一種麥芽糖修飾的釓基螯合物mr造影劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，包括：攪拌條件下，將DOTA?NHS溶液滴加到PPI溶液中，攪拌反應(yīng)，透析，冷凍干燥，得到PPI?DOTA；將PPI?DOTA、D?(+)?麥芽糖與甲硼烷?吡啶溶于硼酸緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)，透析，冷凍干燥，得到PPI?MAL DS?DOTA；將PPI?MAL DS?DOTA溶于超純水中，加入硝酸釓，攪拌反應(yīng)，透析，冷凍干燥，即得。本發(fā)明的制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和可控，易于操作，得到的MR造影劑，不僅有高達(dá)10.2mM?1s?1的r1弛豫率，能夠被U87MG細(xì)胞吞噬，表現(xiàn)出良好的MR造影效果，且具有主動脈、腎動脈的血池MR造影效果。
【專利說明】
一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于核磁共振成像(MR)造影劑的制備領(lǐng)域，特別涉及一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥(cancer)，醫(yī)學(xué)術(shù)語亦稱惡性腫瘤，現(xiàn)在已直接或間接的影響許多人的生活，成為威脅人類健康的頭號殺手。因此，早期的診斷和治療成為治愈癌癥的關(guān)鍵。在腫瘤的早期診斷方面，傳統(tǒng)的影像技術(shù)只能了解腫瘤體積大小和解剖定位，而分子影像學(xué)技術(shù)可以獲得更多的檢測參數(shù)，如腫瘤生長動力學(xué)評估，惡變前的分子異常檢測，腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物等，且活體分子成像可以實現(xiàn)在無損生物體微環(huán)境的狀況下進(jìn)行發(fā)病機(jī)制的研究，并幫助破譯復(fù)雜的分子運動軌跡。目前應(yīng)用于臨床的分子影像學(xué)技術(shù)主要包括超聲成像、SPECT成像、CT成像和核磁共振成像(MRI)等。
[0003]作為分子影像學(xué)的重要組成部分，造影劑的適當(dāng)選擇可以大大地提高成像診斷的靈敏性、特異性。而作為理想的且能應(yīng)用于臨床癌癥早期靶向診斷的納米材料體系，在生物安全性得以保障的同時，更要兼顧制備方法簡便、原材料價廉易得等主要因素。目前應(yīng)用于臨床的造影劑，如應(yīng)用于CT成像的Omnipaque，用于MRI的六種IL基小分子造影劑都存在不可克服的缺陷，上述的分子影像劑均存在血液循環(huán)時間過短等不足之處。因此，臨床醫(yī)學(xué)界更加期望能開發(fā)出更適宜的造影劑，進(jìn)而彌補(bǔ)臨床上已存在的某些影像成像的不足之處。
[0004]納米技術(shù)的發(fā)展使越來越多的科研工作者開始研發(fā)不同的造影劑以滿足臨床的需求。前期工作中，Shi和其合作者首先通過共沉淀法制備得到四氧化三鐵納米顆粒，然后再在其表面層層靜電自組裝上聚谷氨酸和聚賴氨酸，最后將包裹有金納米顆粒的第四代聚酰胺-胺樹狀大分子在EDC作用下修飾到氧化鐵表面，實現(xiàn)了 T2加權(quán)MR成像和CT成像雙模態(tài)造影(J.Mater.Chem.，2012，22，15110-15120);隨后，Shi等人利用第四代聚酰胺-胺樹狀大分子為平臺，將螯合試劑DOTA-NHS連接到樹狀大分子表面用于螯合釓離子用于MR成像，同時利用樹狀大分子特殊的空腔結(jié)構(gòu)，包裹金納米顆粒用于CT成像，實現(xiàn)TT1加權(quán)MR增強(qiáng)和CT增強(qiáng)的MR/CT雙模態(tài)成像功能(B1materials ,2013，34，1570-1580)。盡管該材料可以用于腫瘤的T1W權(quán)MR成像，但由于納米金的存在，使其η弛豫率降低約4倍多。即使沒有納米金的存在，其η弛豫率也約在5mM—1S+Hlnt.J.Nanomed.，2008，2，201-210)。因而發(fā)展新型的具有較高η弛豫率的基于樹狀大分子的T1MR造影劑得到了人們越來越多的關(guān)注。
[0005]研究開發(fā)高弛豫率的T1造影劑具有重要意義，一方面可降低造影劑的使用劑量，另一方面可推動MRI向分子成像和分子追蹤的層次發(fā)展。!^造影劑加速質(zhì)子弛豫的過程可以通過“雙層配位”模型來描述，該模型包含直接和Gd3 +配位)的水分子(內(nèi)層水，innersphere)，以及和配體分子有配位作用(second sphere)或者和造影劑分子沒有配位作用但仍然能“感受”到加速弛豫作用的水分子(外層水，outer sphere)。由于內(nèi)層水起關(guān)鍵作用，所以主流的方法是通過改變和內(nèi)層水相關(guān)的影響弛豫度的因素來提高弛豫率，如降低分子的翻轉(zhuǎn)時間和提高水交換速率(Chem.Rev.，，1999,99:2293-2352)。大分子的造影劑具有更加剛性的結(jié)構(gòu)，旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間更長，所以造影劑表面修飾一些大分子基團(tuán)可以很好地提高其弛豫率(Chem.-Eur.J.2014，20，10944-10952)。也有研究表明，造影劑中氫鍵的存在會影響相關(guān)基團(tuán)的電荷取代，從而改變配位籠的特性導(dǎo)致與配位水的交換時間的延長，弛豫率提高(Contrast Media Mol.1magin 2007,2(2) ,94—102)。
[0006]C1lkowski，M.等人利用糖類化合物對樹狀大分子進(jìn)行修飾，證明了其可替代傳統(tǒng)的PEG化降低材料細(xì)胞毒性(Colloids Surf.，B，2012，95，103-108)。研究表明糖類修飾的樹狀大分子成電中性，毒性小，并且其形成的空腔結(jié)構(gòu)可以用來包裹小分子基團(tuán)(Chem.-Eur.J., 2008,14(23), 7030-7041)。大量研究者也對糖類和生物分子以及生物系統(tǒng)之間的相互作用進(jìn)行了深入的研究，為糖類修飾的樹狀大分子后續(xù)的各類生物反應(yīng)提供了有力的理論基礎(chǔ)(Chemb1chem, 2004,5(10) ,1375-1383 ;Glycotechnol.2006,18(103) ,323-341;Chem.-Eur.J.2006,12(3),656-665)。
[0007]檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，尚沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于麥芽糖修飾的聚丙烯亞胺樹狀大分子基釓螯合物MR造影劑的制備及其用于體內(nèi)MR血池造影應(yīng)用研究的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，該方法合成工藝簡單，反應(yīng)條件溫和可控，易于操作；制備得到的MR造影劑具有良好是生物相容性和血液相容性，并且體外細(xì)胞實驗顯示器件能夠被U87MG細(xì)胞吞噬，表現(xiàn)出良好的MR造影效果，體內(nèi)小鼠實驗也表明此樹狀大分子納米器件具有主動脈、腎動脈的血池MR造影效果且最終造影劑會隨代謝排出體外，不會在體內(nèi)長時間蓄積。
[0009 ]本發(fā)明的一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，包括:
[0010](I)在攪拌條件下，將I，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸-N-羥基丁二酰亞胺DOTA-NHS溶液滴加到PPI溶液中，攪拌反應(yīng)20?24小時，得到中間產(chǎn)物PP1-D0TA，透析，冷凍干燥，得到PP1-DOTA;
[0011](2)將步驟(I)中的PP1-D0TA、D-( + )_麥芽糖與甲硼烷-吡啶溶于硼酸緩沖溶液中，500C條件下攪拌7天，透析，冷凍干燥，得到PP1-MAL DS-DOTA；
[0012](3)將步驟(2)中的PP1-MAL DS-D0TA溶于超純水中，加入硝酸釓，攪拌反應(yīng)20-30小時，透析，冷凍干燥，得到麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑，即PP1-MAL DS-DOTA(Gd)。
[0013]所述步驟(I)中DOTA-NHS溶液和PPI溶液的溶劑為DMS0;分別將PPI和DOTA-NHS溶解在1?12mL和2?3mL的二甲亞砜(DMSO)溶劑中。
[0014]所述步驟(I)中參加反應(yīng)的PPI與DOTA-NHS的摩爾比為1:20。
[0015]所述步驟(I)中的PPI為聚丙烯亞胺樹狀大分子，實際分子量為7407。
[0016]所述步驟(2)中麥芽糖與PPI的摩爾比為5:1-7:1。
[0017]所述步驟(2)中甲硼烷-吡啶濃度為SM;硼酸緩沖溶液中硼酸鈉的濃度為0.1M;透析的條件為:截留分子量為1000的透析袋透析三天。
[0018]所述步驟(3)中硝酸釓與PP1-MAL DS-D0TA中DOTA的摩爾比為5:1-10:1。
[0019]所述步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中透析的條件為:截留分子量為1000的透析袋透析三天。
[0020]本發(fā)明基于第四代聚丙烯亞胺為平臺，外圍修飾麥芽糖分子以及核磁共振造影劑(DOTA-Gd)，三者有機(jī)結(jié)合而得到功能化的MR造影劑。
[0021]本發(fā)明先將螯合試劑DOTA結(jié)合到第四代聚丙烯亞胺上，并修飾上麥芽糖，最后將釓成功地螯合到DOTA上，從而制備出可實現(xiàn)MR成像的造影劑，預(yù)期造影劑具有良好的細(xì)胞相容性和較高的^弛豫率。
[0022]本發(fā)明利用樹狀大分子表面存在大量氨基從而可實現(xiàn)多功能化修飾這一特性，首先采用化學(xué)鍵合法將螯合試劑DOTA連接到PPI表面氨基上，進(jìn)一步將麥芽糖修飾到PPI表面。DOTA的存在可以起到螯合金屬離子釓的作用，而麥芽糖分子的修飾不僅可以降低PPI的細(xì)胞毒性，而且其末端的羥基可以很好地降低樹狀大分子復(fù)合物與蛋白質(zhì)間的相互作用；另外麥芽糖的修飾可降低分子的翻轉(zhuǎn)時間和提高水交換速率，進(jìn)而提高其^弛豫率。
[0023]本發(fā)明采用的合成工藝簡單，反應(yīng)條件溫和可控，易于操作;制備得到的MR造影劑具有良好的生物相容性和血液相容性，并且在細(xì)胞水平和動物水平能實現(xiàn)良好的MR顯影功能，最終造影劑會隨代謝排出體外，不會在體內(nèi)長時間蓄積。該方法制備的麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑在分子影像診斷領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明使用13CNMRjH NMR、紫外可見吸收光譜(UV-Vis)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)、Zeta電勢、水合粒徑等方法表征制備得到的造影劑的物理化學(xué)性質(zhì)，并通過核磁共振成像儀分析造影劑的T1成像性能和η弛豫率，然后通過溶血實驗、MTT法評價該造影劑的血液相容性和細(xì)胞毒性，再利用體外和體內(nèi)核磁共振成像實驗分別檢測造影劑被腫瘤細(xì)胞的吸收情況和血池造影效果。
[0025]有益效果
[0026](I)本發(fā)明利用樹狀大分子表面大量氨基從而可實現(xiàn)多功能化修飾這一特性，首先利用化學(xué)鍵合法將螯合試劑DOTA連接到PPI表面氨基上，進(jìn)一步將麥芽糖修飾到PPI樹狀大分子表面。DOTA的存在可以起到螯合金屬離子釓的作用，而麥芽糖分子的修飾不僅可以降低PPI的細(xì)胞毒性，而且其末端的羥基可以很好地降低樹狀大分子復(fù)合物與蛋白質(zhì)間反應(yīng)，同時有助于通過降低分子翻轉(zhuǎn)的速度和提高整個分子的親水性而提高造影劑的η弛豫率；
[0027](2)本發(fā)明采用的合成工藝簡單，反應(yīng)條件溫和可控，易于操作；制備得到的MR造影劑具有良好是生物相容性和血液相容性，并且在細(xì)胞水平和動物水平能實現(xiàn)良好的MR顯影功能;制備得到的麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑在分子影像診斷領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明制備的PP1-MALDS-DOTA(Gd)造影劑的結(jié)構(gòu)示意圖(a)和合成示意圖(b)，(a)中灰色圓圈為著重顯示標(biāo)記，(b)中黑色圓圈代表第四代PPI樹狀大分子；
[0029]圖2為實施例2中PP1-DOTA的碳譜分析圖；
[0030]圖3為實施例2中PP1-MAL DS-D0TA的氫譜分析圖；D2O為溶劑；
[0031]圖4為實施例2中PP1-MAL DS-DOTA(Gd)的電勢粒徑測試圖；其中，(a)為zeta電勢和水合粒徑值的表格;(b)為水合粒徑值的分布圖；
[0032]圖5為實施例2中PP1-MAL DS-DOTA(Gd)的1^弛豫時間倒數(shù)與Gd濃度的線性關(guān)系圖；其中，(a)為PP1-MAL DS-DOTA(Gd)在釓濃度為0.05-0.加權(quán)MR成像；(b)為PP1-MAL DS-DOTA(Gd)在釓濃度為0.05-0.Smi^T1加權(quán)MR成像對應(yīng)的偽彩圖；(c)為PP1-MALDS-DOTA(Gd)的!^弛豫時間倒數(shù)與Gd濃度的線性關(guān)系圖；
[0033]圖6為實施例3中PP1-MAL DS-DOTA(Gd)的在釓濃度為10_600yg/mL下溶血實驗結(jié)果;
[0034]圖7為實施例4中MTT法測得U87細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照WPPP1-MAL DS-DOTA(Gd)在不同釓濃度(0.2-100yg/mL)下處理24小時后的細(xì)胞存活率；
[0035]圖8為實施例4中U87細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照WPPP1-MAL DS-DOTA(Gd)在不同釓濃度(0.2-100yg/mL)下處理24小時后的相差顯微鏡圖像;a-k分別對應(yīng)著PP1-MAL DS-DOTA(6(1)濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.(^]\1;
[0036]圖9為實施例5中U87細(xì)胞經(jīng)過I3BS緩沖液和PP1-MAL DS-DOTA(Gd)在釓濃度為O、10、40μΜ時處理4小時后的細(xì)胞吞噬材料的Gd含量；
[0037]圖10為實施例6中U87細(xì)胞經(jīng)過I3BS緩沖液和PP1-MAL DS-DOTA(Gd)在不同釓濃度下處理4小時后的1^加權(quán)MR成像圖(a) ;U87細(xì)胞經(jīng)過I3BS緩沖液和PP1-MAL DS-DOTA(Gd)在不同釓濃度下處理4小時后的1^加權(quán)MR成像的偽彩圖(b);以及U87細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液和PP1-MAL DS-DOTA(Gd)在不同釓濃度下處理4小時后的1^加權(quán)MR成像信號值的柱狀圖(c);
[0038]圖11為實施例7中尾靜脈注射本發(fā)明制備得到的PP1-MAL DS-DOTA(Gd) (Gd: 200μg)后不同時間點小鼠主動脈、腎動脈的TdP權(quán)MR成像圖片；
[0039]圖12為實施例7中尾靜脈注射本發(fā)明制備得到的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(Gd:200μg)后不同時間點小鼠腎臟部位的!^加權(quán)MR成像圖片；
[0040]圖13為實施例7中尾靜脈注射本發(fā)明制備得到的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(Gd:200μg)后不同時間點小鼠膀胱的T1加權(quán)MR成像圖片；
[0041 ] 圖14為實施例7中尾靜脈注射本發(fā)明制備得到的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(Gd:200μg)后不同時間點小鼠腎臟部位和膀胱的!^加權(quán)MR成像圖片的MR信號值變化柱狀圖；
[0042]圖15為實施例8中尾靜脈注射本發(fā)明制備得到的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(Gd:200μg)后不同時間點材料在各組織中的分布。
【具體實施方式】
[0043]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0044]實施例1
[0045]首先，分別稱量13mg的第四代PPI樹狀大分子和11.5mg的DOTA-NHS溶解在1mL和3mL的二甲亞砜(DMSO)溶劑中，待各自完全溶解后，邊攪拌的情況下將DOTA-NHS溶液逐滴加入到PPI溶液中，持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時得到中間產(chǎn)物PP1-D0TA。用截留分子量為1000的透析袋透析三天(PBS緩沖液中透析一天，換液3次;蒸餾水中透析2天，換水6次)，冷凍干燥，得到干燥的PP1-D0TA;然后分別稱取PP1-D0TA0.2g、D-( + )_麥芽糖29.48g以及5mL的甲硼烷-吡啶(SM)溶于37.5mL的硼酸緩沖溶液(硼酸鈉的濃度為0.1M)中。將混合物在50°C條件下攪拌7天，得到產(chǎn)物PP1-MAL DS-D0TA。將粗產(chǎn)物用截留分子量為1000透析袋透析三天(PBS緩沖液中透析一天，換液3次;蒸餾水中透析2天，換水6次)，冷凍干燥;最后將得到的產(chǎn)物溶解于超純水中，加入硝酸釓(硝酸釓與DOTA的摩爾比為5:1)后攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為1000透析袋透析三天(PBS緩沖液中透析一天，換液3次;蒸餾水中透析2天，換水6次)，冷凍干燥得到最終產(chǎn)物PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(如圖1所示)。
[0046]實施例2
[0047]將本發(fā)明制備的PP1-D0TA(實施例1)進(jìn)行碳譜分析(如圖2所示)，PPI_MALDS-D0TA(實施例1)進(jìn)行氫譜分析(如圖3所示)，PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(實施例1)的水溶液進(jìn)行電勢粒徑測試(如圖4所示)，并通過ICP-AES測試法測得溶液中Gd元素的濃度，再用超純水配制Gd濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的水溶液ImL，測定不同Gd濃度下的1^弛豫時間和T1W權(quán)成像(如圖5所示)。碳譜中標(biāo)記的兩個特征峰可歸位到DOTA上的碳原子，170.4nm處的化學(xué)位移更是證明了DOTA與PPI間形成了酰胺鍵，DOTA成功地連接到了PPI樹狀大分子上;并將產(chǎn)物中的氫進(jìn)行了歸屬，經(jīng)計算得平均每個PPI分子接上了 9個DOTA基團(tuán)。DOTA的質(zhì)子峰(a' ,V和Y )未在氫譜上單獨顯現(xiàn)出來，原因有兩個:與ΡΡΙ、麥芽糖的質(zhì)子峰相重合;因為溶解在D2O中的緣故，DOTA被去質(zhì)子化而不能在氫譜上顯現(xiàn)。氫譜結(jié)果表明，麥芽糖成功地連接到了PPI樹狀大分子，并對各特征峰進(jìn)行了歸位。最終形成的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)水合粒徑為502.33nm，粒徑分布均勻，其zeta電勢為21.7mV，說明乙?；驪PI電勢有所降低，低電勢為接下來的體內(nèi)外實驗低的細(xì)胞毒性提供了保障。η弛豫率反映PP1-MAL DS-D0TA(Gd)造影劑作為MRI造影劑的效率，為單位摩爾濃度釓的縱向弛豫時間，可通過不同濃度下的!^弛豫時間的倒數(shù)擬合計算得到。弛豫率測試結(jié)果表明PP1-MAL DS-DOTA(Gd)的!^弛豫時間倒數(shù)在Gd濃度為0.1-1.6mM范圍內(nèi)隨著釓濃度的增加具有很好的線性關(guān)系(圖5(c))。并且通過計算可知PP1-MAL DS-DOTA(Gd)的^弛豫率為10.2mM—V1，與第五代PAMAM-Gd樹狀大分子(4.84mM—1)相對，具有更高好的ri弛豫率。同時Ti加權(quán)成像也顯示材料隨釓濃度的提高，信號強(qiáng)度增強(qiáng)。分析原因可知:1.PPI樹狀大分子子每個末端氨基被兩個麥芽糖修飾，限制地限制了 PPI的分子翻轉(zhuǎn)，延長了旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間；2.麥芽糖所帶羥基使得造影劑分子間分子內(nèi)可形成氫鍵，大大延長了與配位水的交換時間。因此，本發(fā)明所制備的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)可作為MRI分子影像診斷中的優(yōu)良!^信號增強(qiáng)造影劑。圖5(a)和(b)是本發(fā)明制備得到的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)材料的TI加權(quán)MR成像性能測試以及轉(zhuǎn)化過后的偽彩圖，從圖中可以看出隨著釓濃度(0.05-0.8mM)的提高，MRI信號逐漸增強(qiáng)，并且呈良好的梯度關(guān)系。結(jié)果說明制備得到的材料具有良好的MRI信號增強(qiáng)造影劑應(yīng)用潛質(zhì)。
[0048]實施例3
[0049]由于造影劑的給藥途徑多數(shù)情況下是經(jīng)由靜脈注射方式進(jìn)入人體內(nèi)的。因此，造影劑勢必會與血液直接接觸。為了確保本發(fā)明制備的造影劑能安全地用于體內(nèi)生物成像診斷，評價了制備得到的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(實施例1)的血液相容性。稱取PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(實施例1)1.91mg，分散于318微升PBS緩沖液中配制成6mg/mL的濃度并作為母液，然后用？83緩沖液依次配制濃度為10(^8/1^、20(^8/1^、50(^8/1^、100(^8/1^、200(^8/1^和4000yg/mL的溶液。取適量的人新鮮血液，首先離心(2000rpm，5分鐘)去上清液，然后將血紅細(xì)胞用PBS洗滌5次，收集健康的紅細(xì)胞并用PBS緩沖液稀釋10倍。再將PP1-MAL DS-DOTA(Gd)與紅細(xì)胞混合靜置2小時后，1000rpm離心I分鐘，拍照并測上清液的紫外吸收值。該過程以超純水作為陽性對照，PBS緩沖液作為陰性對照，結(jié)果顯示陽性對照組(水)完全溶血，陰性對照組(PBS緩沖液)、實驗組并未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。圖6中顯示了PP1-MAL DS_DOTA(Gd)在濃度 I Oyg/mL、20yg/ mL、50yg/mL、I OOyg/mL、200yg/mL、400yg/mL 和 600yg/mL 下的溶血率測試結(jié)果。此外，通過測定上層清液中血紅蛋白在541nm的吸光值來定量分析本發(fā)明制備材料的溶血率。如圖6下方柱狀圖顯示，在濃度達(dá)到600yg/mL時，PP1-MAL DS-DOTA(Gd)的溶血率依舊小于5%，離心液體澄清，無溶血現(xiàn)象。說明制備的這種材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物體內(nèi)MR成像。
[0050] 實施例4
[0051 ] 通過MTT比色法，以U87細(xì)胞為模型細(xì)胞評價本發(fā)明制備的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)對細(xì)胞存活的影響。稱取相應(yīng)重量的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(實施例1)1.86mg，分散在無菌PBS緩沖中配制成釓離子濃度為ImM的PBS緩沖液，并用紫外照射過夜殺菌。然后在超凈工作臺中用無菌?85緩沖配制濃度為2、4、8、10、25、50、100、250、500、100(^]\1的？？1-嫩1^ DS-DOTA(Gd)溶液。U87細(xì)胞種植于96孔板后分別與PP1-MAL DS-DOTA(Gd)在37°C下共培養(yǎng)24小時。然后，向培養(yǎng)板孔中加入20yL MTT，繼續(xù)在37 0C下培養(yǎng)4小時后，棄去培養(yǎng)液，并加入10yLDMSO，振蕩20分鐘后在570nm處測量吸光值，并根據(jù)此值計算細(xì)胞的活力(以PBS緩沖液組的吸收值為基準(zhǔn)，不同濃度的材料處理后的吸收值與之相比計算得到U87細(xì)胞的存活率，如圖7)。與對照組(PBS緩沖液組)相比，PP1-MAL DS-DOTA(Gd)在實驗濃度O到ΙΟΟμΜ范圍內(nèi)對U87細(xì)胞的存活率沒有顯著性差異，細(xì)胞存活率都在80%以上，O到50μΜ范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率均在85%以上，至最高濃度時細(xì)胞存活率也達(dá)83.26%。并且對應(yīng)的相差結(jié)果也表明(如圖8)，在材料濃度為ΙΟΟμΜ時，U87細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整。這充分說明合成的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)具有良好的細(xì)胞相容性，可以應(yīng)用到生物體內(nèi)MRI成像檢測。
[0052]實施例5
[0053]以每孔5Χ 15個U87MG細(xì)胞的濃度種于6孔板，共9孔，每三個為以平行，PP1-MALDS-DOTA(Gd)終濃度分別設(shè)為0、10、40μΜ。種板過夜后，棄去原有培養(yǎng)架，將細(xì)胞與含有PP1-MAL DS-DOTA(Gd)的新鮮培養(yǎng)基在37°C下共培養(yǎng)4小時(以I3BS緩沖液處理的細(xì)胞作為對照組)，培養(yǎng)結(jié)束后細(xì)胞用PBS緩沖液洗3次，再胰酶消化、離心、過濾，最后分散在ImL PBS緩沖液中。而后用ICP-AES測量每個樣品中Gd的濃度。如圖9所示，隨著Gd濃度的提高，PP1-MALDS-DOTA(Gd)處理后的細(xì)胞均吞噬量也增加，當(dāng)濃度由10μΜ上升到40μΜ時，材料吞噬量增加了兩倍。
[0054]實施例6
[0055]在體內(nèi)成像實驗之前，評價造影劑的細(xì)胞MR成像效果，通過ICP-AES測定實施例1中PP1-MAL DS-DOTA(Gd)中的釓元素含量。用無菌I3BS緩沖液分別配制成Gd濃度為0.5、1、2和4μΜ的材料溶液。U87MG細(xì)胞以I X 16/孔種植于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)過夜后，分別與PBS和PP1-MAL DS-DOTA(Gd)在37°C下共培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)結(jié)束后細(xì)胞用PBS緩沖液洗3次，再胰酶消化、離心、過濾，最后分散在ImL PBS緩沖液中。用核磁共振成像儀測試各細(xì)胞樣品的TdP權(quán)成像以及對應(yīng)的偽彩圖(如圖1O (a)和(b))。如圖所示，隨著Gd濃度的增加，PP1-MALDS-DOTA(Gd)處理后的細(xì)胞均表現(xiàn)出MR信號增強(qiáng)的趨勢，說明隨著Gd濃度的增加，細(xì)胞對材料的吞噬量也增加。需要指出的是，圖10(c)是U87細(xì)胞被不同濃度的造影劑處理后的MR成像信號值，從圖中明顯看出，隨著Gd濃度的增加，細(xì)胞樣品的MR信號值依次為10.24、11.95、12.81、13.57、16.42，也成依次遞增的趨勢，與前面材料吞噬實驗很好地相吻合，這些結(jié)果說明制備的材料不僅可以被U87MG細(xì)胞所吞噬，并且吞噬后依舊具有很好的細(xì)胞MR成像效果O
[0056]實施例7
[0057]將本發(fā)明制備的PP1-MAL DS-DOTA (Gd)(實施例1)按照ICP-AES測定的釓濃度配置成lmg/mL的0.5mL PBS緩沖液。通過尾靜脈每只小鼠注射PP1-MAL DS-DOTA(Gd)的I3BS溶液200yL來評價MR成像效果(如圖11、12和13)。注射后5分鐘，主動脈以及腎動脈信號值明顯增強(qiáng)，并且可以在圖11中可被明顯分辨出來，直到注射后30min信號才開始減弱，說明制備發(fā)明的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(實施例1)具有良好的主動脈以及腎動脈MR血池造影效果。與注射前相比較，在注射后5分鐘到2小時內(nèi)，小鼠的心臟、肝臟、腎臟、以及膀胱顯著，隨著時間的推移，腎臟的腎盂部位開始變亮，表明材料開始通過腎臟代謝。對于腎臟，材料注射后即表現(xiàn)出高信號值，而且隨著時間的推移，腎盂部分信號值逐漸增強(qiáng)，表明材料經(jīng)由腎臟開始代謝(圖12)，這也由膀胱信號值的變化得到證實(圖13)。圖14是相應(yīng)注射時間的小鼠腎臟和膀胱MR信號值變化，可看到腎臟的信號值盡管有下降的趨勢，但是一直維持在一個很高的水平，而膀胱的信號值卻是在注射后的30min開始顯著提高，這與圖13很好地相吻合。這些結(jié)果說明該制備的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)造影劑可以用于體內(nèi)小鼠主動脈、腎動脈的血池造影，并且能夠通過腎臟代謝出體外。
[0058]實施例8
[0059]將本發(fā)明制備的PP1-MAL DS-DOTA(Gd)(實施例1)按照ICP-AES測定的釓濃度配置成lmg/mL的0.5mL PBS緩沖液。通過尾靜脈每只小鼠注射PP1-MAL DS-DOTA(Gd)的I3BS溶液200yL。在注射PP1-MAL DS-DOTA(Gd)造影劑2、4、12、24、48小時后，處死小鼠，解剖取出心、肝、脾、肺、腎并稱重，然后用王水消化48小時以上，取消化液用于ICP-AES分析金屬元素釓的含量，從而確定在注射PP1-MAL DS-DOTA(Gd)造影劑在不同時間點在小鼠體內(nèi)各個臟器的分布情況(如圖15)。從圖中可以看出在注射PP1-MAL DS-DOTA(Gd)后，肝、脾、腎中釓元素含量較高，而心臟一直是在10yg/g—下。肺對于IL的吞■量一次為98.lyg/g(4h)，68.2yg/g(8h)，23.3yg/g(12h)，3.2yg/g(24h)，逐漸降低。注射后的第12小時，腎的吞噬量達(dá)到最高，為51.lyg/g，而其他器官則是在第12小時都開始下降。在注射材料48小時后，各組織的釓含量基本都降至原始濃度，說明本發(fā)明制備的造影劑能在小鼠體內(nèi)正常代謝清除。
【主權(quán)項】
1.一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，包括: (1)在攪拌條件下，將I，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸-N-羥基丁二酰亞胺DOTA-NHS溶液滴加到PPI溶液中，攪拌反應(yīng)20?24小時，透析，冷凍干燥，得到PP1-DOTA; (2)將步驟(I)中的PP1-D0TA、D-(+ )_麥芽糖與甲硼烷-吡啶溶于硼酸緩沖溶液中，50°C條件下攪拌7天，透析，冷凍干燥，得到PP1-MAL DS-DOTA； (3)將步驟(2)中的PP1-MALDS-DOTA溶于超純水中，加入硝酸釓，攪拌反應(yīng)20-30小時，透析，冷凍干燥，得到麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑，S卩PP1-MAL DS-DOTA(Gd)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中DOTA-NHS溶液和PPI溶液的溶劑為DMSO。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中參加反應(yīng)的PPI與DOTA-NHS的摩爾比為I: 20。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中麥芽糖與PPI的摩爾比為5:1-7:1。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中甲硼烷-吡啶濃度為SM;硼酸緩沖溶液中硼酸鈉的濃度為0.1M。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中硝酸釓與PP1-MAL DS-DOTA中DOTA的摩爾比為5:1-10:1。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種麥芽糖修飾的釓基螯合物MR造影劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)、步驟(2)和步驟(3)中透析的條件為:截留分子量為1000的透析袋透析三天。
【文檔編號】A61K49/12GK105963718SQ201610274515
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】史向陽, 熊智娟, 朱靜怡, 夏進(jìn)東, 王玥
【申請人】東華大學(xué), 上海市松江區(qū)中心醫(yī)院