(dú)使用TOB的效果對(duì)比圖；圖10(b)為PslG+CIP與單獨(dú)使用CIP的效果 對(duì)比圖。
[0102] 圖11顯示了 PslG蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)。
[0103] 圖12顯示了 PslG對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均沒有細(xì)胞毒性作用。
[0104] 其中，圖12A顯示，PslG處理12小時(shí)后，MTT實(shí)驗(yàn)檢測其對(duì)上皮細(xì)胞HT-29和Caco2 的細(xì)胞毒性；圖12B顯示，PslG對(duì)巨噬細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用。
[0105] 圖13顯示了 PslG增強(qiáng)生物被膜對(duì)巨噬細(xì)胞的敏感性。
[0106] 將培養(yǎng)于玻璃蓋玻片上的24小時(shí)PAOl生物被膜經(jīng)PslG處理并與巨噬細(xì)胞共孵 育后，刮下并重懸在1毫升生理鹽水中做菌落形成單位計(jì)數(shù)（CFU)。圖中所示為三次重復(fù)實(shí) 驗(yàn)所得CFU的平均值及SD值并對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行了 T檢驗(yàn)。（*，P〈0. 01.)
[0107] 圖14顯示了小鼠植入物感染模型。體內(nèi)植入物上的PAOl生物被膜經(jīng)PslG、妥布 霉素單處理或共處理后的每毫升菌落形成單位。水平虛線代表實(shí)驗(yàn)的檢測極限，圖示為5 只小鼠體內(nèi)生物被膜計(jì)數(shù)的平均值。*P〈〇. 01。
[0108] 圖15顯示了線蟲液體殺傷實(shí)驗(yàn)等量游離菌細(xì)胞和PslG解離下的生物被膜細(xì)胞與 四齡線蟲共孵育后的死活線蟲比例。圖示為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值土SD值。
【具體實(shí)施方式】
[0109] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，一種假單胞菌屬的功能未知的蛋 白（即PslG蛋白）居然能夠非常有效地抑制和瓦解銅綠假單胞菌等微生物的生物被膜。在 此基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。
[0110] 具體地，實(shí)驗(yàn)表明，來自銅綠假單胞菌PAOl中的PslG蛋白居然可有效抑制銅綠假 單胞菌形成生物被膜。內(nèi)源性的或外源添加的PslG蛋白，都能夠抑制和瓦解銅綠假單胞菌 形成的生物被膜。經(jīng)本發(fā)明生物被膜抑制劑處理后，生物被膜的生物量至少下降50%，最優(yōu) 條件下可達(dá)80%。
[0111] 本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)獲得了 PslG蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)，揭示了與生物被膜瓦解 功能相關(guān)的PslG蛋白的活性位點(diǎn)，并且還初步揭示了 PslG蛋白可以降解純化的胞外多糖 PSL，說明它是通過降解胞外多糖來抑制和瓦解生物被膜的。
[0112] 本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，將PslG與抗生素聯(lián)用，不僅不影響抗生素的抗菌活性， 還具有顯著優(yōu)于單用抗生素的協(xié)同殺菌效果。
[0113] 假單胞菌屬和銅綠假單胞菌
[0114] 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)是假單胞菌屬的一種，為條件致病菌， 其很容易感染燒傷患者和免疫缺陷病人，是醫(yī)院內(nèi)感染的典型菌株之一。一旦被該菌感染 之后，極易形成生物被膜，從而造成治療的困難。
[0115] 銅綠假單胞菌依賴胞外多糖、胞外蛋白以及胞外DNA來維持其生物被膜結(jié)構(gòu)，因 此，開發(fā)針對(duì)這三種基質(zhì)的降解酶從而抑制或者瓦解生物被膜的形成一直都是人們研究的 熱點(diǎn)。
[0116] 本專利采用特異性的PslG蛋白降解在假單胞菌屬生物被膜形成中起關(guān)鍵作用的 胞外多糖PSL，從而抑制并瓦解假單胞菌屬的生物被膜。
[0117] 生物被膜
[0118] 如本文所用，術(shù)語"生物被膜"指微生物依附某載體形成的膜性聚合物，是其在自 然界中的一種主要的生存方式。
[0119] 生物被膜中的微生物比單細(xì)胞微生物具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，它的形成給人類帶 來了嚴(yán)重的危害。如在醫(yī)藥領(lǐng)域，據(jù)研究表明，約65%的人類細(xì)菌性感染疾病與生物被膜有 關(guān)，生物被膜中微生物對(duì)抗生素的耐藥性比浮游狀態(tài)時(shí)高成百甚至上千倍，大大增加了臨 床治療的難度。又如在工業(yè)領(lǐng)域，生物被膜會(huì)污染給排水管道系統(tǒng)，造成一系列與生物污垢 有關(guān)的工業(yè)問題，如管道內(nèi)壁的生物被膜可造成水質(zhì)污染、生物被膜的腐蝕作用縮短管道 設(shè)施的使用壽命等。
[0120] 醫(yī)學(xué)上，生物被膜是由保護(hù)性表多糖（也稱為胞外多糖）基質(zhì)包被的的高度有機(jī) 的微生物細(xì)胞群，菌細(xì)胞經(jīng)所述的基質(zhì)附著至無活性膜表面和活的動(dòng)植物細(xì)胞表面，即為 固著的群。
[0121] PslG蛋白和PslG編碼基因
[0122] 如本文所用，術(shù)語"本發(fā)明蛋白"、"PslG蛋白"、"PslG多肽"、"PslG酶"之間可以 互換使用，均指來源于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)PslG基因編碼的功能未知 的蛋白或其他類似微生物的同源蛋白。應(yīng)理解，該術(shù)語還包括該P(yáng)slG蛋白的野生型和突 變型，包括該P(yáng)slG蛋白的全長形式（如SEQ ID NO. :2中的第1-442位）或成熟形式（如 SEQ ID NO. : 2中的第31-442位），以及包括該P(yáng)slG蛋白的活性片段或衍生蛋白。在本發(fā)明 中，這些野生型或突變型的、全長或成熟形式的蛋白、或活性片段或衍生蛋白都保留抑制和 /或瓦解生物被膜（尤其是假單胞菌屬生物被膜）的功能。此外，應(yīng)理解，該術(shù)語不僅包括 來源于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)的蛋白，還包括來自假單胞菌屬或其他屬 微生物的同源蛋白（通常，這些來自其他物種的同源蛋白與SEQ ID NO. :2所示氨基酸序列 的相同性（identity)彡約60%，更佳地彡70%，彡80%，彡90%，或最佳地彡95% )。此 外，應(yīng)理解，該術(shù)語包括了含有或不含有起始氨基酸（Met)的蛋白形式。
[0123] 在本發(fā)明的優(yōu)選例中，PsIG全長基因核苷酸序列如SEQ ID NO. :1所示，克隆到大 腸桿菌表達(dá)載體的PslG為從第91個(gè)核苷酸開始的序列。
[0124] 純化的PslG蛋白（31-442)的氨基酸序列如SEQ ID NO. :2。PslG(31-442)的三 維晶體結(jié)構(gòu)如圖6所示。
[0125] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的PslG蛋白源自銅綠假胞單菌P. aeruginosa PAOl菌株，全長含有442個(gè)氨基酸，含有一信號(hào)肽（第1-30位）。去除了信號(hào)肽（1-30)后 的PslG的成熟形式的長度為411個(gè)氨基酸。
[0126] 無論是全長形式還是成熟形式的PslG，都可常規(guī)方法進(jìn)行表達(dá)和純化。一種常用 的表達(dá)體系是采用大腸桿菌（E. coli)進(jìn)行表達(dá)。
[0127] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)表明，PslG不僅能夠瓦解假單胞菌所產(chǎn)生的生物被膜，還能抑制假單 胞菌形成生物被膜。
[0128] 本發(fā)明首次揭示了 PslG對(duì)假單胞菌的生物被膜具有抑制、瓦解作用。
[0129] 生物被膜抑制劑
[0130] 如本文所用，"微生物被膜抑制劑"和"生物被膜抑制劑"可互換使用，一般其主要 通過抑制微生物之間的交流或相互連接從而抑制生物膜結(jié)構(gòu)的目的，而并不對(duì)微生物本身 進(jìn)行殺滅，因此，不會(huì)對(duì)微生物的生存產(chǎn)生脅迫壓力，因而并不導(dǎo)致新的"耐藥性"產(chǎn)生。
[0131] 如本文所用，術(shù)語"本發(fā)明的生物被膜抑制劑"、"本發(fā)明制劑"可互換使用，均指含 有PslG蛋白、其活性片段和/或其激動(dòng)劑作為活性成分，從而能夠抑制、瓦解或降解假單胞 菌生物被膜的組合物或混合物。
[0132] 在本發(fā)明中，提供了一種生物被膜抑制劑（也可稱為生物被膜瓦解劑），該抑制劑 含有本發(fā)明蛋白作為抑制和/或瓦解生物被膜的有效成分。
[0133] 本發(fā)明的"生物被膜抑制劑"包括：
[0134] (a)PslG蛋白、其活性片段和/或其激動(dòng)劑；
[0135] (b)載體和/或助劑。
[0136] 本發(fā)明的生物被膜抑制劑通過抑制微生物的生物被膜，使病原微生物喪失保護(hù)， 增加對(duì)普通藥物的易感性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種致病菌的有效控制，有著普通抗生素手段無法 比擬的技術(shù)優(yōu)勢。
[0137] 此外，本發(fā)明的生物被膜抑制，還可同選自下組其他物質(zhì)（如抗生素）聯(lián)用。代表 性的抗生素例子包括（但并不限于）：阿奇霉素、弗洛沙星、環(huán)丙沙星、妥布霉素、或其組合。
[0138] 實(shí)驗(yàn)表明，將PslG蛋白與抗生素聯(lián)用，不僅不影響抗生素的抗菌活性，其殺菌效 果比單獨(dú)使用抗生素更好。
[0139] 本發(fā)明的生物被膜抑制劑，可有效地和/或特異性地抑制微生物的生物被膜，代 表性的微生物包括（但并不限于）：假單胞菌屬微生物，尤其是銅綠假單胞菌、斯氏假單胞 菌、熒光假單胞菌、丁香假單胞菌。
[0140] 本發(fā)明的生物被膜抑制劑，可用于各種不同應(yīng)用和場合。代表性的例子包括（但 并不限于）：醫(yī)療設(shè)備、機(jī)構(gòu)管道生物被膜的清除和清潔、導(dǎo)管生物被膜的清除、醫(yī)用導(dǎo)管 和其他管道的微生物被膜的抑制。
[0141] 在本發(fā)明中，本發(fā)明蛋白或生物被膜抑制劑的有效施用濃度或劑量沒有特別 限制，可以根據(jù)菌種類、施用場合等情況而確定。優(yōu)選的濃度范圍為5-100nM，較佳地為 10-50nM ;或者所述施用的（劑）量為0· OOOl-IOg,較佳地為0· OOl-Ig(如對(duì)于每1或10 平方米）。
[0142] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的生物被膜抑制劑可抑制、瓦解或降解假單胞菌的生 物被膜。
[0143] 藥物組合物和施用方法
[0144] 本發(fā)明提供了一種藥物組合物，它含有（a)安全有效量的PslG蛋白、、其活性片段 和/或其激動(dòng)劑以及（b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）： 鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的 藥物組合物可以被制成注射劑或粉劑，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液 通過常規(guī)方法或用冷凍干燥的方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過 常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如注射劑、粉劑、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿?分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本 發(fā)明的藥物組合物還可與抗生素一起使用。
[0145] 使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明PslG蛋白施用于哺乳動(dòng)物，其中該 安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體 重，較佳地，該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考 慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0146] 抑制和/或瓦解生物被膜的方法
[0147] 本發(fā)明還提供了一種通過施用本發(fā)明蛋白、本發(fā)明的生物被膜抑制劑或本發(fā)明的 藥物組合物，從而抑制、瓦解或降解生物被膜的方法。
[0148] 在另一優(yōu)選例中，所述生物被膜抑制劑的施用濃度為5-100nM，較佳地，為 10-50nM。
[0149] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物被膜為細(xì)菌生物被膜或微生物被膜。
[0150] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物被膜包括導(dǎo)管細(xì)菌生物被膜和/或機(jī)會(huì)性感染相關(guān) 微生物的生物被膜。
[0151] 在另一優(yōu)選例中，所述生物被膜為假單胞屬（Pseudomonas)的生物被膜。
[0152] 在另一優(yōu)選例中，所述生物被膜為銅綠假單胞菌的生物被膜。
[0153] 本發(fā)明的方法可以用于預(yù)防、治療等醫(yī)藥用途，還可用于非治療性的非醫(yī)藥用途 (如用于輔助殺滅環(huán)境中的微生物）。代表性的應(yīng)用方法包括（但并不限于）：
[0154] (1)治療不同人種、不同年齡或不同地區(qū)的感染銅綠假單胞菌的燒傷患者和免疫 缺陷病人。
[0155] (2)醫(yī)療設(shè)備、機(jī)構(gòu)管道生物被膜的清除和清潔、導(dǎo)管生物被膜的清除、醫(yī)用導(dǎo)管 和其他管道的微生物被膜的抑制。
[0156] 本發(fā)明提供了一種PslG蛋白及其編碼序列的抑制、瓦解或降解微生物的生物被 膜（biofilm)中的應(yīng)用。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
[0157] (a)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)PslG蛋白對(duì)銅綠假單胞菌的生物被膜具有抑制、瓦解作用。 所述的生物被膜抑制劑能夠特異性抑制或瓦解銅綠假單胞菌的生物被膜。
[0158] (b)本發(fā)明首次解析了 PslG蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了 PslG蛋白的功能。
[0159] (c)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)PslG蛋白的2個(gè)關(guān)鍵活性位點(diǎn)。
[0160] (d)與單獨(dú)使用抗生素相比，PslG蛋白與抗生素聯(lián)用不僅可以抑制銅綠假單胞菌 生物被膜的形成，而且有望徹底清除銅綠假單胞菌。
[0161] 因此，本發(fā)明具有潛在的廣闊應(yīng)用前景，例如有望開發(fā)成抗菌藥物，消除銅綠假單 胞菌的耐藥性。
[0162] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步陳述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。
[0163] 本發(fā)明實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無特殊說明均可從市售渠道獲得，其中，銅綠 假單胞菌 PAOl 見參考文獻(xiàn)（Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAOI, an opportunistic pathogen. Nature 2000,406:959-964.)
[0164] 實(shí)施例1銅綠假單胞菌PAOl中表達(dá)PslG抑制PAOl菌株生物被膜的形成
[0165] 含有PslG可被阿拉伯糖（arabinose)誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒（pHERD20T_PslG)的銅綠假 單胞菌于Jensen液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜后，以1 %接種量分別接至含有不同濃度阿拉 伯糖的Jensen培養(yǎng)液中，于96孔板中30°C靜止培養(yǎng)24小時(shí)。
[0166] 采用結(jié)晶紫法檢測生物被膜的生物量：棄去孔中游離的菌體后，洗三次。接著用 0. 1%的結(jié)晶紫對(duì)生物被膜進(jìn)行染色，洗三次后，用30%的醋酸溶解結(jié)合在生物被膜上的結(jié) 晶紫，利用分光光度計(jì)檢測其0D560的值（即結(jié)晶紫的濃度），通過其大小來衡量生物被膜 菌的生物量。其中，以不合成PSL多糖的PA01，Apsl菌株為負(fù)對(duì)照，PSL多糖可誘導(dǎo)表達(dá) (阿拉伯糖為誘導(dǎo)劑）的PAOl，P bad psl菌株為陽性對(duì)照。
[0167] 結(jié)果如圖1所示，隨著阿拉伯糖濃度的增加，即PslG表達(dá)的增大，PAOl的生物被 膜生物量逐漸降低。0.5%以上的阿拉伯糖濃度使PAOl的生物被膜降低到Apsl菌株的水 平。
[0168] 結(jié)果表明，PslG的過量表達(dá)抑制了 PAOl菌株生物被膜的形成。
[0169] 實(shí)施例2外加PslG蛋白抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成
[0170] 接LBNS平板上新鮮單克隆銅綠假單胞菌于LBNS液體培養(yǎng)基中，在37度下200轉(zhuǎn) /分鐘震蕩培養(yǎng)12小時(shí)。然后以1%接種量接在Jensen培養(yǎng)基中，同時(shí)，添加不同濃度的 PslG蛋白，于96孔板中在30度靜止培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去游離的菌體，用結(jié)晶紫對(duì)生物被膜 進(jìn)行染色并檢測生物被膜的生物量（具體操作可參照實(shí)施例1中的步驟）。
[0171] 結(jié)果如圖2所示。從中可以看出，PslG蛋白在InM時(shí)其抑制率可達(dá)50%。 10nm-50nm濃度時(shí)，可以明顯抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成。
[0172] 實(shí)施例3 InM PslG蛋白對(duì)已形成的銅綠假單胞菌生物被膜的瓦解作用
[0173] 接LBNS平板上新鮮單克隆銅綠假單胞菌于LBNS液體培養(yǎng)基中，在37度下200轉(zhuǎn) /分鐘震蕩培養(yǎng)12小時(shí)。然后以I %接種量接在Jensen培養(yǎng)液中，于96孔板中30度靜止 培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去游離的菌體，用0. 8%生理鹽水洗3次后添加100 μ 1含有InM PslG的 Jensen培養(yǎng)液，作用5或30分鐘分鐘后，用結(jié)晶紫染色法檢測處理后的生物被膜的生物量 (結(jié)晶紫染色法具體操作步驟參照實(shí)施例2)。
[0174] 同時(shí)，以未加PslG的Jensen培養(yǎng)液為對(duì)照組。
[0175] 結(jié)果如圖3所示。從中可以看出，InM PslG蛋白處理5分鐘，對(duì)銅綠假單胞菌生物 被膜的生物量沒有影響。而處理30分鐘后生物被膜的生物量降低了 50%。
[0176] 實(shí)施例4 50nM PslG蛋白對(duì)已形成的銅綠假單胞菌生物被膜的瓦解
[0177] 接LBNS平板上新鮮單克隆銅綠假單胞菌于LBNS液體培養(yǎng)基中，在37度下200轉(zhuǎn) /分鐘震蕩培養(yǎng)12小時(shí)。然后以1 %接種量接在Jensen培養(yǎng)液中，于96孔板中30度靜止 培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去游離的菌體，用0. 8%生理鹽水洗3次后添加100 μ 1含有50nM PslG 的Jensen培養(yǎng)液，不同時(shí)間處理后，用結(jié)晶紫染色法檢測處理后的生物被膜的生物量（結(jié) 晶紫染色法具體操作步驟可參照2)。
[0178] 同時(shí)以未加PslG的Jensen培養(yǎng)液為對(duì)照組。
[0179] 結(jié)果如圖4所示，50nM PslG蛋白處理5分鐘，已明顯降低銅綠假單胞菌生物被膜 的生物量；處理10分鐘后生物被膜的生物量降低了 50%;處理30分鐘后，生物被膜生物量 降低至類似不能采PSL多糖菌株的水平。30分鐘以上的處理并未有更顯著的降低。
[0180] 以上結(jié)果說明，50nM PslG 30分鐘處理足以清除依賴于PSL多糖的生物被膜。
[0181] 實(shí)施例5 E156和E276是PslG蛋白的關(guān)鍵活性位點(diǎn)
[0182] 發(fā)明人經(jīng)過多次比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，E156和E276可能是其關(guān)鍵的催化位點(diǎn)。PslG蛋 白晶體結(jié)構(gòu)分析提示E156和E276可能是其關(guān)鍵活性位點(diǎn)。
[0183] 如圖5所示，突變蛋白PslG(E156Q)和PslG(E276Q)均喪失了對(duì)已形成銅綠假單 胞菌生物被膜的瓦解能力。
[0184] 實(shí)施例6 PslG蛋白對(duì)丁香假單胞菌生物被膜的抑制作用
[0185] 方法同實(shí)施例2, PslG濃度為50nM。
[0186] 如圖7所示，結(jié)果表明，PslG不僅能抑制多株銅綠假單胞菌的生物被膜，對(duì)丁香假 單胞菌也有同樣的抑制效果。
[0187] 實(shí)施例7凍干的PslG蛋白對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的抑制作用
[0188] 將PslG通過冷凍抽干獲得粉劑，重溶于滅菌無菌水后進(jìn)行生物被膜抑制實(shí)驗(yàn)，以 未經(jīng)冷凍抽干的原PslG溶液做對(duì)照組。方法同實(shí)施例2, PslG濃度為50nM。
[0189] 如圖8所示，結(jié)果表明，凍干的PslG與PslG溶液均對(duì)銅綠假單胞菌的生物被膜有 抑制作用。
[0190] 實(shí)施例8 PslG處理的菌細(xì)胞與浮游菌細(xì)胞對(duì)抗生素敏感性的比較
[0191] 在LBNS液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)銅綠假單胞菌24小時(shí)，用PslG處理生長24h的 銅綠假單胞菌的生物被膜，分別取浮游菌液和從PslG處理的菌中解離的菌液各0. 2毫升， 將其均勻涂布于LBNS平板上，在這些平板中央放置測MIC的試紙條，37度培養(yǎng)16小時(shí)后讀 取MIC值。
[0192] 對(duì)照組：如圖9 (a)、9 (c)所示，浮游菌液對(duì)TOB、CIP的MIC值測定。
[0193] 實(shí)驗(yàn)組：如圖9(b)、9(d)所示，經(jīng)PslG處理后從生物被膜游離出的菌細(xì)胞對(duì)Τ0Β、 CIP的MIC值測定。
[0194] 如圖9所示，結(jié)果表明，與浮游菌細(xì)胞相比，PslG處理的菌細(xì)胞對(duì)妥布霉素（TOB) 和環(huán)丙沙星（CIP)更為敏感，其MIC值也更低。
[0195] 實(shí)施例9 PslG蛋白與抗生素聯(lián)用不影響抗生素的抗菌活性
[0196] 用37 °C震蕩培養(yǎng)24h的銅綠假單胞菌液，取0. 2毫升菌液涂布于LBNS平板上，將 不同處理的濾紙片置于平板中，如圖10所示，37°C培養(yǎng)24h后測量抑菌圈。
[0197] 實(shí)驗(yàn)一：
[0198] 如圖10(a)所示，設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為單用緩沖液；單用50nM PslG;單用 TOB (妥布霉素）；聯(lián)合用TOB+PslG。
[0199] 實(shí)驗(yàn)二：
[0200] 如圖10(b)所示，設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為單用緩沖液；單用50nM PslG;單用 CIP (環(huán)丙沙星）；聯(lián)合用CIP+PslG。
[0201] 結(jié)果表明（圖10)，與單獨(dú)使用抗生素的抑菌圈大小相比，PslG與抗生素聯(lián)用的 抑菌圈大小沒有顯著變化，因此，PslG與抗生素聯(lián)用不影響抗生素的抗菌活性；單獨(dú)使用 PslG不產(chǎn)生抑菌圈，表明PslG不殺菌。
[0202] 實(shí)施例10 PslG與氟羅沙星（FLX)聯(lián)合抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成
[0203] 根據(jù)微量稀釋法（婁永新、王金良，實(shí)用臨床細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)與進(jìn)展，1993:247)測得 銅綠假單胞菌對(duì)FLX的最低抑菌濃度（MIC)，用常規(guī)方法測定PslG的IC50值。
[0204] 將1/2IC50的PslG分別與1/4MIC、1/2MIC的弗洛沙星（FLX)聯(lián)用，測定它們對(duì)銅 綠假單胞菌生物被膜的抑制效果。
[0205] 結(jié)果表明，與單獨(dú)使用IMIC弗洛沙星（FLX)相比，PslG與弗洛沙星（FLX)聯(lián)用對(duì) 銅綠假單胞菌的殺菌效果更為顯著。
[0206] 實(shí)施例11 PslG蛋白的晶體結(jié)構(gòu)與功能分析
[0207] 對(duì)全長PslG蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白具有獨(dú)特的催化結(jié)構(gòu)域與 多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖11)，并且初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該蛋白有水解多糖的功能，可能參與Psl 多糖單元聚合或已聚合多糖菌表的釋放。
[0208] 實(shí)施例12 PslG對(duì)哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性
[0209] 采用人類結(jié)腸上皮細(xì)胞系Caco2及HT-29檢測PslG的細(xì)胞毒性。
[0210] 結(jié)果如圖12A和圖12B所示，四唑MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示，PslG對(duì)兩種結(jié)腸上皮細(xì) 胞的活力幾乎沒有影響。并且，PslG對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264. 7)也未顯示任何毒性作用。
[0211] 實(shí)施例13經(jīng)PslG處理后的生物被膜菌細(xì)胞更易被巨噬細(xì)胞清除
[0212] PAOl生物被膜于玻璃蓋玻片上培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)PslG處理1小時(shí)后，再與巨噬細(xì)胞 一起孵育2小時(shí)，剩余生物被膜用刀片刮下并重懸于1毫升生理鹽水中做菌落計(jì)數(shù)（CFU)。
[0213] 結(jié)果如圖13所示。結(jié)果顯示，與未經(jīng)PslG處理的對(duì)照組相比，經(jīng)PslG與巨噬細(xì) 胞共處理后的生物被膜剩余菌數(shù)最少。結(jié)果表明，PslG能夠增強(qiáng)生物被膜對(duì)巨噬細(xì)胞清除 作用的敏感性。
[0214] 因此，PslG對(duì)宿主細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性且可以增強(qiáng)生物被膜對(duì)巨噬細(xì)胞的敏感性， 由此提示了 PslG在治療生物被膜相關(guān)感染中的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0215] 實(shí)施例14小鼠植入感染模型顯示PslG可促進(jìn)體內(nèi)生物被膜的清除作用
[0216] 將經(jīng)銅綠假單胞菌生物被膜包被的植入物插入小鼠腹膜并局部進(jìn)行下列處理： 50nM PslG單處理；50mg kg1安布霉素單處理；50nM PslG+50mg kg 1安布霉素共處理。經(jīng) 24小時(shí)體內(nèi)培養(yǎng)后，將小鼠處死，移出植入物經(jīng)均化作用后在LB平板上做細(xì)菌計(jì)數(shù)。將植 入物上的銅綠假單胞菌數(shù)以CFU/ml的數(shù)據(jù)形式制表。
[0217] 結(jié)果如圖14所示。結(jié)果顯示，與未經(jīng)任何處理的對(duì)照組相比，經(jīng)PslG或妥布霉 素單處理及PslG和妥布霉素共處理后植入物上的菌數(shù)均顯著降低。具體地，對(duì)照組的菌 數(shù)（CFU/mL) > 104,經(jīng)PslG單處理后的菌數(shù)（CFU/mL)~103,經(jīng)妥布霉素單處理后的菌數(shù) (CFU/mL)~10 2Λ經(jīng)PslG和妥布霉素共處理后，有4組樣品的菌數(shù)（CFU/mL)達(dá)到了 101， 因此，從圖中可以看出，PslG與妥布霉素聯(lián)用的效果最好。
[0218] 結(jié)果表明，PslG和抗生素可同時(shí)使用來治療臨床生物被膜（如銅綠假單胞菌生物 被膜）的相關(guān)感染。
[0219] 實(shí)施例15 PslG解離下的生物被膜菌細(xì)胞的毒力沒有明顯變化
[0220] 采用秀麗隱桿線蟲作為宿主模型進(jìn)行液體殺傷實(shí)驗(yàn)。
[0221] 設(shè)置兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2。
[0222] 實(shí)驗(yàn)組1 :富集等量PslG處理后菌膜（銅綠假單胞菌生物被膜）解離下來的游離 菌細(xì)胞與四齡線蟲共孵育。
[0223] 實(shí)驗(yàn)組2 :收集生長24小時(shí)的液體游離菌細(xì)胞與四齡線蟲共孵育。
[0224] 將實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2分別放置于96孔板，在25°C共孵育48小時(shí)后，用體視顯微 鏡觀察死活線蟲的比例。每組三個(gè)重復(fù)，結(jié)果以平均值土SD值表示。
[0225] 結(jié)果如圖15所示。結(jié)果表明，PslG解離的菌細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組1)與游離菌細(xì)胞（實(shí) 驗(yàn)組2)相比，其毒力沒有明顯差異。
[0226] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種PslG蛋白或其編碼序列的用途，其特征在于，用于（i)制備抑制、瓦解或降解生 物被膜的制劑；和/或（ii)制備抗菌藥物。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PslG蛋白選自： (i) 具有SEQ ID NO. : 2所示氨基酸序列的蛋白； (ii) 將如SEQ ID NO. :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的、具有對(duì)生物被膜形成產(chǎn)生抑制和/或降解能力的由（i)衍生的蛋白； (iii) 氨基酸序列與SEQ ID NO. :2所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98%)，增強(qiáng) 蛋白對(duì)生物被膜形成產(chǎn)生抑制或降解能力的蛋白。3. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的PslG蛋白的編碼序列選自： (a) 編碼如SEQ ID NO. :2或所示的氨基酸序列的核苷酸序列； (b) 序列如SEQ ID NO. :1所示的核苷酸序列； (c) 核苷酸序列與SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的核苷 酸序列； (d) 如SEQ ID NO. : 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60個(gè)（較佳地 1-30,更佳地1-10個(gè)）核苷酸的核苷酸序列； (e) 與（a)-(d)任一所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制劑或所述的抗菌藥物用于選自下 組的一種或多種用途： (1) 抑制假單胞菌生物被膜的形成； (2) 瓦解和/或降解假單胞菌已經(jīng)形成的生物被膜； (3) 抑制假單胞菌的生長。5. -種生物被膜抑制劑，其特征在于，包括： (a) 抑制有效量的PslG蛋白、其活性片段和/或其激動(dòng)劑； (b) 載體； (c) 任選的助劑。6. 如權(quán)利要求5所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑還包括抗生素。7. -種用于抑制生物被膜的藥物組合物，其特征在于，包括： (a) 安全有效量的PslG蛋白、其活性片段和/或其激動(dòng)劑； (b) 藥學(xué)上可接受的載體。8. -種體外非治療性的抑制和/或瓦解生物被膜的方法，其特征在于，在需要施用的 場合，施用PslG蛋白或權(quán)利要求5所述的生物被膜抑制劑，從而抑制和/或瓦解生物被膜。9. 一種對(duì)單胞菌屬菌株生物被膜的形成能力進(jìn)行改造的方法，其特征在于，包括步 驟： (a) 提供一單胞菌屬的出發(fā)菌株； (b) 向所述出發(fā)菌株中導(dǎo)入外源的PslG蛋白編碼序列，從而獲得含有所述PslG蛋白編 碼序列的重組菌株； (c) 測定上一步驟的所述重組菌株的生物被膜形成能力和/或產(chǎn)生PslG蛋白的能力， 從而選出生物被膜形成能力低于和/或所述產(chǎn)生PslG蛋白能力高于所述出發(fā)菌株的重組 菌株。10. -種用于抑制或瓦解生物被膜的制品，其特征在于，所述制品含有（a)醫(yī)學(xué)上可接 受的基材，和（b)涂覆于或附著于所述基材上的PslG蛋白。
【文檔編號(hào)】A01P1/00GK105963680SQ201510648750
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2015年10月9日
【發(fā)明人】馬旅雁, 谷立川, 于珊, 吳慧君, 王世偉, 蘇甜甜, 王迪, 楊亮
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院微生物研究所, 山東大學(xué)